Enxertia de mudas escalável, flexível e econômica

Resumo

Este protocolo descreve um método robusto de enxertia de plântulas que não requer experiência ou treinamento prévio e pode ser executado a um custo muito baixo usando materiais de fácil acesso na maioria dos laboratórios de biologia molecular.

Resumo

A enxertia de plântulas em estágio inicial tornou-se uma ferramenta popular em genética molecular para estudar as relações raiz-parte aérea dentro das plantas. A enxertia de mudas em estágio inicial da pequena planta-modelo, Arabidopsis thaliana, é tecnicamente desafiadora e demorada devido ao tamanho e fragilidade de suas mudas. Uma coleção crescente de métodos publicados descreve essa técnica com diferentes taxas de sucesso, dificuldade e custos associados. Este trabalho descreve um procedimento simples para fazer um dispositivo de enxertia reutilizável in house usando mistura de elastômero de silicone, e como usar esse dispositivo para enxertia de plântulas. No momento desta publicação, cada dispositivo de enxertia reutilizável custa apenas US$ 0,47 em materiais consumíveis para produzir. Usando este método, os iniciantes podem ter suas primeiras mudas enxertadas com sucesso em menos de 3 semanas do início ao fim. Este procedimento altamente acessível permitirá que os laboratórios de genética molecular de plantas estabeleçam a enxertia de plântulas como parte normal de seu processo experimental. Devido ao total controle que os usuários têm na criação e design desses dispositivos de enxertia, essa técnica poderia ser facilmente ajustada para uso em plantas maiores, como tomate ou tabaco, se desejado.

Introdução

A enxertia é uma técnica hortícola antiga que se tornou uma prática agrícola estabelecida por volta de 500 a.C.¹. A enxertia de diferentes variedades de plantas cultivadas para melhorar a produtividade foi o primeiro uso dessa técnica, e continua sendo utilizada para esse fim até hoje. Na última década, a enxertia tem atraído cada vez mais atenção como ferramenta para biólogos moleculares estudarem a sinalização de longa distância em plantas 2,3,4,5. Enquanto enxertar plantas adultas é relativamente fácil, enxertar plantas logo após a germinação é um desafio. Apesar disso, algumas vezes é necessário avaliar os efeitos da sinalização de longa distância em processos como o desenvolvimento das plantas, as respostas ambientais e o florescimento ^6,7,8.

Arabidopsis thaliana foi estabelecido como o organismo modelo na biologia vegetal por muitas razões, incluindo seu tamanho relativamente pequeno, facilitando o crescimento dentro de um laboratório. No entanto, o pequeno tamanho e a fragilidade das mudas de Arabidopsis tornam a enxertia de mudas jovens muito desafiadora. Em muitos casos, é necessário treinamento prático extensivo para obter enxertos de plântulas com sucesso. Ao longo dos anos, houve muitos avanços metodológicos que identificaram condições ideais de cultivo e novas técnicas para aumentar a taxa de sucesso da enxertia de plântulas9,10,11. A ferramenta mais recente introduzida foi um chip de enxertia de plântulas de Arabidopsis, que permite que mesmo usuários inexperientes alcancem níveis aceitáveis de sucesso de enxertia¹². Embora esse avanço tenha reduzido significativamente a barreira técnica da enxertia de plântulas, o dispositivo de chip é caro, e o número de enxertos que podem ser conduzidos em paralelo rapidamente se torna proibitivo.

Além disso, este dispositivo só pode ser usado para mudas de Arabidopsis que tenham dimensões de hipocótilo semelhantes às mudas selvagens. Embora Arabidopsis seja a espécie-chave no mundo da genética molecular de plantas, trabalhos recentes têm sido feitos em outras espécies usando enxertia de plântulas. Exemplos incluem a enxertia de soja e feijão, tabaco para tomate e canola para Arabidopsis e, posteriormente, amostragem de ambos os tecidos para pequenos RNAs^13,14. Portanto, um método de enxertia acessível à maioria dos laboratórios e que possa ser facilmente adaptado a uma ampla gama de espécies vegetais sem grandes alterações técnicas é altamente desejável.

Este protocolo detalha um método que emprega a produção interna de um dispositivo de enxertia simples que permite a personalização completa do diâmetro e comprimento do canal de enxertia para acomodar qualquer morfologia de plântula na maioria das espécies vegetais. A produção desses dispositivos é muito acessível e altamente escalável, pois os únicos componentes necessários são elastômero de silicone, fiação ou tubulação do tamanho correto, uma lâmina de alta precisão e um recipiente para servir como molde. Seguindo o protocolo de enxertia aqui detalhado, os usuários podem obter taxas de enxertia bem-sucedidas de 45% (n = 105), comparáveis aos resultados de enxertia previamente relatados^10,12.

