Rattenverbrennungsmodell zur Untersuchung der thermischen Verbrennung und Infektion der Haut in voller Dicke

Zusammenfassung

Ein Modell, das das klinische Szenario von Verbrennungsverletzungen und -infektionen nachahmt, ist notwendig, um die Verbrennungsforschung voranzutreiben. Das vorliegende Protokoll demonstriert ein einfaches und reproduzierbares Modell für Rattenverbrennungen, das mit dem beim Menschen vergleichbar ist. Dies erleichtert die Untersuchung von Verbrennungen und Infektionen nach Verbrennungen für die Entwicklung neuer topischer Antibiotika-Behandlungen.

Zusammenfassung

Verbrennungsinduktionsmethoden sind in Rattenmodellen uneinheitlich beschrieben. Ein einheitliches Brandwundmodell, das das klinische Szenario darstellt, ist notwendig, um eine reproduzierbare Verbrennungsforschung durchzuführen. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einfache und reproduzierbare Methode, um bei Ratten Verbrennungen mit ~20% Gesamtkörperoberfläche (TBSA) in voller Dicke zu erzeugen. Hier wurde ein 22,89 cm² (5,4 cm Durchmesser) großer Kupferstab, der in einem Wasserbad auf 97 °C erhitzt wurde, auf die Hautoberfläche der Ratte aufgebracht, um die Brandverletzung zu induzieren. Ein Kupferstab mit einer hohen Wärmeleitfähigkeit war in der Lage, die Wärme tiefer im Hautgewebe abzuleiten, um eine Verbrennung in voller Dicke zu erzeugen. Die histologische Analyse zeigt eine abgeschwächte Epidermis mit koagulativer Schädigung der gesamten Dicke der Dermis und des Unterhautgewebes. Darüber hinaus ist dieses Modell repräsentativ für die klinischen Situationen, die bei hospitalisierten Verbrennungspatienten nach Verbrennungsverletzungen wie Immundysregulation und bakteriellen Infektionen beobachtet werden. Das Modell kann die systemische bakterielle Infektion sowohl durch grampositive als auch durch gramnegative Bakterien rekapitulieren. Zusammenfassend stellt dieses Papier ein leicht zu erlernendes und robustes Rattenverbrennungsmodell vor, das die klinischen Situationen, einschließlich Immundysregulation und bakterieller Infektionen, nachahmt, was für die Entwicklung neuer topischer Antibiotika gegen Brandwunden und Infektionen von erheblichem Nutzen ist.

Einleitung

Brandverletzungen gehören zu den verheerendsten Formen von Traumata, wobei die Sterblichkeitsrate selbst in spezialisierten Verbrennungszentren 12% erreicht ^1,2,3. Laut kürzlich veröffentlichten Berichten benötigen in den Vereinigten Staaten jährlich ~486.000 Verbrennungspatienten medizinische Versorgung, mit fast 3.500 Todesfällen 1,2,3,4,5,6. Verbrennungen stellen eine große Herausforderung für das Immunsystem der Patienten dar und verursachen eine signifikante offene Wunde, die nur langsam heilt und sie anfällig für kutane, pulmonale und systemische Besiedlung mit nosokomialen, opportunistischen Bakterien macht. Eine Immundysregulation in Kombination mit der bakteriellen Infektion ist mit einer erhöhten Morbidität und Mortalität bei Verbrennungspatienten verbunden⁷.

Ein Verbrennungs- und Infektionsmodell für Tiere ist unerlässlich, um die Pathogenese bakterieller Infektionen nach Hautschäden und Immunsuppression im Zusammenhang mit Verbrennungstraumata zu untersuchen. Solche Modelle ermöglichen die Entwicklung und Evaluierung neuer Methoden zur Behandlung bakterieller Infektionen bei Verbrennungspatienten. Ratten und Menschen haben ähnliche hautphysiologische und pathologische Merkmale, die bereits dokumentiert wurden⁸. Darüber hinaus sind Ratten kleiner, wodurch sie einfacher zu handhaben, erschwinglicher und einfacher zu beschaffen und zu warten sind als größere Tiermodelle.

