تطعيم الشتلات القابل للتطوير والمرن والفعال من حيث التكلفة

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة تطعيم الشتلات القوية التي لا تتطلب خبرة أو تدريبا مسبقا ويمكن تنفيذها بتكلفة منخفضة للغاية باستخدام مواد يسهل الوصول إليها في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية.

Abstract

أصبح تطعيم الشتلات في المراحل المبكرة أداة شائعة في علم الوراثة الجزيئية لدراسة علاقات الجذور داخل النباتات. يعد تطعيم شتلات المرحلة المبكرة من النبات النموذجي الصغير ، Arabidopsis thaliana ، تحديا تقنيا ويستغرق وقتا طويلا بسبب حجم وهشاشة شتلاته. تصف مجموعة متزايدة من الأساليب المنشورة هذه التقنية بمعدلات نجاح متفاوتة وصعوبة وتكاليف مرتبطة بها. تصف هذه الورقة إجراء بسيطا لصنع جهاز تطعيم داخلي قابل لإعادة الاستخدام باستخدام مزيج المطاط الصناعي السيليكوني ، وكيفية استخدام هذا الجهاز لتطعيم الشتلات. في وقت هذا المنشور ، كان كل جهاز تطعيم قابل لإعادة الاستخدام يكلف 0.47 دولارا فقط من المواد الاستهلاكية لإنتاجه. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للمبتدئين الحصول على أول شتلة مطعمة بنجاح في أقل من 3 أسابيع من البداية إلى النهاية. سيسمح هذا الإجراء الذي يمكن الوصول إليه بشكل كبير لمختبرات علم الوراثة الجزيئية النباتية بإنشاء تطعيم الشتلات كجزء طبيعي من عمليتها التجريبية. نظرا للتحكم الكامل الذي يتمتع به المستخدمون في إنشاء وتصميم أجهزة التطعيم هذه ، يمكن تعديل هذه التقنية بسهولة للاستخدام في النباتات الكبيرة ، مثل الطماطم أو التبغ ، إذا رغبت في ذلك.

Introduction

التطعيم هو تقنية بستانية قديمة أصبحت ممارسة زراعية راسخة بحلول عام 500 قبل الميلاد¹. كان تطعيم أنواع مختلفة من نباتات المحاصيل لتحسين الغلة أول استخدام لهذه التقنية ، ولا يزال يستخدم لهذا الغرض اليوم. في العقد الماضي ، اجتذب التطعيم قدرا متزايدا من الاهتمام كأداة لعلماء الأحياء الجزيئية لدراسة الإشارات بعيدة المدى في النباتات²،^3،4،5. في حين أن تطعيم النباتات البالغة أمر سهل نسبيا ، فإن تطعيم النباتات بعد فترة وجيزة من الإنبات يمثل تحديا. على الرغم من ذلك ، يلزم أحيانا تقييم آثار الإشارات بعيدة المدى في عمليات مثل تطوير النبات ، والاستجابات البيئية ، والإزهار⁶،^7،8.

تم تأسيس Arabidopsis thaliana ككائن نموذجي في بيولوجيا النبات لأسباب عديدة ، بما في ذلك صغر حجمه نسبيا ، مما يجعل من السهل نموه داخل المختبر. ومع ذلك ، فإن صغر حجم وهشاشة شتلات Arabidopsis يجعل تطعيم الشتلات الصغيرة أمرا صعبا للغاية. في كثير من الحالات ، يلزم تدريب عملي مكثف للحصول على ترقيع الشتلات بنجاح. كانت هناك العديد من التحسينات المنهجية على مر السنين التي حددت ظروف النمو المثالية والتقنيات الجديدة لزيادة معدل نجاح تطعيم الشتلات⁹،^10،11. كانت أحدث أداة تم تقديمها هي رقاقة تطعيم الشتلات Arabidopsis ، والتي تسمح حتى للمستخدمين عديمي الخبرة بتحقيق مستويات مقبولة من نجاح التطعيم¹². في حين أن هذا التقدم قد قلل بشكل كبير من الحاجز التقني لتطعيم الشتلات ، فإن جهاز الرقاقة مكلف ، وسرعان ما يصبح عدد الطعوم التي يمكن إجراؤها بالتوازي باهظ التكلفة.

بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن استخدام هذا الجهاز إلا لشتلات Arabidopsis التي لها أبعاد hypocotyl التي تشبه الشتلات البرية. في حين أن Arabidopsis هو النوع الرئيسي في عالم علم الوراثة الجزيئية النباتية ، فقد تم القيام بعمل حديث في أنواع أخرى باستخدام تطعيم الشتلات. ومن الأمثلة على ذلك تطعيم فول الصويا والفاصوليا الشائعة ، والتبغ إلى الطماطم ، والكانولا إلى أرابيدوبسيس ، وبعد ذلك أخذ عينات من كلا الأنسجة للحمض النووي الريبي الصغير^13،14. لذلك ، فإن طريقة التطعيم التي يمكن الوصول إليها من قبل معظم المختبرات ويمكن تكييفها بسهولة مع مجموعة واسعة من الأنواع النباتية دون أي تغييرات تقنية كبيرة أمر مرغوب فيه للغاية.

يفصل هذا البروتوكول طريقة تستخدم الإنتاج الداخلي لجهاز تطعيم بسيط يسمح بالتخصيص الكامل لقطر قناة التطعيم وطولها لاستيعاب أي مورفولوجيا للشتلات عبر معظم الأنواع النباتية. إن إنتاج هذه الأجهزة ميسور التكلفة للغاية وقابل للتطوير بدرجة كبيرة ، حيث أن المكونات الوحيدة المطلوبة هي المطاط الصناعي السيليكوني ، والأسلاك أو الأنابيب بالحجم الصحيح ، وشفرة عالية الدقة ، وحاوية لتكون بمثابة قالب. باتباع بروتوكول التطعيم المفصل هنا ، يمكن للمستخدمين تحقيق معدلات تطعيم ناجحة تبلغ 45٪ (ن = 105) ، مقارنة بنتائج التطعيم المبلغ عنها سابقا^10,12.

Protocol

1. إعداد الجهاز

1. اصنع جهاز تطعيم السيليكون عن طريق صب محلول المطاط الصناعي السيليكوني في طبق بتري مربع (100 مم × 100 مم). تحضير 15 مل من محلول المطاط الصناعي ، باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
   ملاحظة: تشتمل مجموعات المطاط الصناعي السيليكوني عادة على سائل قائم على السيليكون وعامل معالجة ، والذي عند مزجه معا يسمح للسيليكون بالتصلب.
2. تحضير طبق بتري مربع عن طريق وضع أربع قطع مستقيمة من سلك 29 G في طبق بتري مربع ، على مسافة متساوية من بعضها البعض (الشكل 1A). تأكد من أن السلك يتدفق مع الجزء السفلي من القالب. لتصويب السلك بالكامل ، لفه على سطح موحد صلب بجسم ثقيل ومسطح (على سبيل المثال ، رف أنبوب معدني).
   ملاحظة: غالبا ما تحتوي الروابط الملتوية على سلك 29 G ويمكن استخدامها بعد إزالة طلاء الورق الخارجي بالأسيتون.
3. يسكب محلول المطاط الصناعي السيليكوني المختلط فوق الأسلاك ويغطى بالجزء العلوي من طبق بتري. اترك السيليكون يعالج لمدة 24-48 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
4. قم بإزالة ورقة السيليكون من طبق بتري باستخدام ملقط نظيف وانتقل إلى سطح مستو نظيف.
5. قم بإزالة الأسلاك من ورقة السيليكون. قم بإزالة الطبقة الرقيقة من السيليكون المتبقية على السطح الخارجي للقناة باستخدام ملقط نقطي رفيع ، للسماح للقناة بالانفتاح على جانب واحد (الشكل 1 أ).
6. قطع ورقة السيليكون بشكل عمودي على القنوات إلى شرائح 3 مم باستخدام مقص نظيف. انقل كل شريط إلى مظروف من رقائق الألومنيوم وختمه بشريط الأوتوكلاف.
7. الأوتوكلاف على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل وتخزينها حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

