Modelo de queimadura de rato para estudar queimadura térmica cutânea de espessura total e infecção

Resumo

Um modelo que imite o cenário clínico de lesão por queimadura e infecção é necessário para promover a pesquisa de queimaduras. O presente protocolo demonstra um modelo de infecção por queimadura de rato simples e reprodutível, comparável ao de humanos. Isso facilita o estudo de queimaduras e infecções após a queimadura para o desenvolvimento de novos tratamentos tópicos com antibióticos.

Resumo

As metodologias de indução de queimaduras são descritas de forma inconsistente em modelos de ratos. Um modelo uniforme de queimadura, que represente o cenário clínico, é necessário para a realização de pesquisas de queimaduras reprodutíveis. O presente protocolo descreve um método simples e reprodutível para criar queimaduras de espessura total de ~20% da área total do corpo (TBSA) em ratos. Aqui, uma haste de cobre^{de 22,89 cm 2} (5,4 cm de diâmetro) aquecida a 97 °C em banho-maria foi aplicada na superfície da pele do rato para induzir a lesão por queimadura. Uma haste de cobre com uma alta condutividade térmica foi capaz de dissipar o calor mais profundamente no tecido da pele para criar uma queimadura de espessura total. A análise histológica mostra epiderme atenuada com dano coagulativo na extensão de toda a espessura da derme e do tecido subcutâneo. Além disso, esse modelo é representativo das situações clínicas observadas em pacientes queimados hospitalizados após lesão por queimadura, como desregulação imunológica e infecções bacterianas. O modelo pode recapitular a infecção bacteriana sistêmica por bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Em conclusão, este artigo apresenta um modelo de queimadura de rato robusto e de fácil aprendizado que imita as situações clínicas, incluindo desregulação imunológica e infecções bacterianas, o que é de considerável utilidade para o desenvolvimento de novos antibióticos tópicos para queimaduras e infecções.

Introdução

As queimaduras estão entre as formas mais devastadoras de trauma, com taxas de mortalidade chegando a 12%, mesmo em centros especializados em queimados ^1,2,3. De acordo com relatórios publicados recentemente, ~ 486.000 pacientes queimados requerem cuidados médicos anualmente nos Estados Unidos, com quase 3.500 mortes 1,2,3,4,5,6. A lesão por queimadura impõe um grande desafio para o sistema imunológico dos pacientes e cria uma ferida aberta significativa, que é lenta para cicatrizar, deixando-os suscetíveis à colonização cutânea, pulmonar e sistêmica com bactérias nosocomiais e oportunistas. A desregulação imunológica combinada com a infecção bacteriana está associada ao aumento da morbidade e mortalidade em pacientes queimados⁷.

Um modelo de queimadura e infecção animal é essencial para estudar a patogênese de infecções bacterianas após danos à pele e imunossupressão associados ao trauma de queimadura. Tais modelos permitem o desenho e avaliação de novos métodos para o tratamento de infecções bacterianas em pacientes queimados. Ratos e humanos compartilham características fisiológicas e patológicas da pele semelhantes que foram previamente documentadas⁸. Além disso, os ratos são menores em tamanho, tornando-os mais fáceis de manusear, mais acessíveis e mais fáceis de adquirir e manter do que os modelos animais maiores.

Essas características fazem dos ratos um animal modelo ideal para o estudo de queimaduras e infecções⁹. Infelizmente, a técnica de indução de queimaduras é inconsistente e, muitas vezes, minimamente descrita 10,11,12,13,14. O presente protocolo foi projetado para desenvolver um procedimento simples, econômico e reprodutível para criar uma lesão por queimadura consistente de espessura total em um modelo de rato que simula o cenário clínico e pode ser usado para avaliar a imunossupressão e a infecção bacteriana.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Norte e foram conduzidos de acordo com suas diretrizes estabelecidas. Ratos Sprague Dawley machos e fêmeas (250-300 g) com idades entre 7-9 semanas de idade foram utilizados para os experimentos. Todos os animais foram alojados em um ciclo claro-escuro de 12 h:12 h, com livre acesso a alimentos e água ad libitum. Sempre trabalhe com seu veterinário institucional sobre um plano analgésico antes do início do estudo.

