Масштабируемая, гибкая и экономичная прививка рассады

Резюме

Этот протокол описывает надежный метод прививки рассады, который не требует предварительного опыта или обучения и может быть выполнен по очень низкой цене с использованием материалов, легко доступных в большинстве лабораторий молекулярной биологии.

Аннотация

Ранняя стадия прививки саженцев стала популярным инструментом в молекулярной генетике для изучения взаимоотношений между корнями и побегами внутри растений. Прививка ранних саженцев небольшого модельного растения Arabidopsis thaliana является технически сложной и трудоемкой из-за размера и хрупкости его саженцев. Растущая коллекция опубликованных методов описывает эту технику с различными показателями успеха, сложностью и связанными с этим затратами. В этой статье описывается простая процедура изготовления собственного многоразового устройства для прививки с использованием смеси силиконовых эластомеров и способы использования этого устройства для прививки рассады. На момент этой публикации производство каждого многоразового прививочного устройства обходится всего в 0,47 доллара США в расходных материалах. Используя этот метод, новички могут получить свои первые успешно привитые саженцы менее чем за 3 недели от начала до конца. Эта высокодоступная процедура позволит лабораториям молекулярной генетики растений установить прививку рассады как нормальную часть своего экспериментального процесса. Благодаря полному контролю, который пользователи имеют при создании и проектировании этих устройств для прививки, этот метод может быть легко отрегулирован для использования на более крупных растениях, таких как помидоры или табак, если это необходимо.

Введение

Прививка - это древняя садоводческая техника, которая стала устоявшейся сельскохозяйственной практикой к 500 г. до н.э.¹. Прививка различных сортов сельскохозяйственных культур для повышения урожайности была первым применением этой техники и продолжает использоваться для этой цели сегодня. В последнее десятилетие прививка привлекает все большее внимание как инструмент молекулярных биологов для изучения передачи сигналов на большие расстояния у растений 2,3,4,5. В то время как прививка взрослых растений относительно проста, прививка растений вскоре после прорастания является сложной задачей. Несмотря на это, иногда требуется оценить влияние передачи сигналов на большие расстояния в таких процессах, как развитие растений, реакция окружающей среды и цветение ^6,7,8.

Arabidopsis thaliana был признан модельным организмом в биологии растений по многим причинам, в том числе по относительно небольшому размеру, что позволяет легко выращивать его в лаборатории. Однако небольшой размер и хрупкость саженцев арабидопсиса делает прививку молодых саженцев очень сложной. Во многих случаях для успешного получения саженцевых трансплантатов требуется обширная практическая подготовка. За прошедшие годы было внесено много методологических усовершенствований, которые определили идеальные условия выращивания и новые методы для повышения успешности прививки саженцев 9,10,11. Самым последним представленным инструментом был чип для прививки рассады арабидопсиса, который позволяет даже неопытным пользователям достичь приемлемого уровня успеха прививки¹². Несмотря на то, что этот прогресс значительно снизил технический барьер для прививки рассады, устройство чипа стоит дорого, а количество прививок, которые можно проводить параллельно, быстро становится непомерно дорогим.

Кроме того, это устройство можно использовать только для проростков арабидопсиса, которые имеют размеры гипокотиля, аналогичные саженцам дикорастущего типа. В то время как арабидопсис является краеугольным камнем в мире молекулярной генетики растений, недавняя работа была проделана и у других видов с использованием прививки рассады. Примеры включают прививку сои и фасоли обыкновенной, табака к томату и рапса к арабидопсису и последующий отбор проб обеих тканей для малых РНК^13,14. Поэтому крайне желателен метод прививки, доступный для большинства лабораторий и легко адаптированный к широкому спектру видов растений без каких-либо серьезных изменений в технике.

В этом протоколе подробно описывается метод, в котором используется собственное производство простого устройства для прививки, которое позволяет полностью настроить диаметр и длину канала прививки для учета любой морфологии саженца у большинства видов растений. Производство этих устройств очень доступно по цене и легко масштабируется, так как единственными необходимыми компонентами являются силиконовый эластомер, проводка или трубка правильного размера, высокоточное лезвие и контейнер, служащий пресс-формой. Следуя протоколу прививки, подробно описанному здесь, пользователи могут достичь успешных показателей прививки 45% (n = 105), что сопоставимо с ранее сообщенными результатами прививки^10,12.

