השתלת שתיל מדרגית, גמישה וחסכונית

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטת השתלת שתילים חזקה שאינה דורשת ניסיון או הכשרה קודמים וניתן לבצע אותה בעלות נמוכה מאוד תוך שימוש בחומרים הנגישים בקלות ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית.

Abstract

השתלת שתילים בשלב מוקדם הפכה לכלי פופולרי בגנטיקה מולקולרית לחקר יחסי שורשים-נבטים בתוך צמחים. השתלת שתילים בשלב מוקדם של צמח המודל הקטן, Arabidopsis thaliana, היא מאתגרת מבחינה טכנית וגוזלת זמן רב בשל גודלם ושבריריותם של שתיליו. אוסף הולך וגדל של שיטות שפורסמו מתארות טכניקה זו עם שיעורי הצלחה משתנים, קושי ועלויות נלוות. מאמר זה מתאר הליך פשוט להכנת מכשיר השתלה לשימוש חוזר פנימי באמצעות תערובת אלסטומרים מסיליקון, וכיצד להשתמש במכשיר זה להשתלת שתילים. בזמן פרסום זה, כל מכשיר השתלה לשימוש חוזר עולה רק $0.47 בחומרים מתכלים לייצר. באמצעות שיטה זו, מתחילים יכולים לקבל שתילים מוצלחים הראשונים שלהם בתוך פחות מ 3 שבועות מתחילתו ועד סופו. הליך נגיש זה יאפשר למעבדות גנטיקה מולקולרית של צמחים לבסס השתלת שתילים כחלק נורמלי מתהליך הניסוי שלהם. בשל השליטה המלאה שיש למשתמשים ביצירה ועיצוב של מכשירי השתלה אלה, טכניקה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לשימוש בצמחים גדולים יותר, כגון עגבניות או טבק, אם תרצה בכך.

Introduction

השתלה היא טכניקת גננות עתיקה שהפכה לפרקטיקה חקלאית מבוססת בשנת 500 לפנה"ס¹. השתלת זנים שונים של צמחי יבול לשיפור היבול הייתה השימוש הראשון בטכניקה זו, וממשיכה לשמש למטרה זו כיום. בעשור האחרון, השתלה משכה כמות הולכת וגדלה של תשומת לב ככלי עבור ביולוגים מולקולריים לחקור איתות למרחקים ארוכים בצמחים 2,3,4,5. בעוד שהשתלת צמחים בוגרים היא קלה יחסית, השתלת צמחים זמן קצר לאחר הנביטה היא מאתגרת. למרות זאת, לעיתים נדרש להעריך את ההשפעות של איתות למרחקים ארוכים בתהליכים כגון התפתחות צמחים, תגובות סביבתיות ופריחה ^6,7,8.

Arabidopsis thaliana נקבע כאורגניזם מודל בביולוגיה של צמחים מסיבות רבות, כולל גודלו הקטן יחסית, מה שהופך אותו קל לגדול בתוך מעבדה. עם זאת, גודלם הקטן ושבריריותם של שתילי ארבידופסיס הופכים את השתלת שתילים צעירים למאתגרת מאוד. במקרים רבים, נדרשת הכשרה מעשית נרחבת כדי להשיג בהצלחה שתלי שתילים. במהלך השנים חלו שיפורים מתודולוגיים רבים שזיהו תנאי גידול אידיאליים וטכניקות חדשות להגדלת שיעור ההצלחה של השתלת שתילים 9,10,11. הכלי האחרון שהוצג היה שבב השתלת שתיל Arabidopsis, המאפשר גם למשתמשים חסרי ניסיון להשיג רמות מקובלות של הצלחת השתלה¹². בעוד התקדמות זו הורידה משמעותית את המחסום הטכני של השתלת שתילים, מכשיר השבב יקר, ומספר השתלים שניתן לבצע במקביל הופך במהירות ליקר ביותר.