1. Preparando ratos para a queimadura

1. Prepare os animais para a queimadura 24 h antes da queimadura.
2. Anestesiar o rato com isoflurano a 5% em oxigênio a 100% em uma câmara de indução por 5 min (vazão: 2 L/min) até que a respiração diminua.
3. Uma vez que o rato esteja profundamente anestesiado (sem resposta à beliscão do dedo do pé em todos os membros), mova o rato para uma almofada de aquecimento em posição prona e reduza o isoflurano para 1,5% em oxigênio para manutenção através de um cone nasal.
4. Para evitar a secagem da córnea após a anestesia e durante o procedimento, aplique lubrificante ocular nas córneas de ambos os olhos usando um aplicador com ponta de algodão.
5. Raspe a área dorsal do rato usando um cortador elétrico (veja a Tabela de Materiais) e remova o máximo de pelos possível em um grande retângulo das omoplatas até a base da cauda (Figura 2A).
6. Limpe a área raspada com um tecido embebido em solução salina para limpar os pelos soltos. Aplique loção de depilação na área raspada usando um aplicador com ponta de algodão e deixe-o por ~ 3 min.
   NOTA: A aplicação da loção de depilação referenciada por mais de 3 minutos induzirá erupções vermelhas na pele.
7. Limpe a área com uma esponja de gaze molhada duas vezes para remover a loção e evitar a irritação da pele.
8. Desligue o isoflurano, remova o cone do nariz e coloque o rato na gaiola de recuperação.
   NOTA: Coloque uma almofada de aquecimento na gaiola de recuperação.
9. Transfira o animal recuperado para uma gaiola de alojamento limpa para o procedimento de queimadura do dia seguinte (pode levar ~ 10-15 minutos para o rato se recuperar da anestesia).

2. Induzindo a lesão por queimadura em ratos

1. No dia da queimadura, ajuste a temperatura do banho-maria para 97 °C e coloque as quatro hastes de cobre (420 g cada; Figura 1) no banho-maria 1 h antes do experimento de queimadura para deixar as hastes aquecerem uniformemente.
   NOTA: As hastes devem ser imersas na água. Verifique a precisão do visor de temperatura digital usando um termômetro antes do experimento.
2. Anestesiar o rato, tal como mencionado na secção 1.
3. Quando o rato não responder à beliscão do dedo do pé em todos os membros, coloque-o em uma almofada de aquecimento em decúbito ventral com isoflurano a 1,5% em oxigênio para manutenção (Figura 2A).
4. Injetar morfina (20 mg/kg de peso corporal) por via intraperitoneal (i.p.) para o tratamento da dor⁶.
5. Verifique a temperatura da água no banho-maria. Configure o temporizador e coloque as luvas resistentes ao calor.
6. Retire uma haste de cobre aquecida do banho-maria e toque-a na área do dorso do rato por 7 s para induzir a queimadura.
   NOTA: Mantenha uma distância mínima (10-15 cm) entre o banho-maria e o animal para minimizar a perda de calor e não exerça pressão sobre as hastes enquanto induz a queimadura (ou seja, o contato deve ser mantido pela gravidade).
7. Aplicar quatro queimaduras, usando uma haste por local de queimadura, uma imediatamente após a outra para produzir uma queimadura de contato total de aproximadamente 20% de TBSA (Figura 2B).
8. Após a queimadura, ressuscitar o animal por injeção i.p. de solução de Ringer lactato (0,1 mL/g de peso corporal).
   NOTA: Use uma solução de campainha de lactato ajustada à temperatura corporal para ressuscitar os ratos.
9. Desligue o isoflurano, remova o cone do nariz e coloque o rato no tapete de calor para recuperação.