Protocolo

1. Preparação do dispositivo

1. Fazer o dispositivo de enxertia de silicone fundindo a solução de elastômero de silicone em uma placa de Petri quadrada (100 mm x 100 mm). Preparar 15 mL da solução de elastômero, seguindo as orientações do fabricante.
   NOTA: Os kits de elastômero de silicone normalmente incluem um líquido à base de silicone e um agente de cura que, quando misturados, permitem que o silicone se solidifique.
2. Preparar a placa de Petri quadrada colocando quatro pedaços retos de fio 29 G na placa de Petri quadrada, equidistantes entre si (Figura 1A). Certifique-se de que o fio fique nivelado com o fundo do molde. Para endireitar totalmente o fio, enrole-o em uma superfície dura e uniforme com um objeto pesado e plano (por exemplo, um rack de tubo de metal).
   NOTA: As gravatas de torção geralmente contêm fio de 29 G e podem ser usadas após a remoção do revestimento externo de papel com acetona.
3. Despeje a solução mista de elastômero de silicone por cima dos fios e cubra com a parte superior da placa de Petri. Deixe o silicone curar por 24-48 h à temperatura ambiente.
4. Retire a folha de silicone da placa de Petri usando pinças limpas e passe para uma superfície plana limpa.
5. Retire os fios da folha de silicone. Remova a fina camada de silicone remanescente na parte externa do canal com pinça de ponta fina, para permitir que o canal fique aberto de um lado (Figura 1A).
6. Corte a folha de silicone perpendicularmente aos canais em tiras de 3 mm usando tesouras limpas. Mova cada tira para um envelope de papel alumínio e sele com fita autoclave.
7. Autoclave as tiras a 121 °C por pelo menos 30 min e guarde até que esteja pronta para uso.

2. Preparo das mudas

1. Esterilizar e vernalizar sementes.
   1. Suspender até 100 sementes de Arabidopsis em 1 mL de solução de água sanitária a 50% contendo Tween 20 a 0,1% em tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e incubar por 5-10 min. Remover a solução de água sanitária por pipetagem ou aspiração em condições estéreis. Enxaguar as sementes com 1 mL de dH₂O esterilizado. Certifique-se de inverter os tubos para enxaguar adequadamente as sementes e remover qualquer solução de água sanitária deixada na parte superior do tubo. Repita o enxágue 4x.
   2. Deixar aproximadamente 0,25 mL de água nos tubos com as sementes e armazenar a 4 °C por 3 dias no escuro.
2. Plaquear as sementes em preparação para a enxertia.
   1. Prepare uma placa de MS de ágar 1% da seguinte forma: para 1 L de meio sólido MS (0,5% de sacarose), misture 4,4 g de sal MS, 5 g de sacarose e 10 g de ágar em 800 mL de água, ajuste o pH para 5,7 com KOH e, em seguida, leve o volume total para 1 L com água adicional. Autoclave por pelo menos 20, min antes de despejar ~25 mL nas placas de Petri quadradas.
   2. Em condições estéreis, mover o número adequado de sementes preparadas para a placa, usando uma ponta de pipeta de 20 μL para aspirar e transferir as sementes.
   3. Coloque uma tira estéril na superfície da placa para orientar o posicionamento da semente, para que as sementes fiquem alinhadas com os canais da tira. Retire a tira assim que as sementes estiverem chapeadas.
      OBS: Uma placa quadrada de 100 mm x 100 mm pode acomodar duas fileiras de mudas (Figura 1B).
   4. Quando as placas estiverem em pé, deixe o líquido evaporar do meio sólido e acumule no fundo da placa. Após a colocação das sementes na placa, colocar na tampa da placa e selar um dos lados da placa que esteja paralelo às duas fileiras de sementes (indicado pela região de destaque azul na Figura 1B) com parafilme. Embrulhe a fita respirável em cima do parafilme e ao redor de todas as outras bordas da placa.
3. Levante cuidadosamente duas placas com o lado selado do parafilme virado para baixo. Separe as duas placas na parte inferior colocando um tubo de centrífuga horizontal de 15 mL entre elas e fixe com um elástico. Certifique-se de que as superfícies da placa formem um ângulo de 100°-110° com a superfície da bancada (Figura 1C).
4. Armazenar as placas nesta orientação por 72 h no escuro total a 21 °C, para permitir que as plântulas de hipocótilo cresçam ~5 mm de comprimento. Após 72 h, remova as placas do escuro e cresça sob 16 h de luz (intensidade de 100 μE m-2 ^seg-1) e 8 h de ciclos escuros por mais ^2-4 dias na mesma temperatura antes da enxertia.
5. Enxertar as mudas entre 5 e 7 dias após serem plaqueadas. Coloque uma faixa de enxertia sobre as mudas, encaixando seus hipocótilos nos canais. Posicionar suavemente a plântula de modo que a junção raiz-hipocótilo seja posicionada no fundo da tira de silicone para preparar a plântula para o corte (Figura 1D).

