확장 가능하고 유연하며 비용 효율적인 묘목 접목

요약

이 프로토콜은 사전 경험이나 교육이 필요하지 않으며 대부분의 분자 생물학 실험실에서 쉽게 접근할 수 있는 재료를 사용하여 매우 저렴한 비용으로 실행할 수 있는 강력한 묘목 접목 방법을 설명합니다.

초록

초기 단계의 묘목 접목은 식물 내에서 뿌리-싹 관계를 연구하기 위한 분자 유전학에서 인기 있는 도구가 되었습니다. 작은 모델 식물인 Arabidopsis thaliana의 초기 단계 묘목을 접목하는 것은 묘목의 크기와 취약성으로 인해 기술적으로 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 점점 더 많은 출판된 방법 모음에서 이 기술을 다양한 성공률, 난이도 및 관련 비용으로 설명합니다. 이 논문은 실리콘 엘라스토머 믹스를 사용하여 사내 재사용 가능한 접목 장치를 만드는 간단한 절차와 이 장치를 묘목 접목에 사용하는 방법을 설명합니다. 이 출판 당시 각 재사용 가능한 접목 장치는 생산 소모품이 $0.47에 불과합니다. 이 방법을 사용하면 초보자는 처음부터 끝까지 3 주 이내에 첫 번째 성공적으로 접목 된 묘목을 가질 수 있습니다. 이 접근성이 높은 절차를 통해 식물 분자 유전학 실험실은 묘목 접목을 실험 과정의 정상적인 부분으로 설정할 수 있습니다. 사용자가 이러한 접목 장치를 만들고 설계할 때 완전한 통제권을 갖기 때문에 이 기술은 원하는 경우 토마토나 담배와 같은 더 큰 식물에서 사용하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.

서문

접목은 기원전 500년경에 확립된 농업 관행이 된 고대 원예 기술입니다¹. 수확량을 향상시키기 위해 다양한 종류의 작물을 접목하는 것이 이 기술의 첫 번째 사용이었으며 오늘날에도 이 목적으로 계속 사용되고 있습니다. 지난 10년 동안 접목은 분자생물학자들이 식물 ^2,3,4,5에서 장거리 신호를 연구하기 위한 도구로서 점점 더 많은 관심을 끌었습니다. 성인 식물을 접목하는 것은 비교적 쉽지만 발아 직후 식물을 접목하는 것은 어렵습니다. 그럼에도 불구하고 식물 발달, 환경 반응 및 개화와 같은 과정에서 장거리 신호 전달의 효과를 평가해야 하는 경우가 있습니다 ^6,7,8.

애기장대는 상대적으로 작은 크기를 포함하여 여러 가지 이유로 식물 생물학의 모델 유기체로 자리 잡았으며 실험실 내에서 쉽게 자랄 수 있습니다. 그러나 애기장대 묘목의 작은 크기와 취약성은 어린 묘목을 접목하는 것을 매우 어렵게 만듭니다. 많은 경우 묘목 이식편을 성공적으로 얻기 위해서는 광범위한 실습 교육이 필요합니다. 묘목 접목의 성공률을 높이기 위한 이상적인 재배 조건과 새로운 기술을 식별한 많은 방법론적 개선이 수년에 걸쳐 있었습니다 9,10,11. 가장 최근에 도입된 도구는 애기장대 묘목 접목 칩으로, 경험이 없는 사용자도 허용 가능한 수준의 접목 성공을 달성할 수 있습니다¹². 이러한 발전으로 묘목 접목의 기술적 장벽이 크게 낮아졌지만 칩 장치는 비싸고 병렬로 수행할 수 있는 이식편의 수는 빠르게 비용이 많이 듭니다.