3. Preparação de inóculo bacteriano e infecção

1. Estice a amostra congelada de Pseudomonas aeruginosa PAO1 e Staphylococcus aureus ATCC25923 em placas de ágar Muller Hinton (MHA), 2 dias antes do experimento de queimadura.
2. No dia seguinte, selecione uma única colônia de bactérias cultivadas da placa e, usando um laço de inoculação, raspe-a levemente da placa. Em seguida, coloque-o no tubo de cultura para inocular 10 mL de caldo de Muller Hinton (MHB) e cultive durante a noite a 37 °C em um agitador de incubadora.
3. No dia da queimadura e infecção, centrifugar a cultura a 4.000 × g por 5 min. Lave o pellet com solução salina normal (solução de NaCl a 0,9%).
4. Ressuspeite o pellet bacteriano em solução salina e dilua até 0,1 OD 600nm (densidade óptica a₆₀₀ nm). Diluir o inóculo bacteriano tomando 200 μL desta suspensão bacteriana e misturando-o com 800 μL de solução salina para obter o inóculo bacteriano desejado de 2 × 10⁷ UFC/mL.
5. Injetar 50 μL de inóculo de P. aeruginosa ou S. aureupreparado na etapa anterior (dose de infecção 1 × 10⁶ UFC) no rato anestesiado 15 min após a queimadura, usando uma agulha 29 G por via subcutânea o mais próximo possível da ferida queimada.
6. Depois de infectar a ferida de queimadura, coloque o rato na almofada de aquecimento para recuperação. Uma vez que o animal se recupere (~ 15-20 min), abrigue-o em uma gaiola limpa.
   NOTA: Após a lesão por queimadura, abrigue um rato por gaiola. Use pellets de alimentos molhados com água para facilitar a mastigação e coloque-os no chão da gaiola para facilitar o acesso.
7. Encha os frascos de água na gaiola com água com espinhos de morfina (0,4 mg/mL) para o controle da dor.
   NOTA: A morfina oral espelha a situação clínica com pacientes com queimaduras humanas. Este estudo utilizou morfina oral para manter esses experimentos comparáveis a pacientes com queimaduras humanas após consulta com a equipe veterinária em várias ocasiões. Os registros de consumo e peso foram mantidos durante todo o experimento. Use o mesmo sistema de beber durante todos os procedimentos. Outros analgésicos, como a buprenorfina, podem ser administrados por via subcutânea/intraperitoneal, de acordo com as diretrizes institucionais de cuidados com os animais.
8. Preencha a lista de verificação de monitoramento e monitore os animais de perto quanto a angústia ou doença durante toda a duração do experimento.

4. Avaliação da lesão por queimadura

1. Avalie a lesão por queimadura cutânea morfologicamente em termos de cor e margem imediatamente após a lesão por queimadura.
2. Coloração da pele queimada com hematoxilina e eosina (H & E) para visualizar a estrutura da ferida queimada e o gap epitelial¹⁵ (ver etapa 5.6 para o processamento da amostra).

5. Pós-processamento de amostras de ratos e enumeração bacteriana

1. Eutanasiar o rato às 24, 48 e 72 h após a queimadura com uma overdose de anestesia.
2. Retire amostras de sangue dos ratos através de punção cardíaca e colete-as em um mini tubo de coleta.
   1. Analise hemogramas completos das amostras de sangue para determinar o efeito da indução de queimaduras no sistema imunológico do hospedeiro.
3. Colha pele, tecido subcutâneo, músculo, pulmão e baço no momento da eutanásia.
   NOTA: Mantenha uma parte (~ 1 cm × 1 cm; pesando ~ 200-300 mg) da pele para coloração H & E e outra parte para enumeração bacteriana.
4. Colete os tecidos em um tubo de coleta de 10 mL e coloque-os em solução salina normal no gelo para enumeração bacteriana.
5. Normalizar o peso do tecido com solução salina normal e homogeneizar as amostras usando um homogeneizador de tecido (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Diluir serialmente os homogeneizados teciduais em solução salina normal.
   2. Placa de 100 μL de homogeneizado não diluído e todas as diluições de cada amostra de tecido em placas de ágar cetrimida para amostras colhidas de ratos infectados com P. aeruginosa.
      NOTA: Utilizar placas de ágar manitol para chapear amostras colhidas de ratos infectados com S. aureus.
   3. Incubar as placas a 37 °C numa incubadora durante 16-18 h.
   4. No dia seguinte, conte as colônias bacterianas nas placas, multiplique pela razão de diluição para obter a contagem de UFC/mL e normalize com o peso do tecido para calcular o tecido UFC/g.
   5. Empregar software de análise de dados para plotar as contagens bacterianas em diferentes órgãos nos diferentes pontos de tempo de amostragem.
6. Realize a coloração H&E da pele queimada para visualizar a estrutura da ferida e a lacuna epitelial.
   1. Usando tesoura e pinça dentada, corte um remendo de pele de 1 cm x 1 cm da área queimada e mergulhe-o em um fixador (formalina tamponada 10% neutra, NBF) por 48 h à temperatura ambiente.
      NOTA: Gire o recipiente para garantir que todos os tecidos estejam completamente imersos no fixador, com o volume do fixador 30x o volume do tecido.
   2. Desidratar o tecido cutâneo com etanol a 70% (v/v) por 72 h à temperatura ambiente.
   3. Processe as amostras desidratadas em blocos de parafina para cortar as seções e corar com H&E¹⁵.
   4. Fotografe digitalmente os slides manchados em um scanner de slides (consulte a Tabela de Materiais) usando uma objetiva de 40x.
   5. Analise a imagem digitalizada usando software (consulte o Arquivo Suplementar 1 para processamento da imagem para análise; consulte a Tabela de Materiais).
   6. Examine todos os campos da seção da pele corada para avaliar a condição da epiderme, derme, tecido subcutâneo e músculo esquelético.

