可扩展、灵活且经济高效的育苗嫁接

摘要

该协议描述了一种强大的幼苗嫁接方法，该方法不需要先前的经验或培训，并且可以使用大多数分子生物学实验室中易于获得的材料以非常低的成本执行。

摘要

早期幼苗嫁接已成为分子遗传学中研究植物内根冠关系的流行工具。小型模式植物拟 南芥的早期幼苗嫁接由于其幼苗的大小和脆弱性，在技术上具有挑战性且耗时。越来越多的已发表方法描述了这种技术，其成功率、难度和相关成本各不相同。本文介绍了使用有机硅弹性体混合物制作内部可重复使用接枝装置的简单程序，以及如何使用该装置进行幼苗嫁接。在本文发布时，每个可重复使用的嫁接设备的生产消耗材料成本仅为0.47美元。使用这种方法，初学者可以在不到 3 周的时间内从开始到结束获得他们的第一个成功嫁接的幼苗。这种高度可访问的程序将使植物分子遗传学实验室能够将幼苗嫁接作为其实验过程的正常部分。由于用户可以完全控制这些嫁接设备的创建和设计，如果需要，可以很容易地调整这种技术以用于较大的植物，如番茄或烟草。

引言

嫁接是一种古老的园艺技术，在公元前⁵⁰⁰ 年成为一种既定的农业实践 1.嫁接不同品种的作物以提高产量是该技术的首次使用，并且今天继续用于此目的。在过去的十年中，嫁接作为分子生物学家^{研究植物长}距离信号传导的工具引起了越来越多的关注2，³，^4，5。虽然嫁接成年植物相对容易，但在发芽后不久嫁接植物具有挑战性。尽管如此，有时需要评估长距离信号在植物发育、环境响应和开花等过程中的影响⁶，^7，8.

拟南芥已被确定为植物生物学中的模式生物，原因有很多，包括其相对较小的尺寸，使其易于在实验室内生长。然而，拟南芥幼苗的体积小且脆弱，使得嫁接幼苗非常具有挑战性。在许多情况下，需要大量的实践培训才能成功获得幼苗移植物。多年来，已经有许多方法上的改进，已经确定了理想的生长条件和新技术，以提高幼苗嫁接的成功率⁹，^10，11。最新推出的工具是拟南芥幼苗嫁接芯片，即使是没有经验的用户也能达到可接受的嫁接成功水平¹²。虽然这一进步大大降低了幼苗嫁接的技术门槛，但芯片装置价格昂贵，并且可以并行进行的移植数量很快变得成本高昂。

此外，该装置只能用于下胚轴尺寸与野生型幼苗相似的 拟南芥 幼苗。虽然 拟南芥 是植物分子遗传学领域的关键物种，但最近的工作已经在其他物种中使用幼苗嫁接完成。例子包括将大豆和普通豆、烟草嫁接到番茄、油菜嫁接到拟 南芥，随后对两种组织进行小 RNA^13，14 的采样。因此，非常需要一种大多数实验室都可以使用的嫁接方法，并且可以很容易地适应各种植物物种，而无需任何重大的技术变化。

该协议详细介绍了一种采用内部生产简单嫁接装置的方法，该方法允许完全定制嫁接通道直径和长度，以适应大多数植物物种的任何幼苗形态。这些设备的生产非常实惠且高度可扩展，因为唯一需要的组件是有机硅弹性体、正确尺寸的布线或管子、高精度刀片和用作模具的容器。按照此处详述的嫁接方案，用户可以实现45%的成功嫁接率（n = 105），与先前报道的嫁接结果相当^10，12。

研究方案

1. 设备准备

1. 通过将有机硅弹性体溶液浇注在方形培养皿（100 mm x 100 mm）中来制作有机硅接枝装置。按照制造商的指南准备 15 mL 弹性体溶液。
   注意:有机硅弹性体套件通常包括有机硅基液体和固化剂，当混合在一起时，有机硅会凝固。
2. 通过在方形培养皿中铺设四根直的29G线来准备方形培养皿，彼此等距（图1A）。确保电线与模具底部齐平。要完全拉直电线，请用重而扁平的物体（例如，金属管架）将其在坚硬均匀的表面上滚动。
   注意:扎带通常包含 29 G 线，可在用丙酮去除外层纸张涂层后使用。
3. 将混合的有机硅弹性体溶液倒在电线的顶部，并用培养皿的顶部覆盖。让硅胶在室温下固化24-48小时。
4. 使用干净的镊子从培养皿中取出硅胶片，然后移动到干净的平坦表面上。
5. 从硅胶片上取下电线。用细点镊子去除残留在通道外部的薄层硅胶，使通道在一侧打开（图1A）。
6. 使用干净的剪刀将硅胶片垂直于通道切成 3 毫米的条状。将每条带到铝箔信封上，并用高压釜胶带密封。
7. 将条带在121°C高压灭菌至少30分钟并储存直至准备使用。

