スケーラブルで柔軟性があり、費用対効果の高い苗接ぎ木

要約

このプロトコルは、事前の経験やトレーニングを必要とせず、ほとんどの分子生物学ラボで簡単にアクセスできる材料を使用して非常に低コストで実行できる堅牢な苗接ぎ木方法について説明しています。

要約

初期段階の苗の接ぎ木は、植物内の根とシュートの関係を研究するための分子遺伝学の人気のあるツールになっています。小型モデル植物である シロイヌナズナの初期段階の苗木の接ぎ木は、その苗木のサイズと脆弱性のために技術的に困難で時間がかかります。公開されているメソッドのコレクションが増えており、成功率、難易度、および関連するコストがさまざまでこの手法について説明しています。本稿では,シリコーンエラストマーミックスを用いて社内で再利用可能な接ぎ木装置を作る簡単な手順と,この装置を苗接ぎ木に使用する方法について述べる.この出版物の時点では、各再利用可能なグラフトデバイスの製造には、消耗品のコストはわずか0.47ドルです。この方法を使用すると、初心者は最初から最後まで3週間以内に最初の苗木をうまく接ぎ木することができます。この非常にアクセスしやすい手順により、植物分子遺伝学ラボは、実験プロセスの通常の部分として苗の接ぎ木を確立することができます。ユーザーがこれらの接ぎ木装置の作成と設計を完全に制御できるため、この技術は、必要に応じてトマトやタバコなどのより大きな植物で使用するために簡単に調整できます。

概要

接ぎ木は、紀元前500年までに確立された農業慣行となった古代の園芸技術^です1。収量を改善するためにさまざまな種類の作物を接ぎ木することは、この技術の最初の使用であり、今日でもこの目的のために使用され続けています。過去10年間で、接ぎ木は、分子生物学者が植物の長距離シグナル伝達を研究するためのツールとしてますます注目を集めています2,3,4,5。成体植物の接ぎ木は比較的簡単ですが、発芽後すぐに植物を接ぎ木することは困難です。それにもかかわらず、植物の発育、環境応答、開花などのプロセスにおける長距離シグナル伝達の影響を評価する必要がある場合があります^6,7,8。

シロイヌナズナは、植物生物学のモデル生物として確立されており、サイズが比較的小さく、実験室内で成長しやすいなど、さまざまな理由から確立されています。しかし、シロイヌナズナの苗のサイズが小さくてもろいため、幼苗の接ぎ木は非常に困難です。多くの場合、苗の接ぎ木をうまく入手するには、広範な実践的なトレーニングが必要です。何年にもわたって多くの方法論的改善が行われ、理想的な成長条件と苗接ぎ木の成功率を高めるための新しい技術が特定されてきました9,10,11。導入された最新のツールはシロイヌナズナの苗接ぎ木チップで、経験の浅いユーザーでも許容レベルの接ぎ木成功を達成できます¹²。この進歩により、苗接ぎ木の技術的障壁は大幅に低下しましたが、チップデバイスは高価であり、並行して迅速に実行できる移植の数は法外なコストになります。

さらに、この装置は、野生型の苗に似た胚軸寸法を有するシロイヌナズナの苗にのみ使用できます。シロイヌナズナは植物分子遺伝学の世界の要種ですが、最近は他の種でも苗接ぎ木を用いた研究が行われています。例としては、ダイズと一般豆の接ぎ木、トマトへのタバコ、シロイヌナズナへのキャノーラの接ぎ木、続いて低分子RNAについて両方の組織をサンプリングすることが含まれます^13,14。したがって、ほとんどの実験室が利用でき、大きな技術を変更することなく幅広い植物種に容易に適応できる接ぎ木法が非常に望ましい。

このプロトコルは、ほとんどの植物種にわたるあらゆる苗形態に対応するために接ぎ木チャネルの直径と長さの完全なカスタマイズを可能にする単純な接ぎ木装置の社内生産を採用する方法を詳述しています。必要なコンポーネントは、シリコーンエラストマー、正しいサイズの配線またはチューブ、高精度のブレード、および金型として機能する容器だけであるため、これらのデバイスの製造は非常に手頃な価格で非常にスケーラブルです。ここで詳述するグラフトプロトコールに従って、ユーザは、以前に報告されたグラフト結果に匹敵する45%(n = 105)の成功したグラフト率を達成することができる^10,12。

