Ölçeklenebilir, esnek ve uygun maliyetli fide aşılama

Özet

Bu protokol, önceden deneyim veya eğitim gerektirmeyen ve çoğu moleküler biyoloji laboratuvarında kolayca erişilebilen malzemeler kullanılarak çok düşük bir maliyetle yürütülebilen sağlam bir fide aşılama yöntemini açıklamaktadır.

Özet

Erken evre fide aşılama, bitkilerdeki kök-sürgün ilişkilerini incelemek için moleküler genetikte popüler bir araç haline gelmiştir. Küçük model bitki Arabidopsis thaliana'nın erken aşamadaki fidelerinin aşılanması, fidelerinin büyüklüğü ve kırılganlığı nedeniyle teknik olarak zor ve zaman alıcıdır. Yayınlanmış yöntemlerin giderek artan bir koleksiyonu, bu tekniği değişen başarı oranları, zorluk ve ilişkili maliyetlerle tanımlamaktadır. Bu makalede, silikon elastomer karışımı kullanılarak şirket içi yeniden kullanılabilir bir aşılama cihazı yapmak için basit bir prosedür ve bu cihazın fide aşılama için nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Bu yayın sırasında, her bir yeniden kullanılabilir aşılama cihazı, üretilecek sarf malzemesinde sadece 0,47 $ 'a mal oluyor. Bu yöntemi kullanarak, yeni başlayanlar ilk başarılı aşılanmış fidelerini baştan sona 3 haftadan daha kısa bir sürede alabilirler. Bu son derece erişilebilir prosedür, bitki moleküler genetik laboratuvarlarının fide aşılamasını deneysel süreçlerinin normal bir parçası olarak kurmalarına izin verecektir. Kullanıcıların bu aşılama cihazlarının oluşturulmasında ve tasarımında sahip oldukları tam kontrol nedeniyle, bu teknik istenirse domates veya tütün gibi daha büyük bitkilerde kullanım için kolayca ayarlanabilir.

Giriş

Aşılama, MÖ 500 yılına kadar yerleşik bir tarım uygulaması haline gelen eski bir bahçecilik tekniğidir¹. Verimi artırmak için farklı bitki çeşitlerini aşılamak, bu tekniğin ilk kullanımıydı ve bugün bu amaçla kullanılmaya devam ediyor. Son on yılda, aşılama, moleküler biyologların bitkilerde uzun mesafeli sinyalleşmeyi incelemeleri için bir araç olarak giderek artan miktarda dikkat çekmiştir ^2,3,4,5. Yetişkin bitkileri aşılamak nispeten kolay olsa da, çimlenmeden hemen sonra bitkileri aşılamak zordur. Buna rağmen, bazen bitki gelişimi, çevresel tepkiler ve^{çiçeklenme 6,7,8} gibi süreçlerde uzun mesafeli sinyalizasyonun etkilerini değerlendirmek gerekir.

Arabidopsis thaliana, nispeten küçük boyutu da dahil olmak üzere birçok nedenden dolayı bitki biyolojisinde model organizma olarak kurulmuştur ve bu da bir laboratuarda büyümesini kolaylaştırmaktadır. Bununla birlikte, Arabidopsis fidelerinin küçük boyutu ve kırılganlığı, genç fidelerin aşılanmasını çok zorlaştırır. Çoğu durumda, fide greftlerini başarılı bir şekilde elde etmek için kapsamlı uygulamalı eğitim gereklidir. Yıllar geçtikçe, fide aşılamanın başarı oranını artırmak için ideal yetiştirme koşullarını ve yeni teknikleri belirleyen birçok metodolojik gelişme olmuştur ^9,10,11. Tanıtılan en son araç, deneyimsiz kullanıcıların bile kabul edilebilir aşılama başarısı seviyelerine ulaşmalarını sağlayan bir Arabidopsis fide aşılama çipiydi¹². Bu ilerleme, fide aşılamasının teknik bariyerini önemli ölçüde azaltmış olsa da, çip cihazı pahalıdır ve paralel olarak yapılabilecek greft sayısı hızla maliyet engelleyici hale gelir.