Diese Eigenschaften machen Ratten zu einem idealen Modelltier, um Verbrennungen und Infektionen zu untersuchen⁹. Leider ist die Technik zur Verbrennungsinduktion inkonsistent und oft minimal beschrieben 10,11,12,13,14. Das vorliegende Protokoll wurde entwickelt, um ein einfaches, kostengünstiges und reproduzierbares Verfahren zur Erzeugung einer konsistenten Verbrennungsverletzung in voller Dicke in einem Rattenmodell zu entwickeln, das das klinische Szenario simuliert und zur Bewertung der Immunsuppression und der bakteriellen Infektion verwendet werden kann.

Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of North Carolina genehmigt und in Übereinstimmung mit den festgelegten Richtlinien durchgeführt. Für die Experimente wurden männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten (250-300 g) im Alter von 7-9 Wochen verwendet. Alle Tiere wurden in einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 h:12 h mit freiem Zugang zu Futter und Wasser ad libitum untergebracht. Arbeiten Sie vor Beginn der Studie immer mit Ihrem institutionellen Tierarzt über einen analgetischen Plan.

1. Vorbereitung von Ratten auf die Brandverletzung

1. Bereiten Sie die Tiere 24 Stunden vor der Verbrennung auf Brandverletzungen vor.
2. Betäuben Sie die Ratte mit 5% Isofluran in 100% Sauerstoff in einer Induktionskammer für 5 min (Flussrate: 2 l/min), bis sich die Atmung verlangsamt hat.
3. Sobald die Ratte tief betäubt ist (nicht mehr auf das Einklemmen der Zehen an allen Gliedmaßen reagiert), bewegen Sie die Ratte in Bauchlage auf ein Heizkissen und reduzieren Sie das Isofluran auf 1,5% Sauerstoff zur Aufrechterhaltung durch einen Nasenkegel.
4. Um ein Austrocknen der Hornhaut nach der Anästhesie und während des Eingriffs zu verhindern, tragen Sie mit einem Applikator mit Wattespitze Augenschmiermittel auf die Hornhaut beider Augen auf.
5. Rasieren Sie den Rückenbereich der Ratte mit einer elektrischen Haarschneidemaschine (siehe Materialtabelle) und entfernen Sie so viele Haare wie möglich in einem großen Rechteck von den Schulterblättern bis zum Schwanzansatz (Abbildung 2A).
6. Reinigen Sie den rasierten Bereich mit einem in Kochsalzlösung getränkten Taschentuch, um die losen Haare abzuwischen. Tragen Sie die Haarentfernungslotion mit einem Applikator mit Wattespitze auf die rasierte Stelle auf und lassen Sie sie ~3 Minuten einwirken.
   HINWEIS: Das Auftragen der genannten Haarentfernungslotion für mehr als 3 Minuten führt zu roten Hautausschlägen.
7. Wischen Sie den Bereich zweimal mit einem feuchten Mullschwamm ab, um die Lotion zu entfernen und Hautreizungen zu vermeiden.
8. Schalten Sie das Isofluran aus, entfernen Sie den Nasenkegel und legen Sie die Ratte in den Auffangkäfig.
   HINWEIS: Legen Sie ein Heizkissen in den Auffangkäfig.
9. Bringen Sie das geborgene Tier für den Verbrennungsvorgang am nächsten Tag in einen sauberen Käfig (es kann ~10-15 Minuten dauern, bis sich die Ratte von der Narkose erholt hat).