プロトコル

1.デバイスの準備

1. 正方形のペトリ皿(100 mm x 100 mm)にシリコーンエラストマー溶液をキャストして、シリコーングラフトデバイスを作成します。製造元のガイドラインに従って、15 mLのエラストマー溶液を調製します。
   注意: シリコーンエラストマーキットには通常、シリコーンベースの液体と硬化剤が含まれており、混合するとシリコーンが固化します。
2. 正方形のペトリ皿に29Gのワイヤーの4つの直線片を互いに等距離に置いて、正方形のペトリ皿を準備します(図1A)。ワイヤが金型の底面と同じ高さになっていることを確認します。ワイヤーを完全にまっすぐにするには、重くて平らな物体(金属製のチューブラックなど)のある硬くて均一な表面にワイヤーを転がします。
   注意: ツイストタイには29Gのワイヤーが含まれていることが多く、アセトンで外側の紙のコーティングを取り除いた後に使用できます。
3. 混合シリコーンエラストマー溶液をワイヤーの上に注ぎ、ペトリ皿の上部で覆います。シリコーンを室温で24〜48時間硬化させます。
4. きれいな鉗子を使用してペトリ皿からシリコンシートを取り除き、きれいな平らな面に移動します。
5. シリコンシートからワイヤーを取り外します。チャネルの外側に残っているシリコーンの薄層を細かい点鉗子で取り除き、チャネルの片側が開くようにします(図1A)。
6. 清潔なはさみを使用して、シリコンシートをチャネルに対して垂直に3 mmのストリップにカットします。各ストリップをアルミホイル封筒に移動し、オートクレーブテープで密封します。
7. ストリップを121°Cで少なくとも30分間オートクレーブし、使用できるようになるまで保管します。

2.苗の準備

1. 種子を殺菌して春化する。
   1. シ ロイヌナ ズナの種子100個まで、0.1%Tween 20を含む50%漂白剤溶液1 mLに1.5 mLマイクロ遠心チューブに懸濁し、5〜10分間インキュベートします。無菌条件下でピペッティングまたは吸引によって漂白剤溶液を除去します。1mLの滅菌dH₂Oで種子をすすぎ、チューブをひっくり返して種子を適切にすすぎ、チューブの上部に残っている漂白剤溶液を取り除きます。すすぎを4回繰り返します。
   2. 種子を入れたチューブに約0.25 mLの水を残し、4°Cで暗所で3日間保存します。
2. 接ぎ木に備えて種子を盛り付けます。
   1. 1LのMS(0.5%スクロース)固体培地に対して、MS塩4.4g、スクロース5g、寒天10gを800mLの水に混合し、KOHでpHを5.7に調整し、さらに水で全量を1Lにします。オートクレーブを少なくとも20分間行い、~25 mLを正方形のペトリ皿に注ぎます。
   2. 無菌条件下で、20 μLのピペットチップを使用して、適切な数の準備されたシードをプレートに移動し、シードを吸引して移します。
   3. 種子の位置決めをガイドするためにプレート表面に滅菌ストリップを置き、種子がストリップ上のチャネルに整列するようにします。種がメッキされたらストリップを取り除きます。
      注意: 1つの100 mm x 100 mmの正方形のプレートは、2列の苗を収容できます(図1B)。
   4. プレートが立ったら、液体を固体培地から蒸発させ、プレートの底に溜めます。種子をプレート上に置いた後、プレートカバーの上に置き、2列の種子に平行なプレートの片側( 図1Bの青色の強調表示された領域で示されている)をパラフィルムで密封します。パラフィルムの上とプレートの他のすべての端に通気性テープを巻きます。
3. パラフィルムシール面を下に向けて2枚のプレートを慎重に立てます。水平の15 mL遠心チューブをそれらの間に置き、輪ゴムで固定することにより、下部の2つのプレートを分離します。プレートの表面がベンチトップの表面と100°〜110°の角度を形成していることを確認します(図1C)。
4. プレートをこの向きにして21°Cの全暗所で72時間保存し、苗の胚軸の長さが~5mmになるようにします。72時間後、プレートを暗所から取り出し、移植前に同じ温度でさらに2〜4日間、16時間の光(100μE ^{m-2 sec-1}の強度)および8時間の暗サイクル下で成長させる。
5. 播種後5〜7日で苗を接ぎ木します。苗の上に接ぎ木ストリップを置き、それらの胚軸をチャネルに取り付けます。根と胚軸の接合部がシリコンストリップの下部に配置されるように苗をそっと配置して、苗を刈り取りの準備をします(図1D)。