Ek olarak, bu cihaz sadece yabani tip fidelere benzer hipokotil boyutlarına sahip Arabidopsis fideleri için kullanılabilir. Arabidopsis, bitki moleküler genetiği dünyasında kilit taşı türü olsa da, son zamanlarda fide aşılaması kullanılarak diğer türlerde de çalışmalar yapılmıştır. Örnekler arasında soya fasulyesi ve ortak fasulye, tütünden domatese ve kanoladan Arabidopsis'e aşılama ve daha sonra her iki dokunun da küçük RNA'lar için örneklenmesi^{sayılabilir 13,14}. Bu nedenle, çoğu laboratuvar tarafından erişilebilen ve herhangi bir büyük teknik değişiklik yapmadan çok çeşitli bitki türlerine kolayca uyarlanabilen bir aşılama yöntemi oldukça arzu edilir.

Bu protokol, çoğu bitki türünde herhangi bir fide morfolojisini barındırmak için aşılama kanalı çapının ve uzunluğunun tamamen özelleştirilmesine izin veren basit bir aşılama cihazının şirket içi üretimini kullanan bir yöntemi detaylandırır. Bu cihazların üretimi çok uygun fiyatlı ve oldukça ölçeklenebilirdir, çünkü ihtiyaç duyulan tek bileşenler silikon elastomer, doğru boyutta kablolama veya boru, yüksek hassasiyetli bir bıçak ve kalıp görevi görecek bir kaptır. Burada detaylandırılan aşılama protokolünü takiben, kullanıcılar daha önce bildirilen aşılama sonuçları ^10,12 ile karşılaştırılabilir olan% 45'lik (n =¹⁰⁵) başarılı aşılama oranları elde edebilirler.

Protokol

1. Cihaz hazırlama

1. Silikon elastomer çözeltisini kare bir Petri kabına (100 mm x 100 mm) dökerek silikon aşılama cihazını yapın. Üreticinin yönergelerini izleyerek 15 mL elastomer çözeltisi hazırlayın.
   NOT: Silikon elastomer kitleri tipik olarak silikon bazlı bir sıvı ve birlikte karıştırıldığında silikonun katılaşmasına izin veren bir kürleme maddesi içerir.
2. Kare Petri kabını, birbirinden eşit uzaklıkta dört düz 29 G tel parçası yerleştirerek hazırlayın (Şekil 1A). Telin kalıbın tabanıyla aynı hizada durduğundan emin olun. Teli tamamen düzleştirmek için, ağır ve düz bir nesneyle (örneğin, metal bir boru rafı) sert ve düzgün bir yüzeye yuvarlayın.
   NOT: Bükümlü bağlar genellikle 29 G tel içerir ve dış kağıt kaplamasını asetonla çıkardıktan sonra kullanılabilir.
3. Karışık silikon elastomer çözeltisini tellerin üzerine dökün ve Petri kabının üstü ile örtün. Silikonun oda sıcaklığında 24-48 saat kürlenmesine izin verin.
4. Silikon tabakayı Petri kabından temiz forseps kullanarak çıkarın ve temiz düz bir yüzeye taşıyın.
5. Telleri silikon tabakadan çıkarın. Kanalın bir tarafında açık olmasını sağlamak için kanalın dışında kalan ince silikon tabakasını ince nokta forsepsleri ile çıkarın (Şekil 1A).
6. Silikon levhayı kanallara dik olarak temiz makas kullanarak 3 mm'lik şeritler halinde kesin. Her şeridi alüminyum bir folyo zarfa taşıyın ve otoklav bantla kapatın.
7. Şeritleri 121 °C'de en az 30 dakika otoklavlayın ve kullanıma hazır olana kadar saklayın.