또한 이 장치는 야생형 묘목과 유사한 배축 치수를 가진 애기장대 묘목에만 사용할 수 있습니다. 애기장대는 식물 분자 유전학의 세계에서 핵심 종이지만 최근에는 묘목 접목을 사용하여 다른 종에서 연구가 수행되었습니다. 예를 들면 대두와 일반 콩, 담배를 토마토, 카놀라를 애기장대에 접목한 다음 두 조직을 모두 샘플링하여 작은 RNA를 채취하는 것이 있습니다^13,14. 따라서 대부분의 실험실에서 접근할 수 있고 주요 기술 변경 없이 광범위한 식물 종에 쉽게 적용할 수 있는 접목 방법이 매우 바람직합니다.

이 프로토콜은 대부분의 식물 종에 걸쳐 모든 묘목 형태를 수용하기 위해 접목 채널 직경과 길이를 완전히 맞춤화할 수 있는 간단한 접목 장치의 자체 생산을 사용하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 장치의 생산은 실리콘 엘라스토머, 올바른 크기의 배선 또는 튜브, 고정밀 블레이드 및 금형 역할을 하는 컨테이너만 필요하기 때문에 매우 저렴하고 확장성이 뛰어납니다. 여기에 상술된 접목 프로토콜에 따라, 사용자는 이전에 보고된 접목 결과(^10,12)와 비교할 수 있는 45%(n=105)의 성공적인 접목률을 달성할 수 있다.

프로토콜

1. 장치 준비

1. 실리콘 엘라스토머 용액을 정사각형 페트리 접시(100mm x 100mm)에 캐스팅하여 실리콘 그래프팅 장치를 만듭니다. 제조업체의 지침에 따라 엘라스토머 용액 15mL를 준비합니다.
   알림: 실리콘 엘라스토머 키트에는 일반적으로 실리콘 기반 액체와 경화제가 포함되어 있으며, 함께 혼합하면 실리콘이 응고됩니다.
2. 정사각형 페트리 접시에 29G 와이어의 직선 조각 4개를 서로 등거리에 놓아 정사각형 페트리 접시를 준비합니다(그림 1A). 와이어가 금형 바닥과 같은 높이에 있는지 확인하십시오. 와이어를 완전히 곧게 펴려면 무겁고 평평한 물체(예: 금속 튜브 랙)로 단단하고 균일한 표면에 굴립니다.
   알림: 트위스트 타이에는 종종 29G 와이어가 포함되어 있으며 아세톤으로 코팅된 외부 종이를 제거한 후 사용할 수 있습니다.
3. 혼합 된 실리콘 엘라스토머 용액을 와이어 위에 붓고 페트리 접시 상단으로 덮습니다. 실리콘이 실온에서 24-48시간 동안 경화되도록 합니다.
4. 깨끗한 집게를 사용하여 페트리 접시에서 실리콘 시트를 제거하고 깨끗하고 평평한 표면으로 이동합니다.
5. 실리콘 시트에서 전선을 제거합니다. 채널이 한쪽에서 열릴 수 있도록 미세한 집게로 채널 외부에 남아 있는 얇은 실리콘 층을 제거합니다(그림 1A).
6. 깨끗한 가위를 사용하여 실리콘 시트를 채널에 수직으로 3mm 스트립으로 자릅니다. 각 스트립을 알루미늄 호일 봉투로 옮기고 오토클레이브 테이프로 밀봉합니다.
7. 스트립을 121°C에서 최소 30분 동안 오토클레이브하고 사용할 준비가 될 때까지 보관하십시오.