בנוסף, מכשיר זה יכול לשמש רק עבור שתילי Arabidopsis שיש להם ממדים hypocotyl הדומים שתילים מסוג בר. בעוד ארבידופסיס הוא מין אבן היסוד בעולם הגנטיקה המולקולרית של הצמח, לאחרונה נעשתה עבודה במינים אחרים באמצעות השתלת שתילים. דוגמאות לכך כוללות השתלת פולי סויה והשעועית הנפוצה, טבק לעגבנייה וקנולה לארבידופסיס, ולאחר מכן דגימת שתי הרקמות עבור רנ"א קטן^13,14. לכן, שיטת השתלה הנגישה לרוב המעבדות וניתנת להתאמה בקלות למגוון רחב של מיני צמחים ללא שינויים משמעותיים בטכניקה היא רצויה ביותר.

פרוטוקול זה מפרט שיטה המשתמשת בייצור פנימי של מכשיר השתלה פשוט המאפשר התאמה אישית מלאה של קוטר ואורך תעלת השתלה כדי להתאים לכל מורפולוגיית שתיל ברוב מיני הצמחים. הייצור של מכשירים אלה הוא זול מאוד מדרגי מאוד, כמו הרכיבים היחידים הדרושים הם אלסטומר סיליקון, חיווט או צינורות בגודל הנכון, להב דיוק גבוה, מיכל לשמש תבנית. בעקבות פרוטוקול ההשתלה המפורט כאן, משתמשים יכולים להשיג שיעורי השתלה מוצלחים של 45% (n = 105), בדומה לתוצאות ההשתלה שדווחו בעבר^10,12.

Protocol

1. הכנת המכשיר

1. הפוך את מכשיר השתלת הסיליקון על ידי יציקת תמיסת אלסטומר סיליקון בצלחת פטרי מרובעת (100 מ"מ x 100 מ"מ). הכן 15 מ"ל של תמיסת האלסטומר, בהתאם להנחיות היצרן.
   הערה: ערכות אלסטומרים מסיליקון כוללות בדרך כלל נוזל על בסיס סיליקון וחומר ריפוי, שכאשר מערבבים אותם יחד מאפשרים לסיליקון להתמצק.
2. הכינו את צלחת הפטרי המרובעת על-ידי הנחת ארבע חתיכות ישרות של חוט 29 G בצלחת הפטרי המרובעת, במרחק שווה זו מזו (איור 1A). ודא כי החוט שוכב סומק עם החלק התחתון של התבנית. כדי ליישר את החוט במלואו, גלגלו אותו על משטח אחיד וקשיח עם חפץ כבד ושטוח (למשל, מתלה צינורות מתכת).
   הערה: עניבות פיתול מכילות לרוב חוט 29 G וניתן להשתמש בהן לאחר הסרת ציפוי הנייר החיצוני באצטון.
3. יוצקים את תמיסת האלסטומר הסיליקון המעורבת על גבי החוטים ומכסים בחלק העליון של צלחת הפטרי. תנו לסיליקון להחלים במשך 24-48 שעות בטמפרטורת החדר.
4. מוציאים את יריעת הסיליקון מצלחת הפטרי בעזרת מלקחיים נקיים ועוברים למשטח שטוח ונקי.
5. הסירו את החוטים מיריעת הסיליקון. הסירו את שכבת הסיליקון הדקה שנותרה בצד החיצוני של התעלה בעזרת מלקחיים דקיקים, כדי לאפשר לתעלה להיות פתוחה בצד אחד (איור 1A).
6. חותכים את יריעת הסיליקון בניצב לתעלות לרצועות 3 מ"מ באמצעות מספריים נקיים. מעבירים כל רצועה למעטפת רדיד אלומיניום ואוטמים בסרט הדבקה אוטומטי.
7. יש למרוח את הרצועות בטמפרטורה של 121°C למשך 30 דקות לפחות ולאחסן עד שהן מוכנות לשימוש.