2. 育苗准备

1. 对种子进行消毒和春化。
   1. 将多达 100 个 拟南芥 种子悬浮在 1 mL 含有 0.1% 吐温 20 的 1 mL 50% 漂白剂溶液中，在 1.5 mL 微量离心管中，并孵育 5-10 分钟。在无菌条件下通过移液或抽吸除去漂白剂溶液。用 1 mL 灭菌的 dH₂O 冲洗种子，确保倒置试管以充分冲洗种子并去除留在试管顶部的任何漂白剂溶液。重复冲洗4次。
   2. 在装有种子的管中留下约0.25mL的水，并在4°C下在黑暗中储存3天。
2. 将种子铺板以准备嫁接。
   1. 准备1%琼脂MS平板如下:对于1L MS（0.5%蔗糖）固体培养基，将4.4gMS盐，5g蔗糖和10g琼脂混合在800mL水中，用KOH将pH调节至5.7，然后用额外的水使总体积达到1L。高压灭菌至少20，分钟，然后将~25mL倒入方形培养皿中。
   2. 在无菌条件下，使用20μL移液器吸出并转移种子，将适当数量的准备好的种子移动到平板上。
   3. 将无菌条放在板表面上以引导种子定位，使种子与条带上的通道对齐。种子铺板后取下条带。
      注意:一个 100 mm x 100 mm 的方形板可容纳两排幼苗（图 1B）。
   4. 板站立后，让液体从固体介质中蒸发出来并汇集在板底部。将种子放入平板上后，放在板盖上，并用封口膜密封与两排种子平行的板的一侧（ 由图1B中的蓝色突出显示区域表示）。将透气胶带缠绕在封口膜的顶部和盘子的所有其他边缘周围。
3. 小心地站立两块板，封口膜密封的一面朝下。通过在底部放置一个水平的 15 mL 离心管来分隔底部的两个板，并用橡皮筋固定。确保板表面与台面形成 100°-110° 角（图 1C）。
4. 将板以该方向在21°C下完全黑暗中储存72小时，以使幼苗下胚轴长~5mm长。72小时后，从黑暗中取出板，并在16小时光照（强度为100μE m -^{2 sec-1}）和8小时黑暗循环下在相同温度下再生长^2-4天，然后再嫁接。
5. 在接种后 5 至 7 天之间嫁接幼苗。在幼苗上放置嫁接条，将它们的下胚轴放入通道中。轻轻定位幼苗，使根-下胚轴连接处位于硅胶条的底部，以准备切割幼苗（图1D）。

3. 移植程序

1. 通过用70%乙醇消毒解剖镜并高压灭菌两对细尖镊子和手术刀手柄来准备无菌工作环境。根据需要在无菌罩中并借助解剖镜执行所有移植程序。使用10.5倍的放大倍率进行大部分移植。
2. 准备接穗。使用新鲜的手术刀刀片垂直切割下胚轴，以形成笔直干净的切割。向前推动叶片而不是向下压入植物，以防止幼苗被推入琼脂（视频1）。
3. 取下嫩芽。通过确保与介质表面接触，注意保持芽的切割部分水分。或者，将芽移动到指定的保持区域，例如装满无菌dH₂O的培养皿的顶部，直到准备使用。
4. 准备砧木。通过在闭合的镊子之间的剩余空间中抓住根并转动它们来轻轻拉动根部，将砧木的切割部分留在条带的中间（视频2）。
   注意:如果直接在闭合的镊子之间压碎，脆弱的根部将损坏，因此需要在镊子末端的尖角处楔入根部以操纵组织。
5. 使用细尖镊子轻轻地拿起所需的芽，然后插入通道顶部。
   注意:目视确认接穗和砧木之间的接触以获得成功的移植至关重要（视频3）。
6. 完成所有移植后，用封口膜和透气胶带包裹板，并以与以前相同的方式设置板，而不会干扰幼苗或硅胶条。小心地将板移动到设定在26°C的生长室中，具有16小时光照/ 8小时黑暗循环。
7. 7-10天后在无菌条件下评估嫁接幼苗。用镊子小心地取出硅胶条，剥开一侧，让通道释放幼苗。用新鲜的手术刀刀片从接穗上切下接穗，或使用细尖镊子压碎它们，以去除从接穗上生长的任何不定根。目视评估砧木是否已牢固地附着在接穗上以形成成功的移植物（图2）。
8. 将成功的嫁接物移动到幼苗繁殖土壤上，以便根据需要生长。随着幼苗的建立，用透明塑料覆盖土壤几天。将植物转移到土壤中后，在前面提到的21°C的光照和黑暗循环下生长。

结果

对接枝条设计的各个方面进行了测试，以确定需要最少技术技能的最佳接枝条件（表1）。所有嫁接试验均在0.5%蔗糖MS培养基上完成，该培养基先前已被报道为理想的接枝培养基^11，12。

条上发芽无法实现最佳幼苗生长
在硅胶条的第一次迭代中，将电线从硅胶片上取下后留在带材通道背面的薄层硅胶制成?...

讨论

总结和意义
嫁接愈合的形成对于成功嫁接至关重要，这需要砧木和接穗之间直接且不受干扰的接触。拟南芥等小型植物幼苗的微型尺寸和脆弱性使得满足这一要求在技术上具有挑战性。在早期拟南芥幼苗嫁接方法中开发的一种技术是将接穗和砧木插入短硅胶管圈中以支撑移植连接¹⁰。虽然这种方法在保护两个移植部分不分离方面非常有效，但将脆弱?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tubes	VWR International Inc	10026-076
ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L	VWR	BJAH010-4
BactoAgar	Sigma	A1296-500g
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit	Dow	2646340
D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg	Fisher Scientific	BP220-1
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500	Fisher Scientific	20901-551 / 05-402
Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-164
Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape	Fisher Scientific	15-901-111
Fisherbrand square petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711A
Leica Zoom 2000 Stereo Microscope	Microscope Central	L-Z2000
Micropore Tape	3M	B0082A9FEM
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519-10L
Parafilm	Genesee Scientific	16-101
potassium hydroxide	VWR International Inc	AA13451-36
Redi-earth Plug and Seedling Mix	Sun Gro Horticulture	SUN239274728CFLP
Scotts Osmocote Plus	Hummert International	7630600
Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade	Fisher Scientific	22-079-697
Tween 20, 500 mL	Fisher Scientific	BP337500
TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM	VWR	102091-580