Modelo de quemadura de rata para estudiar la quemadura térmica cutánea de espesor total y la infección

Resumen

Un modelo que imite el escenario clínico de lesiones por quemaduras e infecciones es necesario para avanzar en la investigación de quemaduras. El presente protocolo demuestra un modelo simple y reproducible de infección por quemaduras de rata comparable al de los seres humanos. Esto facilita el estudio de quemaduras e infecciones después de quemaduras para desarrollar nuevos tratamientos antibióticos tópicos.

Resumen

Las metodologías de inducción de quemaduras se describen de manera inconsistente en modelos de ratas. Un modelo uniforme de herida por quemaduras, que representa el escenario clínico, es necesario para realizar investigaciones de quemaduras reproducibles. El presente protocolo describe un método simple y reproducible para crear ~ 20% de quemaduras de espesor total de superficie corporal (TBSA) en ratas. Aquí, se aplicó una varilla de cobre de 22,89^cm2 (5,4 cm de diámetro) calentada a 97 °C en un baño de agua a la superficie de la piel de la rata para inducir la lesión por quemadura. Una varilla de cobre con una alta conductividad térmica fue capaz de disipar el calor más profundamente en el tejido de la piel para crear una quemadura de espesor total. El análisis histológico muestra epidermis atenuada con daño coagulativo en la extensión de espesor total de la dermis y el tejido subcutáneo. Además, este modelo es representativo de las situaciones clínicas observadas en pacientes hospitalizados con quemaduras después de una lesión por quemadura, como la desregulación inmune y las infecciones bacterianas. El modelo puede recapitular la infección bacteriana sistémica por bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. En conclusión, este artículo presenta un modelo de quemadura de rata robusto y fácil de aprender que imita las situaciones clínicas, incluida la desregulación inmune y las infecciones bacterianas, que es de considerable utilidad para el desarrollo de nuevos antibióticos tópicos para quemaduras e infecciones.

Introducción

Las lesiones por quemaduras se encuentran entre las formas más devastadoras de trauma, con tasas de mortalidad que alcanzan el 12% incluso en centros especializados en quemaduras ^1,2,3. Según informes publicados recientemente, ~ 486,000 pacientes con quemaduras requieren atención médica anualmente en los Estados Unidos, con casi 3,500 muertes 1,2,3,4,5,6. La lesión por quemadura impone un gran desafío para el sistema inmunológico de los pacientes y crea una herida abierta significativa, que tarda en sanar, dejándolos susceptibles a la colonización cutánea, pulmonar y sistémica con bacterias nosocomiales y oportunistas. La desregulación inmune combinada con la infección bacteriana se asocia con mayor morbilidad y mortalidad en pacientes quemados⁷.

Un modelo de quemaduras e infecciones en animales es esencial para estudiar la patogénesis de las infecciones bacterianas después del daño de la piel y la supresión inmune asociada con el trauma por quemaduras. Tales modelos permiten el diseño y la evaluación de nuevos métodos para tratar infecciones bacterianas en pacientes con quemaduras. Las ratas y los humanos comparten características fisiológicas y patológicas similares a las de la piel que se han documentado previamente⁸. Además, las ratas son más pequeñas en tamaño, lo que las hace más fáciles de manejar, más asequibles y más fáciles de adquirir y mantener que los modelos animales más grandes.

Estas características hacen de las ratas un animal modelo ideal para estudiar quemaduras e infecciones⁹. Desafortunadamente, la técnica para la inducción de quemaduras es inconsistente y a menudo mínimamente descrita 10,11,12,13,14. El presente protocolo está diseñado para desarrollar un procedimiento simple, rentable y reproducible para crear una lesión por quemadura consistente de espesor total en un modelo de rata que simule el escenario clínico y pueda usarse para evaluar la supresión inmune y la infección bacteriana.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Carolina del Norte y se llevaron a cabo de acuerdo con sus pautas establecidas. Para los experimentos se utilizaron ratas Sprague Dawley macho y hembra (250-300 g) de 7 a 9 semanas de edad. Todos los animales fueron alojados en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h:12 h con libre acceso a alimentos y agua ad libitum. Siempre trabaje con su veterinario institucional sobre un plan analgésico antes del inicio del estudio.