2. הכנת שתילים

1. לעקר ולוונליזציה של זרעים.
   1. יש להשהות עד 100 זרעי Arabidopsis ב-1 מ"ל של תמיסת אקונומיקה 50% המכילה 0.1% Tween 20 בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, ולדגור במשך 5-10 דקות. מוציאים את תמיסת האקונומיקה באמצעות צנרת או שאיפה בתנאים סטריליים. שטפו את הזרעים עם 1 מ"ל של dH₂O. הקפידו להפוך את הצינורות כדי לשטוף כראוי את הזרעים ולהסיר כל תמיסת אקונומיקה שנותרה בחלק העליון של הצינור. חזור על השטיפה 4x.
   2. השאירו כ 0.25 מ"ל מים בצינורות עם הזרעים ולאחסן ב 4 °C במשך 3 ימים בחושך.
2. מקציפים את הזרעים כהכנה להשתלה.
   1. הכינו צלחת אגר MS 1% כדלקמן: עבור 1 ליטר של MS (0.5% סוכרוז) מוצק בינוני, מערבבים 4.4 גרם מלח MS, 5 גרם סוכרוז ו 10 גרם אגר ב 800 מ"ל מים, להתאים את ה- pH ל 5.7 עם KOH, ולאחר מכן להביא את נפח הכולל ל 1 L עם מים נוספים. Autoclave לפחות 20, דקה לפני לשפוך ~ 25 מ"ל לתוך צלחת פטרי מרובע.
   2. בתנאים סטריליים, העבירו את המספר המתאים של זרעים מוכנים לצלחת, בעזרת קצה פיפטה של 20 μL כדי לשאוף ולהעביר את הזרעים.
   3. הניחו רצועה סטרילית על משטח הצלחת כדי לכוון את מיקום הזרעים, כך שהזרעים מיושרים עם התעלות שעל הרצועה. מוציאים את הרצועה ברגע שהזרעים מצופים.
      הערה: צלחת מרובעת אחת בגודל 100 מ"מ x 100 מ"מ יכולה להכיל שתי שורות שתילים (איור 1B).
   4. ברגע שהצלחות עומדות, הניחו לנוזל להתאדות מתוך התווך המוצק והצטברו בתחתית הצלחת. לאחר שהזרעים מונחים על הצלחת, הניחו על מכסה הצלחת ואטמו צד אחד של הצלחת המקביל לשתי שורות הזרעים (מסומן על-ידי האזור המסומן בכחול באיור 1B) באמצעות פרפילם. עטפו סרט נושם על גבי הפרפילם וסביב כל שאר הקצוות של הצלחת.
3. העמידו בזהירות שתי צלחות כשהצד האטום בפרפילם פונה כלפי מטה. הפרידו את שני הלוחות בתחתית על ידי הנחת צינור צנטריפוגה אופקי של 15 מ"ל ביניהם והדקו באמצעות גומייה. ודא שמשטחי הלוחות יוצרים זווית של 100°-110° עם משטח הספסל (איור 1C).
4. אחסן את הצלחות בכיוון זה במשך 72 שעות בחושך מוחלט ב 21 ° C, כדי לאפשר hypocotyls שתיל לגדול ~ 5 מ"מ אורך. לאחר 72 שעות, הסר את הלוחות מהחושך וגדל תחת 16 שעות אור (עוצמה של 100 μE m-2 sec-1) ו 8 שעות מחזורים כהים במשך ^2-4 ימים נוספים באותה טמפרטורה לפני grafting.
5. שתל את השתילים בין 5 ל 7 ימים לאחר צלחת. מניחים רצועת השתלה מעל השתילים, ומתאימים את ההיפוקוטיל שלהם לתעלות. מקמו בעדינות את השתיל כך שצומת השורשים-היפוקוטיל ימוקם בתחתית רצועת הסיליקון כדי להכין את השתיל לחיתוך (איור 1D).