2. Induktion der Verbrennungsverletzung bei Ratten

1. Stellen Sie am Tag der Verbrennung die Wasserbadtemperatur auf 97 °C ein und platzieren Sie alle vier Kupferstäbe (je 420 g; Abbildung 1) Im Wasserbad 1 h vor dem Brennexperiment die Stäbchen gleichmäßig erwärmen zu lassen.
   HINWEIS: Die Ruten müssen in das Wasser getaucht werden. Überprüfen Sie vor dem Experiment die Genauigkeit der digitalen Temperaturanzeige mit einem Thermometer.
2. Betäuben Sie die Ratte wie in Abschnitt 1 erwähnt.
3. Sobald die Ratte nicht mehr auf das Einklemmen der Zehen an allen Gliedmaßen reagiert, legen Sie sie auf ein Heizkissen in Bauchlage mit 1,5% Isofluran in Sauerstoff zur Wartung (Abbildung 2A).
4. Injizieren Sie Morphin (20 mg/kg Körpergewicht) über den intraperitonealen (i.p.) Weg zur Schmerzbehandlung⁶.
5. Überprüfen Sie die Temperatur des Wassers im Wasserbad. Stellen Sie den Timer ein und ziehen Sie die hitzebeständigen Handschuhe an.
6. Nehmen Sie einen erhitzten Kupferstab aus dem Wasserbad und berühren Sie ihn 7 s lang auf dem Rückenbereich der Ratte, um die Verbrennung auszulösen.
   HINWEIS: Halten Sie einen Mindestabstand (10-15 cm) zwischen dem Wasserbad und dem Tier ein, um den Wärmeverlust zu minimieren, und üben Sie keinen Druck auf die Stäbe aus, während Sie die Verbrennung auslösen (d. h. der Kontakt muss durch die Schwerkraft aufrechterhalten werden).
7. Wenden Sie vier Verbrennungen mit einem Stab pro Verbrennungsstelle unmittelbar nacheinander an, um eine TBSA-Vollkontaktverbrennung von etwa 20 % zu erzeugen (Abbildung 2B).
8. Nach der Verbrennung wird das Tier durch i.p. Injektion von laktierter Ringer-Lösung (0,1 ml/g Körpergewicht) wiederbelebt.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine an die Körpertemperatur angepasste laktierte Ringerlösung, um die Ratten wiederzubeleben.
9. Schalten Sie das Isofluran aus, entfernen Sie den Nasenkegel und legen Sie die Ratte zur Erholung auf die Heizmatte.

3. Vorbereitung des bakteriellen Inokulums und der Infektion

1. Streifen Sie die gefrorene Probe von Pseudomonas aeruginosa PAO1 und Staphylococcus aureus ATCC25923 auf Muller-Hinton-Agar (MHA)-Platten, 2 Tage vor dem Verbrennungsexperiment.
2. Wählen Sie am nächsten Tag eine einzelne Kolonie gewachsener Bakterien vom Teller aus und kratzen Sie sie mit einer Impfschleife leicht vom Teller ab. Geben Sie es dann in das Kulturröhrchen, um 10 ml Müller-Hinton-Bouillon (MHB) zu beimpfen und über Nacht bei 37 °C in einem Inkubatorschüttler zu kultivieren.
3. Am Tag der Verbrennung und Infektion die Kultur 5 Minuten lang bei 4.000 × g zentrifugieren. Waschen Sie das Pellet mit normaler Kochsalzlösung (0,9% NaCl-Lösung).
4. Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in Kochsalzlösung und verdünnen Sie es auf 0,1 OD 600 nm (optische Dichte bei_{600 nm} ). Verdünnen Sie das bakterielle Inokulum, indem Sie 200 μl dieser Bakteriensuspension nehmen und mit 800 μl Kochsalzlösung mischen, um das gewünschte bakterielle Inokulum von 2 × 10⁷ KBE/ml zu erhalten.
5. Injizieren Sie 15 Minuten nach der Verbrennung 50 μl des im vorherigen Schritt vorbereiteten Inokulums von P. aeruginosa oder S. aureu(Infektionsdosis 1 ×^{10 6} KBE) in die anästhesierte Ratte mit einer 29-G-Nadel subkutan so nah wie möglich an der Brandwunde.
6. Nachdem Sie die Brandwunde infiziert haben, legen Sie die Ratte zur Genesung auf das Heizkissen. Sobald sich das Tier erholt hat (~15-20 min), bringen Sie es in einen sauberen Käfig.
   HINWEIS: Bringen Sie nach der Brandverletzung eine Ratte pro Käfig unter. Verwenden Sie Wasser-Nassfutterpellets zum einfachen Kauen und legen Sie sie leicht erreichbar auf den Käfigboden.
7. Füllen Sie die Wasserflaschen im Käfig mit Morphinwasser (0,4 mg/ml) zur Schmerzbehandlung.
   HINWEIS: Orales Morphin spiegelt die klinische Situation bei Patienten mit menschlichen Verbrennungen wider. In dieser Studie wurde orales Morphin verwendet, um diese Experimente nach mehrfacher Rücksprache mit dem Veterinärpersonal mit menschlichen Verbrennungspatienten vergleichbar zu halten. Trink- und Gewichtsprotokolle wurden während des gesamten Experiments geführt. Verwenden Sie bei allen Eingriffen das gleiche Trinksystem. Andere Analgetika, wie z. B. Buprenorphin, können gemäß den Richtlinien der institutionellen Tierpflege subkutan/intraperitoneal verabreicht werden.
8. Füllen Sie die Checkliste für die Überwachung aus und überwachen Sie die Tiere während der gesamten Dauer des Versuchs genau auf Stress oder Krankheit.