2. Fide hazırlama

1. Tohumları sterilize edin ve ververalize edin.
   1. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde% 0.1 Tween 20 içeren 1 mL% 50 ağartıcı çözeltisinde 100'e kadar Arabidopsis tohumunu askıya alın ve 5-10 dakika inkübe edin. Ağartıcı çözeltisini steril koşullar altında pipetleme veya aspirasyon yoluyla çıkarın. Tohumları 1 mL sterilize dH₂O ile durulayın. tohumları yeterince durulamak ve tüpün üstünde kalan ağartıcı çözeltisini çıkarmak için tüpleri ters çevirdiğinizden emin olun. Durulamayı 4 kat tekrarlayın.
   2. Tohumlarla birlikte tüplerde yaklaşık 0.25 mL su bırakın ve karanlıkta 3 gün boyunca 4 ° C'de saklayın.
2. Aşılamaya hazırlık olarak tohumları plakalayın.
   1. Aşağıdaki gibi% 1'lik bir agar MS plakası hazırlayın: 1 L MS (% 0.5 sakaroz) katı ortam için, 800 mL suda 4.4 g MS tuzu, 5 g sakkaroz ve 10 g agar karıştırın, pH'ı KOH ile 5.7'ye ayarlayın ve ardından toplam hacmi ilave su ile 1 L'ye getirin. Kare Petri kaplarına ~ 25 mL dökmeden önce en az 20 dakika otoklavlayın.
   2. Steril koşullar altında, tohumları aspire etmek ve aktarmak için 20 μL'lik bir pipet ucu kullanarak uygun sayıda hazırlanmış tohumu plakaya taşıyın.
   3. Tohum konumlandırmasını yönlendirmek için plaka yüzeyine steril bir şerit yerleştirin, böylece tohumlar şerit üzerindeki kanallarla hizalanır. Tohumlar kaplandıktan sonra şeridi çıkarın.
      NOT: Bir adet 100 mm x 100 mm kare plaka iki sıra fide barındırabilir (Şekil 1B).
   4. Plakalar ayağa kalktıktan sonra, sıvının katı ortamdan buharlaşmasına ve plakanın dibinde birikmesine izin verin. Tohumlar plakaya yerleştirildikten sonra, plaka kapağına koyun ve plakanın iki tohum sırasına paralel olan bir tarafını ( Şekil 1B'de mavi renkte vurgulanan bölge ile gösterilir) parafilm ile kapatın. Nefes alabilen bandı parafilmin üstüne ve plakanın diğer tüm kenarlarına sarın.
3. Parafilm sızdırmaz tarafı aşağı bakacak şekilde iki plakayı dikkatlice ayağa kaldırın. İki plakayı, aralarına yatay 15 mL'lik bir santrifüj tüpü yerleştirerek alttan ayırın ve lastik bir bantla sabitleyin. Plaka yüzeylerinin tezgah üstü yüzeyle 100°-110° açı oluşturduğundan emin olun (Şekil 1C).
4. Fide hipokotillerinin ~ 5 mm uzunluğunda büyümesine izin vermek için plakaları bu yönde 72 saat boyunca 21 ° C'de tamamen karanlıkta saklayın. 72 saat sonra, plakaları karanlıktan çıkarın ve aşılamadan önce aynı sıcaklıkta 2-4 gün daha 16 saat ışık (100 μE ^{m-2 sn-1} yoğunluğu) ve 8 saat karanlık döngü altında büyüyün.
5. Fideleri kaplandıktan sonra 5 ila 7 gün arasında aşılayın. Fidelerin üzerine, hipokotillerini kanallara yerleştirerek bir aşılama şeridi yerleştirin. Fideyi yavaşça konumlandırın, böylece kök-hipokotil bağlantısı, fideyi kesmeye hazırlamak için silikon şeridin altına yerleştirilir (Şekil 1D).