2. 묘목 준비

1. 씨앗을 살균하고 vernalize.
   1. 100mL 미세원심분리기 튜브에 0.1% 트윈 20을 함유한 50% 표백제 용액 1mL에 최대 1.5개의 애기장대 종자를 현탁하고 5-10분 동안 배양합니다. 무균 상태에서 피펫팅 또는 흡인을 통해 표백제 용액을 제거합니다. 멸균 된 dH₂O 1mL로 씨앗을 헹구십시오. 튜브를 뒤집어 씨앗을 적절하게 헹구고 튜브 상단에 남아있는 표백제 용액을 제거하십시오. 헹굼을 4 번 반복하십시오.
   2. 씨앗이 있는 튜브에 약 0.25mL의 물을 남겨두고 4°C에서 3일 동안 어두운 곳에서 보관합니다.
2. 접목을 준비하기 위해 씨앗을 접시에 담습니다.
   1. 1L의 MS(0.5% 수크로오스) 고체 배지에 대해 800mL의 물에 MS 염 4.4g, 수크로스 5g 및 한천 10g을 혼합하고 KOH로 pH를 5.7로 조정한 후 추가 물로 총 부피를 1L로 가져옵니다. 정사각형 페트리 접시에 ~20mL를 붓기 전에 최소 25분 동안 오토클레이브합니다.
   2. 무균 조건에서 20μL 피펫 팁을 사용하여 적절한 수의 준비된 종자를 플레이트로 옮겨 종자를 흡인하고 옮깁니다.
   3. 종자 위치를 안내하기 위해 플레이트 표면에 멸균 스트립을 놓아 종자가 스트립의 채널과 정렬되도록 합니다. 씨앗이 도금되면 스트립을 제거하십시오.
      알림: 100mm x 100mm 정사각형 플레이트 1개에 두 줄의 묘목을 수용할 수 있습니다(그림 1B).
   4. 플레이트가 세워지면 액체가 고체 매체에서 증발하고 플레이트 바닥에 고이도록 합니다. 씨앗을 접시에 놓은 후 접시 덮개를 덮고 두 줄의 씨앗과 평행한 접시의 한쪽 면( 그림 1B에서 파란색 강조 영역으로 표시됨)을 파라필름으로 밀봉합니다. 파라필름 상단과 플레이트의 다른 모든 가장자리에 통기성 테이프를 감습니다.
3. 파라필름으로 밀봉된 면이 아래를 향하도록 두 개의 플레이트를 조심스럽게 세웁니다. 수평 15mL 원심분리기 튜브를 사이에 놓고 바닥에 있는 두 개의 플레이트를 분리하고 고무 밴드로 고정합니다. 플레이트 표면이 벤치탑 표면과 100°-110° 각도를 이루는지 확인합니다(그림 1C).
4. 묘목 배축이 ~5mm 길이로 자랄 수 있도록 21°C의 완전한 어둠 속에서 72시간 동안 이 방향으로 플레이트를 보관합니다. 72 시간 후, 어둠에서 플레이트를 제거하고 접목하기 전에 동일한 온도에서 2-4 일 동안 16 시간 빛 (100 μE ^{m-2 sec-1}의 강도) 및 8 시간 암흑주기 하에서 성장합니다.
5. 도금 후 5 일에서 7 일 사이에 묘목을 이식하십시오. 묘목 위에 접목 스트립을 놓고 배축을 채널에 맞 춥니 다. 묘목을 부드럽게 배치하여 뿌리-배축 접합부가 실리콘 스트립의 바닥에 위치하도록 하여 묘목을 절단할 준비를 합니다(그림 1D).