4. Beurteilung der Brandverletzung

1. Bewerten Sie die Hautverbrennungsverletzung unmittelbar nach der Brandverletzung morphologisch in Bezug auf Farbe und Rand.
2. Färben Sie die verbrannte Haut mit Hämatoxylin und Eosin (H & E), um die Brandwundenstruktur und den Epithelspalt¹⁵ sichtbar zu machen (siehe Schritt 5.6 für die Probenverarbeitung).

5. Nachbearbeitung von Rattenproben und bakterielle Zählung

1. Euthanasieren Sie die Ratte 24, 48 und 72 Stunden nach der Verbrennung mit einer Überdosis Anästhesie.
2. Entnehmen Sie den Ratten Blutproben per Herzpunktion und sammeln Sie sie in einem Mini-Sammelröhrchen.
   1. Analysieren Sie das vollständige Blutbild aus den Blutproben, um die Wirkung der Verbrennungsinduktion auf das Immunsystem des Wirts zu bestimmen.
3. Ernten Sie Haut, Unterhautgewebe, Muskeln, Lunge und Milz zum Zeitpunkt der Euthanasie.
   HINWEIS: Bewahren Sie einen Teil (~1 cm × 1 cm; mit einem Gewicht von ~ 200-300 mg) der Haut für die H & E-Färbung und einen anderen Teil für die Bakterienzählung auf.
4. Sammeln Sie die Gewebe in einem 10-ml-Sammelröhrchen und legen Sie sie zur Bakterienzählung in normale Kochsalzlösung auf Eis.
5. Normalisieren Sie das Gewebegewicht mit normaler Kochsalzlösung und homogenisieren Sie die Proben mit einem Gewebehomogenisator (siehe Materialtabelle).
   1. Verdünnen Sie die Gewebehomogenate seriell in normaler Kochsalzlösung.
   2. Platte 100 μl unverdünntes Homogenat und alle Verdünnungen jeder Gewebeprobe auf Cetrimid-Agar-Platten für Proben, die von Ratten entnommen wurden, die mit P. aeruginosa infiziert waren.
      HINWEIS: Verwenden Sie Mannitol-Agar-Platten zum Plattieren von Proben, die von Ratten gesammelt wurden, die mit S. aureus infiziert waren.
   3. Die Platten werden bei 37 °C in einem Inkubator für 16-18 h inkubiert.
   4. Zählen Sie am nächsten Tag die Bakterienkolonien auf den Platten, multiplizieren Sie sie mit dem Verdünnungsverhältnis, um die KBE/ml-Zahl zu erhalten, und normalisieren Sie sie mit dem Gewicht des Gewebes, um das KBE/g-Gewebe zu berechnen.
   5. Verwenden Sie Datenanalysesoftware, um die Bakterienzahlen in verschiedenen Organen zu den verschiedenen Probenahmezeitpunkten aufzuzeichnen.
6. Führen Sie eine H & E-Färbung der verbrannten Haut durch, um die Wundstruktur und den Epithelspalt sichtbar zu machen.
   1. Schneiden Sie mit einer Schere und einer Zahnzange ein Hautpflaster von 1 cm x 1 cm aus der Brandstelle ab und tauchen Sie es 48 h bei Raumtemperatur in ein Fixiermittel (10% neutral gepuffertes Formalin, NBF).
      HINWEIS: Schwenken Sie den Behälter, um sicherzustellen, dass alle Gewebe vollständig in das Fixiermittel eingetaucht sind, wobei das Volumen des Fixiermittels das 30-fache des Gewebevolumens beträgt.
   2. Dehydrieren Sie das Hautgewebe mit 70% (v/v) Ethanol für 72 h bei Raumtemperatur.
   3. Verarbeiten Sie die dehydrierten Proben in Paraffinblöcken, um die Schnitte zu schneiden und mit H & E¹⁵ zu färben.
   4. Bilden Sie die gefärbten Objektträger in einem Objektträgerscanner (siehe Materialtabelle) mit einem 40-fachen Objektiv digital ab.
   5. Analysieren Sie das gescannte Bild mit Hilfe einer Software (siehe Ergänzungsdatei 1 für die Verarbeitung des Bildes für die Analyse; siehe Materialtabelle).
   6. Untersuchen Sie alle Felder des gefärbten Hautschnitts, um den Zustand der Epidermis, der Dermis, des Unterhautgewebes und der Skelettmuskulatur zu beurteilen.