3. Aşılama prosedürü

1. Bir diseksiyon kapsamını %70 etanol ile sterilize ederek ve iki çift ince uçlu forseps ve bir neşter sapını otoklavlayarak steril bir çalışma ortamı hazırlayın. Tüm aşılama prosedürlerini steril bir başlıkta ve gerektiğinde bir diseksiyon kapsamı yardımıyla gerçekleştirin. Aşılamanın çoğunu 10,5x büyütme kullanarak gerçekleştirin.
2. Scion'ları hazırlayın. Düz ve temiz bir kesim oluşturmak için hipokotili dik olarak kesmek için taze bir neşter bıçağı kullanın. Fidenin agar içine itilmesini önlemek için bıçağı bitkiye bastırmak yerine ileri doğru itin (Video 1).
3. Çekimi çıkarın. Medya yüzeyi ile teması sağlayarak sürgünün kesilmiş kısmını nemli tutmaya özen gösterin. Alternatif olarak, çekimi kullanıma hazır olana kadar steril dH₂O ile doldurulmuş bir Petri kabının üstü gibi belirlenmiş bir tutma alanına taşıyın.
4. Anaçları hazırlayın. Kökü kapalı forsepsler arasında kalan boşlukta yakalayıp çevirerek kökü yavaşça çekin ve anaçların kesilmiş kısmını şeridin ortasında bırakın (Video 2).
   NOT: Kırılgan kök, kapalı forsepsler arasında doğrudan ezilirse zarar görür ve dokuyu manipüle etmek için kökün cımbız uçlarının keskin açısında kıvrılmasını gerektirir.
5. İnce uçlu forsepsleri kullanarak istediğiniz çekimi yavaşça alın ve kanalın üst kısmına yerleştirin.
   NOT: Başarılı bir greft elde etmek için scionlar ve anaçlar arasındaki teması görsel olarak doğrulamak çok önemlidir (Video 3).
6. Tüm greftler yapıldıktan sonra, plakaları parafilm ve nefes alabilen bantla sarın ve fideleri veya silikon şeritleri rahatsız etmeden plakaları daha önce olduğu gibi ayarlayın. Plakaları dikkatlice 16 saat ışık/8 saat karanlık döngü ile 26 ° C'de ayarlanmış bir büyüme odasına taşıyın.
7. Aşılı fideleri 7-10 gün sonra steril koşullarda değerlendirin. Silikon şeridi forseps kullanarak bir tarafını soyarak dikkatlice çıkarın ve kanalların fideleri serbest bırakmasına izin verin. Filizden büyüyen maceracı kökleri, taze bir neşter bıçağı ile filizden keserek veya ince uçlu forseps kullanarak ezerek çıkarın. Başarılı bir greft oluşturmak için anaçların filize sıkıca yapışıp bağlanmadığını görsel olarak değerlendirin (Şekil 2).
8. Başarılı greftleri, gerektiği kadar büyümek için fide çoğaltma toprağına taşıyın. Fideler kuruldukça toprağı birkaç gün şeffaf plastikle örtün. Bitkileri toprağa aktardıktan sonra, daha önce bahsedilen açık ve karanlık döngüler altında 21 ° C'de büyüyün.

Sonuçlar

Aşılama şeridinin tasarımının çeşitli yönleri, en az miktarda teknik beceri gerektiren optimal aşılama koşullarını belirlemek için test edilmiştir (Tablo 1). Tüm greftleme çalışmaları, daha önce ideal bir aşılama ortamı olduğu bildirilen %0,5 sakkaroz MS besiyeri üzerinde tamamlandı^11,12.

Şerit üzerinde çimlenme ile optimum fide büyümesi sağlanamaz
Silikon şeridin ...

Tartışmalar

Özet ve önem
Greft birliğinin oluşması, anaç ve filiz arasında doğrudan ve kesintisiz temas gerektiren başarılı aşılama için çok önemlidir. Arabidopsis gibi küçük bitkilerin fidelerinin minyatür boyutu ve kırılganlığı, bu gereksinimi karşılamayı teknik olarak zorlaştırmaktadır. Erken Arabidopsis fide aşılama yöntemlerinde geliştirilen bir teknik, greft bileşkesi^10'u desteklemek için hem filiz hem de anacı kısa bir silikon...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tubes	VWR International Inc	10026-076
ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L	VWR	BJAH010-4
BactoAgar	Sigma	A1296-500g
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit	Dow	2646340
D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg	Fisher Scientific	BP220-1
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500	Fisher Scientific	20901-551 / 05-402
Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-164
Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape	Fisher Scientific	15-901-111
Fisherbrand square petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711A
Leica Zoom 2000 Stereo Microscope	Microscope Central	L-Z2000
Micropore Tape	3M	B0082A9FEM
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519-10L
Parafilm	Genesee Scientific	16-101
potassium hydroxide	VWR International Inc	AA13451-36
Redi-earth Plug and Seedling Mix	Sun Gro Horticulture	SUN239274728CFLP
Scotts Osmocote Plus	Hummert International	7630600
Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade	Fisher Scientific	22-079-697
Tween 20, 500 mL	Fisher Scientific	BP337500
TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM	VWR	102091-580