2. إعداد الشتلات

1. تعقيم البذور وتبرئها.
   1. ما يصل إلى 100 بذرة أرابيدوبسيس في 1 مل من محلول التبييض 50٪ يحتوي على 0.1٪ توين 20 في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، واحتضانه لمدة 5-10 دقائق. قم بإزالة محلول التبييض من خلال السحب أو الشفط في ظروف معقمة. شطف البذور مع 1 مل من dH₂O. تأكد من عكس الأنابيب لشطف البذور بشكل كاف وإزالة أي محلول مبيض متبقي في الجزء العلوي من الأنبوب. كرر الشطف 4x.
   2. اترك حوالي 0.25 مل من الماء في الأنابيب مع البذور واحفظه في 4 درجات مئوية لمدة 3 أيام في الظلام.
2. طبق البذور استعدادا للتطعيم.
   1. قم بإعداد لوحة أجار MS بنسبة 1٪ على النحو التالي: ل 1 لتر من الوسط الصلب MS (0.5٪ سكروز) ، امزج 4.4 جم من ملح MS ، و 5 جم من السكروز ، و 10 جم من أجار في 800 مل من الماء ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 5.7 باستخدام KOH ، ثم ارفع الحجم الإجمالي إلى 1 لتر مع ماء إضافي. الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل صب ~ 25 مل في أطباق بتري المربعة.
   2. في ظل ظروف معقمة ، انقل العدد المناسب من البذور المحضرة إلى الطبق ، باستخدام طرف ماصة سعة 20 ميكرولتر لشفط البذور ونقلها.
   3. ضع شريطا معقما على سطح اللوحة لتوجيه وضع البذور ، بحيث يتم محاذاة البذور مع القنوات الموجودة على الشريط. قم بإزالة الشريط بمجرد طلاء البذور.
      ملاحظة: يمكن أن تستوعب صفيحة مربعة واحدة مقاس 100 مم × 100 مم صفين من الشتلات (الشكل 1 ب).
   4. بمجرد أن تقف الألواح ، اترك السائل يتبخر من الوسط الصلب وتجمع في أسفل اللوحة. بعد وضع البذور على الطبق ، ضع على غطاء اللوحة وأغلق جانبا واحدا من اللوحة الموازية لصفي البذور (المشار إليه بالمنطقة المميزة باللون الأزرق في الشكل 1 ب) باستخدام parafilm. لف الشريط القابل للتنفس أعلى البارافيلم وحول جميع الحواف الأخرى للوحة.
3. قف بعناية لوحين مع توجيه الجانب المختوم للبارافيلم لأسفل. افصل اللوحين في الأسفل عن طريق وضع أنبوب طرد مركزي أفقي سعة 15 مل بينهما وآمن بشريط مطاطي. تأكد من أن أسطح الألواح تشكل زاوية 100 درجة -110 درجة مع سطح الطاولة (الشكل 1C).
4. قم بتخزين الألواح في هذا الاتجاه لمدة 72 ساعة في ظلام دامس عند 21 درجة مئوية ، للسماح ل hypocotyls الشتلات بالنمو ~ 5 مم في الطول. بعد 72 ساعة ، قم بإزالة الألواح من الظلام وتنمو تحت ضوء 16 ساعة (شدة 100 μE m-2 sec-1) ودورات مظلمة لمدة 8 ساعات لمدة ^2-4 أيام أخرى في نفس درجة الحرارة قبل التطعيم.
5. تطعيم الشتلات بين 5 و 7 أيام بعد طلائها. ضع شريط تطعيم فوق الشتلات ، وقم بتركيب hypocotyls في القنوات. ضع الشتلات برفق بحيث يتم وضع تقاطع الجذر hypocotyl في الجزء السفلي من شريط السيليكون لتحضير الشتلات للقطع (الشكل 1 د).