3. 접목 절차

1. 70% 에탄올로 해부 내시경을 소독하고 두 쌍의 미세한 팁 집게와 메스 손잡이를 고압 증기멸균하여 멸균 작업 환경을 준비합니다. 모든 접목 절차는 멸균 후드에서 수행하고 필요에 따라 해부 내시경을 사용하여 수행하십시오. 10.5x의 배율을 사용하여 대부분의 접목을 수행합니다.
2. 접순을 준비하십시오. 새 메스 칼날을 사용하여 배축을 수직으로 절단하여 직선으로 깨끗하게 절단합니다. 묘목이 한천으로 밀려나는 것을 방지하기 위해 식물을 누르지 않고 칼날을 앞으로 밉니다(비디오 1).
3. 촬영을 제거하십시오. 미디어 표면과의 접촉을 보장하여 촬영의 절단 부분에 수분을 공급하도록 주의하십시오. 또는 사용할 준비가 될 때까지 멸균 dH₂O로 채워진 페트리 접시 상단과 같은 지정된 보관 영역으로 싹을 옮깁니다.
4. 대목을 준비하십시오. 닫힌 집게 사이의 왼쪽 공간에서 뿌리를 잡고 돌려서 뿌리를 부드럽게 잡아 당겨 뿌리 줄기의 절단 부분을 스트립 중앙에 남겨 둡니다 (비디오 2).
   알림: 깨지기 쉬운 뿌리는 닫힌 집게 사이에서 직접 으깨지면 손상되므로 조직을 조작하려면 핀셋 끝의 날카로운 각도로 뿌리를 쐐기로 고정해야 합니다.
5. 끝이 가는 집게를 사용하여 원하는 촬영을 부드럽게 집어 들고 채널 상단에 삽입합니다.
   참고: 성공적인 이식편을 얻으려면 접목과 대목 사이의 접촉을 육안으로 확인하는 것이 중요합니다(비디오 3).
6. 모든 이식편이 만들어진 후, 파라 필름과 통기성 테이프로 판을 감싸고 묘목이나 실리콘 스트립을 방해하지 않고 이전과 같은 방식으로 판을 설치하십시오. 플레이트를 26 ° C에서 16 시간 라이트 / 8 시간 다크 사이클로 설정된 성장 챔버로 조심스럽게 옮깁니다.
7. 7-10 일 후에 멸균 상태에서 접목 된 묘목을 평가하십시오. 한쪽을 벗겨서 집게를 사용하여 실리콘 스트립을 조심스럽게 제거하여 채널이 묘목을 자유롭게 할 수 있도록합니다. 신선한 메스 칼날로 접순에서 자라고 있는 우발적인 뿌리를 제거하거나 끝이 가는 집게를 사용하여 으깨서 제거합니다. 대목이 접순에 단단히 부착되어 성공적인 이식편을 형성했는지 시각적으로 평가합니다(그림 2).
8. 성공적인 이식편을 묘목 번식 토양으로 옮겨 필요한만큼 오래 자랄 수 있습니다. 묘목이 자리를 잡으면 며칠 동안 투명한 플라스틱으로 토양을 덮으십시오. 식물을 토양으로 옮긴 후 21°C에서 앞서 언급한 명암 주기 하에서 자랍니다.

결과

최소한의 기술이 필요한 최적의 접목 조건을 식별하기 위해 접목 스트립 설계의 다양한 측면을 테스트했습니다(표 1). 모든 접목 시험은 0.5% 슈크로오스 MS 배지 상에서 완료되었으며, 이는 이전에 이상적인 접목 배지인 것으로 보고되었다^11,12.

최적의 묘목 성장은 스트립 발아로 달성 할 수 없습니다
실리...

토론

요약 및 의의
이식편 결합의 형성은 성공적인 접목에 매우 중요하며, 이를 위해서는 대목과 접순 사이의 직접적이고 방해받지 않는 접촉이 필요합니다. 애기장대와 같은 작은 식물 묘목의 미니어처 크기와 취약성으로 인해 이 요구 사항을 충족하는 것이 기술적으로 어렵습니다. 초기 애기장대 묘목 접목 방법에서 개발된 한 가지 기술은 접순과 대목을 짧은 실리콘 튜?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tubes	VWR International Inc	10026-076
ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L	VWR	BJAH010-4
BactoAgar	Sigma	A1296-500g
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit	Dow	2646340
D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg	Fisher Scientific	BP220-1
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500	Fisher Scientific	20901-551 / 05-402
Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-164
Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape	Fisher Scientific	15-901-111
Fisherbrand square petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711A
Leica Zoom 2000 Stereo Microscope	Microscope Central	L-Z2000
Micropore Tape	3M	B0082A9FEM
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519-10L
Parafilm	Genesee Scientific	16-101
potassium hydroxide	VWR International Inc	AA13451-36
Redi-earth Plug and Seedling Mix	Sun Gro Horticulture	SUN239274728CFLP
Scotts Osmocote Plus	Hummert International	7630600
Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade	Fisher Scientific	22-079-697
Tween 20, 500 mL	Fisher Scientific	BP337500
TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM	VWR	102091-580