1. Preparación de ratas para la lesión por quemadura

1. Preparar a los animales para lesiones por quemaduras 24 h antes de la quemadura.
2. Anestesiar a la rata con isoflurano al 5% en oxígeno al 100% en una cámara de inducción durante 5 min (caudal: 2 L/min) hasta que la respiración haya disminuido.
3. Una vez que la rata esté profundamente anestesiada (sin responder al pellizco del dedo del pie en todas las extremidades), mueva la rata a una almohadilla térmica en posición prona y reduzca el isoflurano al 1,5% en oxígeno para el mantenimiento a través de un cono nasal.
4. Para evitar el secado de la córnea después de la anestesia y durante el procedimiento, aplique lubricante ocular en las córneas de ambos ojos con un aplicador con punta de algodón.
5. Afeite el área dorsal de la rata con un cortapelos eléctrico (consulte la Tabla de materiales) y retire la mayor cantidad de pelo posible en un rectángulo grande desde los omóplatos hasta la base de la cola (Figura 2A).
6. Limpie el área afeitada con un pañuelo empapado en solución salina para limpiar los pelos sueltos. Aplique loción depilatoria en el área afeitada con un aplicador con punta de algodón y déjelo actuar durante ~ 3 minutos.
   NOTA: La aplicación de la loción depilatoria referenciada durante más de 3 minutos inducirá erupciones rojas en la piel.
7. Limpie el área con una esponja de gasa húmeda dos veces para quitar la loción y prevenir la irritación de la piel.
8. Apague el isoflurano, retire el cono de la nariz y coloque a la rata en la jaula de recuperación.
   NOTA: Coloque una almohadilla térmica en la jaula de recuperación.
9. Transfiera al animal recuperado a una jaula de alojamiento limpia para el procedimiento de quemadura del día siguiente (puede tomar ~ 10-15 minutos para que la rata se recupere de la anestesia).

2. Inducir la lesión por quemadura en ratas

1. El día de la quema, ajuste la temperatura del baño de agua a 97 ° C y coloque las cuatro barras de cobre (420 g cada una; Figura 1) En el baño de agua 1 h antes del experimento de combustión para dejar que las varillas se calienten uniformemente.
   NOTA: Las varillas deben sumergirse en el agua. Compruebe la precisión de la pantalla digital de temperatura con un termómetro antes del experimento.
2. Anestesiar a la rata como se menciona en la sección 1.
3. Una vez que la rata no responda al pellizco del dedo del pie en todas las extremidades, colóquela en una almohadilla térmica en posición prona con isoflurano al 1,5% en oxígeno para el mantenimiento (Figura 2A).
4. Inyectar morfina (20 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal (i.p.) para el tratamiento del dolor⁶.
5. Compruebe la temperatura del agua en el baño de agua. Configure el temporizador y póngase los guantes resistentes al calor.
6. Saque una varilla de cobre caliente del baño de agua y tóquela en el área del dorso de la rata durante 7 s para inducir la quemadura.
   NOTA: Mantenga una distancia mínima (10-15 cm) entre el baño de agua y el animal para minimizar la pérdida de calor, y no ejerza presión sobre las varillas mientras induce la quemadura (es decir, el contacto debe mantenerse por gravedad).
7. Aplique cuatro quemaduras, usando una varilla por sitio de quemadura, una inmediatamente después de la otra para producir una quemadura de contacto completo de TBSA de aproximadamente 20% (Figura 2B).
8. Después de la quemadura, resucitar al animal mediante inyección i.p. de solución de Ringer lactato (0,1 ml/g de peso corporal).
   NOTA: Use una solución de timbre lactado ajustado a la temperatura corporal para resucitar a las ratas.
9. Apague el isoflurano, retire el cono de la nariz y coloque la rata en la estera de calor para su recuperación.