3. إجراء التطعيم

1. قم بإعداد بيئة عمل معقمة عن طريق تعقيم منظار التشريح بنسبة 70٪ من الإيثانول والتعقيم بزوجين من الملقط ذي الرؤوس الدقيقة ومقبض مشرط. قم بإجراء جميع إجراءات التطعيم في غطاء معقم وبمساعدة منظار تشريح حسب الحاجة. قم بإجراء معظم التطعيم باستخدام تكبير 10.5x.
2. تحضير السليل. استخدم شفرة مشرط جديدة لقطع hypocotyl بشكل عمودي لإنشاء قطع نظيف مستقيم. ادفع الشفرة للأمام بدلا من الضغط لأسفل في النبات لمنع دفع الشتلات إلى الآجار (فيديو 1).
3. قم بإزالة اللقطة. احرص على الحفاظ على رطوبة الجزء المقطوع من اللقطة من خلال ضمان ملامسة سطح الوسائط. بدلا من ذلك ، انقل اللقطة إلى منطقة احتجاز مخصصة ، مثل الجزء العلوي من طبق بتري مملوء ب dH₂O المعقم ، حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
4. تحضير الجذر. اسحب الجذر برفق عن طريق التقاط الجذر في الفراغ المتبقي بين الملقط المغلق وقلبه ، مع ترك الجزء المقطوع من الجذور في منتصف الشريط (الفيديو 2).
   ملاحظة: سوف يتضرر الجذر الهش إذا تم سحقه بين الملقط المغلق مباشرة ، مما يستلزم ربط الجذر في الزاوية الحادة لنهايات الملقط لمعالجة الأنسجة.
5. التقط اللقطة المطلوبة برفق باستخدام الملقط ذي الرؤوس الدقيقة وأدخله في الجزء العلوي من القناة.
   ملاحظة: من الأهمية بمكان تأكيد الاتصال بصريا بين السليل والجذور للحصول على طعم ناجح (فيديو 3).
6. بعد إجراء جميع الطعوم ، لف الألواح بشريط بارافيلم وشريط تنفس وقم بإعداد الألواح بنفس الطريقة كما كان من قبل ، دون إزعاج الشتلات أو شرائط السيليكون. انقل الألواح بعناية إلى غرفة نمو مضبوطة على 26 درجة مئوية مع دورات إضاءة 16 ساعة / 8 ساعات مظلمة.
7. تقييم الشتلات المطعمة تحت ظروف معقمة بعد 7-10 أيام. قم بإزالة شريط السيليكون بعناية باستخدام الملقط عن طريق تقشير جانب واحد ، مما يسمح للقنوات بتحرير الشتلات. قم بإزالة أي جذور عرضية تنمو من السليل عن طريق قطعها من السليل بشفرة مشرط جديدة أو سحقها باستخدام ملقط رفيع الرأس. قم بتقييم بصريا ما إذا كان الجذر قد أصبح مرتبطا بقوة بالسليل لتشكيل طعم ناجح (الشكل 2).
8. انقل الطعوم الناجحة إلى تربة تكاثر الشتلات لتنمو طالما لزم الأمر. قم بتغطية التربة بالبلاستيك الشفاف لبضعة أيام عند إنشاء الشتلات. بعد نقل النباتات إلى التربة ، تنمو تحت دورات الضوء والظلام المذكورة سابقا عند 21 درجة مئوية.

النتائج

تم اختبار جوانب مختلفة من تصميم شريط التطعيم لتحديد ظروف التطعيم المثلى التي تتطلب أقل قدر من المهارة الفنية (الجدول 1). تم الانتهاء من جميع تجارب التطعيم على وسط السكروز MS بنسبة 0.5٪ ، والذي تم الإبلاغ عنه سابقا ليكون وسط تطعيم مثالي^11,12.

Discussion

ملخص وأهمية
يعد تكوين اتحاد الكسب غير المشروع أمرا بالغ الأهمية لنجاح التطعيم ، الأمر الذي يتطلب اتصالا مباشرا ودون عائق بين الجذر والسليل. إن الحجم المصغر وهشاشة شتلات النباتات الصغيرة مثل Arabidopsis يجعل من الصعب تقنيا تلبية هذا المطلب. كانت إحدى التقنيات التي تم تطويرها في ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tubes	VWR International Inc	10026-076
ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L	VWR	BJAH010-4
BactoAgar	Sigma	A1296-500g
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit	Dow	2646340
D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg	Fisher Scientific	BP220-1
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500	Fisher Scientific	20901-551 / 05-402
Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-164
Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape	Fisher Scientific	15-901-111
Fisherbrand square petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711A
Leica Zoom 2000 Stereo Microscope	Microscope Central	L-Z2000
Micropore Tape	3M	B0082A9FEM
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519-10L
Parafilm	Genesee Scientific	16-101
potassium hydroxide	VWR International Inc	AA13451-36
Redi-earth Plug and Seedling Mix	Sun Gro Horticulture	SUN239274728CFLP
Scotts Osmocote Plus	Hummert International	7630600
Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade	Fisher Scientific	22-079-697
Tween 20, 500 mL	Fisher Scientific	BP337500
TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM	VWR	102091-580