3. Procedimento de enxertia

1. Prepare um ambiente de trabalho estéril higienizando um escopo de dissecção com etanol 70% e autoclavando dois pares de pinças de ponta fina e um cabo de bisturi. Realizar todos os procedimentos de enxertia em capuz estéril e com o auxílio de um dossiê de dissecção, conforme necessário. Realizar a maior parte da enxertia com aumento de 10,5x.
2. Prepare as scions. Use uma lâmina de bisturi fresca para cortar o hipocótilo perpendicularmente para criar um corte limpo reto. Empurre a lâmina para frente em vez de pressionar para baixo na planta para evitar que a muda seja empurrada para dentro do ágar (Vídeo 1).
3. Remova o disparo. Tome cuidado para manter a parte cortada da parte aérea hidratada, garantindo o contato com a superfície do meio. Alternativamente, mova o rebento para uma área de retenção designada, como a parte superior de uma placa de Petri cheia de dH₂O estéril, até que esteja pronta para uso.
4. Prepare os porta-enxertos. Puxe suavemente a raiz pegando a raiz no espaço deixado entre as pinças fechadas e girando-as, deixando a seção de corte dos porta-enxertos no meio da tira (Figura 2).
   NOTA: A raiz frágil será danificada se esmagada entre as pinças fechadas diretamente, necessitando encunhar a raiz no ângulo afiado das extremidades da pinça para manipular o tecido.
5. Pegue suavemente o rebento desejado usando a pinça de ponta fina e insira na parte superior do canal.
   OBS: É fundamental confirmar visualmente o contato entre as mudas e os porta-enxertos para obter o sucesso do enxerto (Figura 3).
6. Após a confecção de todos os enxertos, envolva as placas com parafilme e fita adesiva respirável e monte as placas da mesma forma que antes, sem atrapalhar as mudas ou tiras de silicone. Mova cuidadosamente as placas para uma câmara de crescimento regulada a 26 °C com ciclos de 16 h claro/8 h escuro.
7. Avaliar as plântulas enxertadas em condições estéreis após 7-10 dias. Retire cuidadosamente a tira de silicone usando pinças, descascando um dos lados, permitindo que os canais liberem as mudas. Remova quaisquer raízes adventícias que cresçam da copa, cortando-as da copa com uma lâmina de bisturi fresca ou esmagando-as usando pinças de ponta fina. Avaliar visualmente se o porta-enxerto ficou firmemente aderido à copa para formar um enxerto bem-sucedido (Figura 2).
8. Mova enxertos bem-sucedidos para o solo de propagação de mudas para crescer pelo tempo necessário. Cubra o solo com plástico transparente por alguns dias à medida que as mudas forem se estabelecendo. Após a transferência das plantas para o solo, crescer sob os ciclos claro e escuro mencionados anteriormente a 21 °C.

Resultados

Vários aspectos do desenho da tira de enxertia foram testados para identificar as condições ideais de enxertia que exigiam menor habilidade técnica (Tabela 1). Todos os ensaios de enxertia foram concluídos em meio MS de sacarose a 0,5%, que foi previamente relatado como um meio de enxertia ideal^11,12.

O crescimento ótimo das plântulas não pode ser alcançado com a germinação em faixa
Na pr...

Discussão

Resumo e significado
A formação de uma união do enxerto é crucial para o sucesso da enxertia, que requer contato direto e ininterrupto entre o porta-enxerto e a muda. O tamanho em miniatura e a fragilidade das mudas de pequenas plantas, como Arabidopsis, tornam tecnicamente desafiador atender a esse requisito. Uma técnica desenvolvida nos primeiros métodos de enxertia de plântulas de Arabidopsis foi inserir tanto a copa quanto o porta-enxerto em um colar curto de tubos de sili...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tubes	VWR International Inc	10026-076
ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L	VWR	BJAH010-4
BactoAgar	Sigma	A1296-500g
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit	Dow	2646340
D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg	Fisher Scientific	BP220-1
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500	Fisher Scientific	20901-551 / 05-402
Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-164
Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape	Fisher Scientific	15-901-111
Fisherbrand square petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711A
Leica Zoom 2000 Stereo Microscope	Microscope Central	L-Z2000
Micropore Tape	3M	B0082A9FEM
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519-10L
Parafilm	Genesee Scientific	16-101
potassium hydroxide	VWR International Inc	AA13451-36
Redi-earth Plug and Seedling Mix	Sun Gro Horticulture	SUN239274728CFLP
Scotts Osmocote Plus	Hummert International	7630600
Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade	Fisher Scientific	22-079-697
Tween 20, 500 mL	Fisher Scientific	BP337500
TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM	VWR	102091-580