Resultados

O protocolo aqui apresentado é altamente reprodutível e resultou em uma lesão por queimadura de terceiro grau, de espessura total, em ratos. A ferida da queimadura aparece branca cerosa após a indução da queimadura (Figura 2B). A cor da lesão por queimadura mudou de branca para marrom ao longo de 72 h pós-queimadura (Figura 2B-E).

A análise histológica confirmou queimadura de espessura total...

Discussão

Vários modelos de queimaduras têm sido apresentados para estudar a fisiopatologia da lesão por queimadura 8,12,16,17. No presente estudo, empregamos um modelo de rato para desenvolver um protocolo simples e reprodutível para induzir uma queimadura de espessura total seguida de infecção bacteriana para simular um trauma de queimadura infectado em pacientes. A escolha do rato como modelo an...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD, USA	309597	Used to inject the analgesic
1.7 mL Microtube	Olympus, USA	24-282	Used to carry morphine
10% NBF	VWR, USA	16004-115	Used to fix the skin piece for staining
30 mL syringe	BD, USA	302832	Used to inject the lactate ringer solution
70% ethyl alcohol	Fischer Scientific, USA	BP28184
Aperio AT2 Digital Pathology  Slide Scanner with ImageScope software	Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA	n/a	Scanning of H & E slides and analysis
Cetrimide agar plates	BD, USA	285420	Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth
Copper rods	n/a	n/a	Used to induce the burn injury
Cotton tipped applicators	OMEGA Surgical supply, USA	4225-IMC	Used to apply eye ointment
Electric shaver	Oster, USA	Golden A5	Used to remove the dorsal side hairs
Eye lube	Dechra, UK	n/a	The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness
Fluff filled underpads	Medline, USA	MSC281225	Used in the burn procedure
Forcep	F.S.T.	11027-12	Used to hold the skin piece
Gauze sponges	Oasis, USA	PK412	Used to clean the applied nair cream from the dorsal side
Heat-resistant gloves	n/a	n/a	Used to hold the heated copper rods
Hematology Analyzer	IDEXX laboratories, USA	ProCyte Dx
Induction chamber	Kent Scientific, USA	vetFlo-0730	Used to anesthesize the animals
Insulin syringe	BD, USA	329461
Isoflurane	Pivetal, USA	NDC46066-755-04	Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness
Isoflurane vaporiser	n/a	n/a
Lactated ringer's solution	icumedical, USA	NDC0990-7953-09	Used to resuscitate the rats
L-shaped spreader	Fischer Scientific, USA	14-665-230
Mannitol Agar	BD, USA	211407	Selective media plates for Staphylococcus aureus growth
Minicollect tubes (K2EDTA)	greiner bio-one, USA	450480	Used to collect the blood
Morphine	Mallinckrodt, UK	NDC0406-8003-30	This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain
Muller Hinton Broth	BD, USA	275730
Muller Hinton II Agar	BD, USA	211438
Nair hair removal lotion	Nair, USA	n/a	Used to remove the residual hairs on dorsal side
Needle 23 G	BD, USA	305193	Used to inject the lactate ringer solution
Normal saline	n/a	n/a
Spectrophotometer	ThermoScientific, USA	Genesys 30
Sprague-Dawley rats, male and female	Charles River Labs	n/a	7-9 weeks old for burn induction
Surgical Scissor	F.S.T.	14501-14	Used to cut the desired skin piece
Tissue collection tubes	Globe Scientific	220101236
Tissue Homogenizer	Kinematica, Inc, USA	POLYTRON PT2100	Used to homogenize the tissue samples
Water bath	Fischer Scientific, USA	n/a	Used to induce the burn injury
Weighted heating pad	Comfytemp, USA	n/a	Used during the procedure to keep rat's body warm