3.接ぎ木手順

1. 解剖スコープを70%エタノールで消毒し、2対の細い先端の鉗子とメスのハンドルをオートクレーブ滅菌することにより、無菌の作業環境を準備します。滅菌フード内で、必要に応じて解剖スコープを使用して、すべての移植手順を実行します。10.5倍の倍率を使用してほとんどのグラフトを実行します。
2. 穂木を準備します。新しいメスの刃を使用して胚軸を垂直にカットし、まっすぐなきれいなカットを作成します。苗が寒天に押し込まれるのを防ぐために、植物に押し下げるのではなく、ブレードを前方に押します(ビデオ1)。
3. シュートを削除します。メディア表面との接触を確実にすることにより、シュートのカット部分を水和させるように注意してください。あるいは、使用できるようになるまで、滅菌dH₂Oで満たされたペトリ皿の上部などの指定された保持領域にシュートを移動します。
4. 台木を準備します。閉じた鉗子の間に残ったスペースに根をつかんで回し、台木の切断部分をストリップの中央に残して、根をそっと引っ張ります(ビデオ2)。
   注意: 閉じた鉗子の間で直接押しつぶされると、壊れやすい根が損傷するため、組織を操作するためにピンセットの端の鋭角で根をくさびで留める必要があります。
5. 細い先端の鉗子を使用して目的のシュートをそっと拾い上げ、チャネルの上部に挿入します。
   注意: 接ぎ木を成功させるには、接ぎ穂と台木の間の接触を視覚的に確認することが重要です(ビデオ3)。
6. すべての移植片ができたら、パラフィルムと通気性テープでプレートを包み、苗やシリコンストリップを邪魔することなく、以前と同じ方法でプレートをセットアップします。プレートを26°Cに設定された成長チャンバーに慎重に移動し、16時間の明/8時間の暗サイクルを行います。
7. 7〜10日後に無菌条件下で接ぎ木苗を評価します。片側をはがして鉗子を使用してシリコンストリップを慎重に取り外し、チャネルが苗を解放できるようにします。接ぎ穂から生えている不定根を新鮮なメスの刃で切り取るか、細い先端の鉗子を使って押しつぶして取り除きます。台木が接ぎ穂にしっかりと付着して移植片を形成したかどうかを視覚的に評価します(図2)。
8. 成功した接ぎ木を苗繁殖土壌に移動して、必要なだけ成長します。苗が確立されたら、数日間透明なプラスチックで土を覆います。植物を土壌に移した後、前述の明暗サイクルで21°Cで生育します。

結果

グラフトストリップの設計のさまざまな側面をテストして、最小限の技術的スキルを必要とする最適なグラフト条件を特定しました(表1)。全ての移植試験は、理想的な移植培地であることが以前に報告されている0.5%スクロースMS培地上で完了した^11、12。

最適な苗の成長は、ストリップ上の発芽では達成でき?...

ディスカッション

概要と意義
接ぎ木組合の形成は接ぎ木を成功させるために重要であり、それは台木と接ぎ穂との間の直接かつ邪魔されない接触を必要とする。シロイヌナズナなどの小さな植物の苗のミニチュアサイズと脆弱性は、この要件を満たすことを技術的に困難にします。初期のシロイヌナズナ苗接ぎ木法で開発された1つの技術は、接ぎ木接合^部10を支?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tubes	VWR International Inc	10026-076
ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L	VWR	BJAH010-4
BactoAgar	Sigma	A1296-500g
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit	Dow	2646340
D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg	Fisher Scientific	BP220-1
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500	Fisher Scientific	20901-551 / 05-402
Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-164
Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape	Fisher Scientific	15-901-111
Fisherbrand square petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711A
Leica Zoom 2000 Stereo Microscope	Microscope Central	L-Z2000
Micropore Tape	3M	B0082A9FEM
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519-10L
Parafilm	Genesee Scientific	16-101
potassium hydroxide	VWR International Inc	AA13451-36
Redi-earth Plug and Seedling Mix	Sun Gro Horticulture	SUN239274728CFLP
Scotts Osmocote Plus	Hummert International	7630600
Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade	Fisher Scientific	22-079-697
Tween 20, 500 mL	Fisher Scientific	BP337500
TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM	VWR	102091-580