3. Preparación de inóculo bacteriano e infección

1. Rayar la muestra congelada de Pseudomonas aeruginosa PAO1 y Staphylococcus aureus ATCC25923 en placas de agar Muller Hinton (MHA), 2 días antes del experimento de quemadura.
2. Al día siguiente, seleccione una sola colonia de bacterias cultivadas de la placa y, usando un bucle de inoculación, raspe ligeramente la placa. Luego, colóquelo en el tubo de cultivo para inocular 10 ml de caldo Muller Hinton (MHB) y cultive durante la noche a 37 ° C en una coctelera de incubadora.
3. El día de la quemadura y la infección, centrifugar el cultivo a 4.000 × g durante 5 min. Lave el pellet con solución salina normal (solución de NaCl al 0,9%).
4. Resuspender el pellet bacteriano en solución salina y diluir hasta 0,1 OD 600nm (densidad óptica a₆₀₀ nm). Diluir el inóculo bacteriano tomando 200 μL de esta suspensión bacteriana y mezclándolo con 800 μL de solución salina para obtener el inóculo bacteriano deseado de 2 × 10⁷ UFC/ml.
5. Inyectar 50 μL de P. aeruginosa o inóculo de S. aureupreparado en la etapa anterior (dosis de infección 1 × 10⁶ UFC) en la rata anestesiada 15 min después de la quemadura, utilizando una aguja de 29 G por vía subcutánea lo más cerca posible de la herida de la quemadura.
6. Después de infectar la herida de la quemadura, coloque la rata en la almohadilla térmica para su recuperación. Una vez que el animal se recupere (~ 15-20 min), alójelo en una jaula limpia.
   NOTA: Después de la lesión por quemadura, aloje una rata por jaula. Use gránulos de comida húmeda con agua para facilitar la masticación y colóquelos en el piso de la jaula para facilitar el alcance.
7. Llene las botellas de agua en la jaula con agua con morfina (0.4 mg / ml) para controlar el dolor.
   NOTA: La morfina oral refleja la situación clínica con pacientes con quemaduras humanas. Este estudio utilizó morfina oral para mantener estos experimentos comparables a los pacientes con quemaduras humanas después de consultar con el personal veterinario en numerosas ocasiones. Los registros de consumo de alcohol y peso se mantuvieron durante todo el experimento. Use el mismo sistema de bebida durante todos los procedimientos. Otros analgésicos, como la buprenorfina, se pueden administrar por vía subcutánea / intraperitoneal según las pautas institucionales de cuidado de los animales.
8. Complete la lista de verificación de monitoreo y monitoree a los animales de cerca para detectar angustia o enfermedad durante toda la duración del experimento.

4. Evaluación de la lesión por quemadura

1. Evalúe la lesión por quemadura en la piel morfológicamente en términos de color y margen inmediatamente después de la lesión por quemadura.
2. Manchar la piel quemada con hematoxilina y eosina (H&E) para visualizar la estructura de la herida por quemadura y el espacio epitelial¹⁵ (ver paso 5.6 para el procesamiento de la muestra).

5. Postprocesamiento de muestras de ratas y enumeración bacteriana

1. Eutanasia a la rata a las 24, 48 y 72 h después de la quemadura con una sobredosis de anestesia.
2. Extraiga muestras de sangre de las ratas mediante punción cardíaca y recójalas en un mini tubo de recolección.
   1. Analizar los recuentos sanguíneos completos de las muestras de sangre para determinar el efecto de la inducción de quemaduras en el sistema inmunitario del huésped.
3. Cosechar piel, tejido subcutáneo, músculo, pulmón y bazo en el momento de la eutanasia.
   NOTA: Mantenga una parte (~ 1 cm × 1 cm; pesando ~ 200-300 mg) de la piel para la tinción de H&E y otra parte para la enumeración bacteriana.
4. Recoja los tejidos en un tubo de recolección de 10 ml y colóquelos en solución salina normal sobre hielo para la enumeración bacteriana.
5. Normalizar el peso del tejido con solución salina normal y homogeneizar las muestras utilizando un homogeneizador de tejidos (consulte la Tabla de materiales).
   1. Diluir en serie los homogeneizados del tejido en solución salina normal.
   2. Placa 100 μL de homogeneizado sin diluir y todas las diluciones de cada muestra de tejido en placas de agar cetrimida para muestras recogidas de ratas infectadas por P. aeruginosa.
      NOTA: Use placas de agar manitol para colocar muestras recolectadas de ratas infectadas con S. aureus.
   3. Incubar las placas a 37 °C en una incubadora durante 16-18 h.
   4. Al día siguiente, cuente las colonias bacterianas en las placas, multiplique por la relación de dilución para obtener el recuento de UFC / ml y normalice con el peso del tejido para calcular el tejido de UFC / g.
   5. Emplear software de análisis de datos para trazar los recuentos bacterianos en diferentes órganos en los diferentes puntos de tiempo de muestreo.
6. Realice tinción H&E de la piel quemada para visualizar la estructura de la herida y la brecha epitelial.
   1. Usando tijeras y pinzas dentadas, corte un parche cutáneo de 1 cm x 1 cm del área de la quemadura y sumérjalo en un fijador (formalina tamponada neutra al 10%, NBF) durante 48 h a temperatura ambiente.
      NOTA: Agite el recipiente para asegurarse de que todos los tejidos estén completamente sumergidos en el fijador, con el volumen del fijador 30 veces el volumen del tejido.
   2. Deshidratar el tejido de la piel con etanol al 70% (v/v) durante 72 h a temperatura ambiente.
   3. Procesar las muestras deshidratadas en bloques de parafina para cortar las secciones y teñir con H&E¹⁵.
   4. Tome imágenes digitales de las diapositivas manchadas en un escáner de diapositivas (consulte la Tabla de materiales) utilizando un objetivo de 40x.
   5. Analice la imagen escaneada utilizando software (consulte el Archivo complementario 1 para el procesamiento de la imagen para el análisis; consulte la Tabla de materiales).
   6. Examine todos los campos de la sección de piel teñida para evaluar la condición de la epidermis, la dermis, el tejido subcutáneo y el músculo esquelético.