3. הליך השתלה

1. הכינו סביבת עבודה סטרילית על ידי חיטוי היקף דיסקציה עם 70% אתנול וחציבה אוטומטית של שני זוגות מלקחיים עדינים וידית אזמל. יש לבצע את כל הליכי ההשתלה במכסה מנוע סטרילי ובעזרת היקף דיסקציה לפי הצורך. בצע את רוב ההשתלה באמצעות הגדלה של פי 10.5.
2. הכינו את השריגים. השתמש בלהב אזמל טרי כדי לחתוך את ההיפוקוטיל בניצב כדי ליצור חתך ישר ונקי. דחפו את הלהב קדימה במקום ללחוץ למטה לתוך הצמח כדי למנוע מהשתיל להידחף לתוך האגר (סרטון 1).
3. הסר את הצילומים. הקפד לשמור על החלק החתוך של הצילום hydrated על ידי הבטחת מגע עם משטח התקשורת. לחלופין, העבירו את הנבטה לאזור החזקה ייעודי, כגון החלק העליון של צלחת פטרי מלאה ב-dH₂O סטרילי, עד שהיא מוכנה לשימוש.
4. הכינו את השורשים. משכו בעדינות את השורש על ידי תפיסת השורש ברווח שנותר בין המלקחיים הסגורים וסיבובם, תוך השארת החלק החתוך של השורשים באמצע הרצועה (סרטון 2).
   הערה: השורש השביר ייפגע אם יימעך ישירות בין המלקחיים הסגורים, מה שיצריך לקשור את השורש בזווית החדה של קצות הפינצטה כדי לתפעל את הרקמה.
5. הרימו בעדינות את הצילום הרצוי באמצעות המלקחיים העדינים והכניסו לחלק העליון של הערוץ.
   הערה: קריטי לאשר באופן חזותי את המגע בין הגזעים לשורשים כדי להשיג שתל מוצלח (סרטון 3).
6. לאחר שכל השתלים נעשו, עטפו את הצלחות בפרפילם ובסרט נושם והקימו את הצלחות באותו אופן כמו קודם, מבלי להפריע לשתילים או לרצועות הסיליקון. בזהירות להעביר את הלוחות לתא צמיחה להגדיר על 26 ° C עם 16 שעות אור / 8 שעות מחזורים כהים.
7. להעריך את השתילים המושתלים בתנאים סטריליים לאחר 7-10 ימים. בזהירות להסיר את רצועת הסיליקון באמצעות מלקחיים על ידי קילוף צד אחד, המאפשר את התעלות לשחרר את השתילים. הסר את כל השורשים ההרפתקניים הצומחים מן הנצר על ידי חיתוך אותם מן הנצר עם להב אזמל טרי או ריסוק אותם באמצעות מלקחיים עדינים. העריכו ויזואלית אם השורש נצמד היטב לנצר כדי ליצור שתל מוצלח (איור 2).
8. העבר שתלים מוצלחים לאדמת ריבוי שתילים כדי לגדול כל עוד נדרש. מכסים את האדמה בפלסטיק שקוף למשך מספר ימים עם התבססות השתילים. לאחר העברת הצמחים לאדמה, לגדול תחת מחזורי אור וחושך שהוזכרו לעיל ב 21 °C (75 °F).

תוצאות

היבטים שונים של עיצוב רצועת ההשתלה נבדקו כדי לזהות את תנאי ההשתלה האופטימליים הדורשים את המיומנות הטכנית הנמוכה ביותר (טבלה 1). כל ניסויי ההשתלה הושלמו על 0.5% סוכרוז MS בינוני, אשר דווח בעבר כמדיום השתלה אידיאלי^11,12.

לא ניתן להשיג גי...

Discussion

סיכום ומשמעות
יצירת איחוד שתלים היא קריטית להשתלה מוצלחת, הדורשת מגע ישיר ובלתי מופרע בין השורש לסיון. הגודל המיניאטורי והשבריריות של שתילים של צמחים קטנים כגון Arabidopsis עושה את זה מאתגר מבחינה טכנית כדי לענות על דרישה זו. טכניקה אחת שפותחה בשיטות השתלת שתיל ארבידופסיס ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tubes	VWR International Inc	10026-076
ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L	VWR	BJAH010-4
BactoAgar	Sigma	A1296-500g
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit	Dow	2646340
D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg	Fisher Scientific	BP220-1
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500	Fisher Scientific	20901-551 / 05-402
Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-164
Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape	Fisher Scientific	15-901-111
Fisherbrand square petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711A
Leica Zoom 2000 Stereo Microscope	Microscope Central	L-Z2000
Micropore Tape	3M	B0082A9FEM
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519-10L
Parafilm	Genesee Scientific	16-101
potassium hydroxide	VWR International Inc	AA13451-36
Redi-earth Plug and Seedling Mix	Sun Gro Horticulture	SUN239274728CFLP
Scotts Osmocote Plus	Hummert International	7630600
Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade	Fisher Scientific	22-079-697
Tween 20, 500 mL	Fisher Scientific	BP337500
TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM	VWR	102091-580