Ergebnisse

Das hier vorgestellte Protokoll ist hochgradig reproduzierbar und führte bei Ratten zu einer Brandverletzung dritten Grades in voller Dicke. Die Brandwunde erscheint nach der Verbrennungsinduktion wachsweiß (Abbildung 2B). Die Farbe der Brandverletzung änderte sich im Laufe von 72 Stunden nach der Verbrennung von weiß nach braun (Abbildung 2B-E).

Die histologische Analyse bestätigte eine Verbrenn...

Diskussion

Es wurden mehrere Verbrennungsmodelle vorgestellt, um die Pathophysiologie von Verbrennungsverletzungen^{zu untersuchen} 8,12,16,17. In der vorliegenden Studie haben wir ein Rattenmodell verwendet, um ein einfaches und reproduzierbares Protokoll zu entwickeln, um eine Verbrennung in voller Dicke zu induzieren, gefolgt von einer bakteriellen Infektion, um ein infiziertes Verbrennungstrauma bei Pati...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD, USA	309597	Used to inject the analgesic
1.7 mL Microtube	Olympus, USA	24-282	Used to carry morphine
10% NBF	VWR, USA	16004-115	Used to fix the skin piece for staining
30 mL syringe	BD, USA	302832	Used to inject the lactate ringer solution
70% ethyl alcohol	Fischer Scientific, USA	BP28184
Aperio AT2 Digital Pathology  Slide Scanner with ImageScope software	Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA	n/a	Scanning of H & E slides and analysis
Cetrimide agar plates	BD, USA	285420	Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth
Copper rods	n/a	n/a	Used to induce the burn injury
Cotton tipped applicators	OMEGA Surgical supply, USA	4225-IMC	Used to apply eye ointment
Electric shaver	Oster, USA	Golden A5	Used to remove the dorsal side hairs
Eye lube	Dechra, UK	n/a	The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness
Fluff filled underpads	Medline, USA	MSC281225	Used in the burn procedure
Forcep	F.S.T.	11027-12	Used to hold the skin piece
Gauze sponges	Oasis, USA	PK412	Used to clean the applied nair cream from the dorsal side
Heat-resistant gloves	n/a	n/a	Used to hold the heated copper rods
Hematology Analyzer	IDEXX laboratories, USA	ProCyte Dx
Induction chamber	Kent Scientific, USA	vetFlo-0730	Used to anesthesize the animals
Insulin syringe	BD, USA	329461
Isoflurane	Pivetal, USA	NDC46066-755-04	Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness
Isoflurane vaporiser	n/a	n/a
Lactated ringer's solution	icumedical, USA	NDC0990-7953-09	Used to resuscitate the rats
L-shaped spreader	Fischer Scientific, USA	14-665-230
Mannitol Agar	BD, USA	211407	Selective media plates for Staphylococcus aureus growth
Minicollect tubes (K2EDTA)	greiner bio-one, USA	450480	Used to collect the blood
Morphine	Mallinckrodt, UK	NDC0406-8003-30	This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain
Muller Hinton Broth	BD, USA	275730
Muller Hinton II Agar	BD, USA	211438
Nair hair removal lotion	Nair, USA	n/a	Used to remove the residual hairs on dorsal side
Needle 23 G	BD, USA	305193	Used to inject the lactate ringer solution
Normal saline	n/a	n/a
Spectrophotometer	ThermoScientific, USA	Genesys 30
Sprague-Dawley rats, male and female	Charles River Labs	n/a	7-9 weeks old for burn induction
Surgical Scissor	F.S.T.	14501-14	Used to cut the desired skin piece
Tissue collection tubes	Globe Scientific	220101236
Tissue Homogenizer	Kinematica, Inc, USA	POLYTRON PT2100	Used to homogenize the tissue samples
Water bath	Fischer Scientific, USA	n/a	Used to induce the burn injury
Weighted heating pad	Comfytemp, USA	n/a	Used during the procedure to keep rat's body warm