Resultados

El protocolo presentado aquí es altamente reproducible y resultó en una lesión por quemadura de espesor total de tercer grado en ratas. La herida de la quemadura aparece de color blanco ceroso después de la inducción de la quemadura (Figura 2B). El color de la lesión por quemadura cambió de blanco a marrón en el transcurso de 72 h después de la quemadura (Figura 2B-E).

El análisis histológi...

Discusión

Se han presentado varios modelos de quemaduras para estudiar la fisiopatología de la lesión por quemadura 8,12,16,17. En el presente estudio, empleamos un modelo de rata para desarrollar un protocolo simple y reproducible para inducir una quemadura de espesor completo seguida de una infección bacteriana para simular un trauma por quemadura infectada en pacientes. La elección de la rata como...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD, USA	309597	Used to inject the analgesic
1.7 mL Microtube	Olympus, USA	24-282	Used to carry morphine
10% NBF	VWR, USA	16004-115	Used to fix the skin piece for staining
30 mL syringe	BD, USA	302832	Used to inject the lactate ringer solution
70% ethyl alcohol	Fischer Scientific, USA	BP28184
Aperio AT2 Digital Pathology  Slide Scanner with ImageScope software	Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA	n/a	Scanning of H & E slides and analysis
Cetrimide agar plates	BD, USA	285420	Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth
Copper rods	n/a	n/a	Used to induce the burn injury
Cotton tipped applicators	OMEGA Surgical supply, USA	4225-IMC	Used to apply eye ointment
Electric shaver	Oster, USA	Golden A5	Used to remove the dorsal side hairs
Eye lube	Dechra, UK	n/a	The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness
Fluff filled underpads	Medline, USA	MSC281225	Used in the burn procedure
Forcep	F.S.T.	11027-12	Used to hold the skin piece
Gauze sponges	Oasis, USA	PK412	Used to clean the applied nair cream from the dorsal side
Heat-resistant gloves	n/a	n/a	Used to hold the heated copper rods
Hematology Analyzer	IDEXX laboratories, USA	ProCyte Dx
Induction chamber	Kent Scientific, USA	vetFlo-0730	Used to anesthesize the animals
Insulin syringe	BD, USA	329461
Isoflurane	Pivetal, USA	NDC46066-755-04	Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness
Isoflurane vaporiser	n/a	n/a
Lactated ringer's solution	icumedical, USA	NDC0990-7953-09	Used to resuscitate the rats
L-shaped spreader	Fischer Scientific, USA	14-665-230
Mannitol Agar	BD, USA	211407	Selective media plates for Staphylococcus aureus growth
Minicollect tubes (K2EDTA)	greiner bio-one, USA	450480	Used to collect the blood
Morphine	Mallinckrodt, UK	NDC0406-8003-30	This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain
Muller Hinton Broth	BD, USA	275730
Muller Hinton II Agar	BD, USA	211438
Nair hair removal lotion	Nair, USA	n/a	Used to remove the residual hairs on dorsal side
Needle 23 G	BD, USA	305193	Used to inject the lactate ringer solution
Normal saline	n/a	n/a
Spectrophotometer	ThermoScientific, USA	Genesys 30
Sprague-Dawley rats, male and female	Charles River Labs	n/a	7-9 weeks old for burn induction
Surgical Scissor	F.S.T.	14501-14	Used to cut the desired skin piece
Tissue collection tubes	Globe Scientific	220101236
Tissue Homogenizer	Kinematica, Inc, USA	POLYTRON PT2100	Used to homogenize the tissue samples
Water bath	Fischer Scientific, USA	n/a	Used to induce the burn injury
Weighted heating pad	Comfytemp, USA	n/a	Used during the procedure to keep rat's body warm