протокол

1. Подготовка устройства

1. Изготовьте силиконовое прививочное устройство, отлив раствор силиконового эластомера в квадратной чашке Петри (100 мм х 100 мм). Приготовьте 15 мл раствора эластомера, следуя рекомендациям производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наборы силиконовых эластомеров обычно включают жидкость на основе силикона и отвердитель, которые при смешивании позволяют силикону затвердевать.
2. Подготовьте квадратную чашку Петри, уложив четыре прямых куска проволоки 29 G в квадратную чашку Петри, равноудаленные друг от друга (рис. 1A). Убедитесь, что проволока лежит вровень с дном формы. Чтобы полностью выпрямить проволоку, прокатите ее по твердой однородной поверхности тяжелым и плоским предметом (например, металлической стойкой для труб).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стяжки часто содержат провод 29G и могут использоваться после удаления внешнего бумажного покрытия ацетоном.
3. Налейте смешанный раствор силиконового эластомера поверх проводов и накройте сверху чашкой Петри. Дайте силикону затвердеть в течение 24-48 часов при комнатной температуре.
4. Снимите силиконовый лист с чашки Петри с помощью чистых щипцов и переместите на чистую ровную поверхность.
5. Снимите провода с силиконового листа. Удалите тонкий слой силикона, оставшийся снаружи канала, тонкими точечными щипцами, чтобы канал был открыт с одной стороны (рис. 1A).
6. Разрежьте силиконовый лист перпендикулярно каналам на полоски по 3 мм с помощью чистых ножниц. Переместите каждую полоску в конверт из алюминиевой фольги и запечатайте автоклавной лентой.
7. Автоклавируйте полоски при температуре 121 °C не менее 30 минут и храните до готовности к использованию.

2. Подготовка рассады

1. Стерилизуют и яровизируют семена.
   1. Суспендировать до 100 семян арабидопсиса в 1 мл 50% раствора отбеливателя, содержащего 0,1% Tween 20, в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл и инкубировать в течение 5-10 минут. Удалите раствор отбеливателя с помощью пипетки или аспирации в стерильных условиях. Промойте семена 1 мл стерилизованного dH₂O. Обязательно переверните пробирки, чтобы адекватно промыть семена, и удалите весь раствор отбеливателя, оставшийся в верхней части пробирки. Повторите полоскание 4 раза.
   2. Оставьте примерно 0,25 мл воды в пробирках с семенами и храните при температуре 4 ° C в течение 3 дней в темноте.
2. Пластинчатые семена готовятся к прививке.
   1. Приготовьте 1%-ную тарелку МС с агаром следующим образом: на 1 л твердой среды МС (0,5% сахарозы) смешайте 4,4 г соли МС, 5 г сахарозы и 10 г агара в 800 мл воды, отрегулируйте рН до 5,7 с помощью КОН, а затем доведите общий объем до 1 л с дополнительной водой. Автоклав в течение не менее 20 мин, прежде чем налить ~25 мл в квадратные чашки Петри.
   2. В стерильных условиях переместите соответствующее количество подготовленных семян на тарелку, используя наконечник пипетки объемом 20 мкл для аспирации и переноса семян.
   3. Поместите стерильную полоску на поверхность пластины, чтобы направлять позиционирование семян, чтобы семена были выровнены с каналами на полоске. Удалите полоску, как только семена будут покрыты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одна квадратная пластина размером 100 мм x 100 мм может вместить два ряда саженцев (рис. 1B).
   4. Как только пластины встанут, дайте жидкости испариться из твердой среды и скапливайтесь на дне тарелки. После того, как семена будут помещены на тарелку, наденьте на тарелку крышку и запечатайте одну сторону тарелки, параллельную двум рядам семян (обозначенным выделенной синим цветом областью на рисунке 1B), парапленкой. Поверх парапленки и вокруг всех остальных краев пластины оберните дышащим скотчем.
3. Осторожно встаньте на две пластины стороной, запечатанной парапленкой, вниз. Разделите две пластины внизу, поместив между ними горизонтальную центрифужную пробирку объемом 15 мл и закрепите резинкой. Убедитесь, что поверхности пластин образуют угол 100–110° с поверхностью столешницы (рис. 1C).
4. Храните пластины в таком положении в течение 72 ч в полной темноте при температуре 21 °C, чтобы гипокотильи проростков выросли ~ 5 мм в длину. Через 72 ч выньте пластинки из темноты и выращивайте под 16 ч светлых (интенсивность 100 мкЭ м-2 сек-1) и 8 ч темных циклов еще ^2-4 дня при той же температуре перед прививкой.
5. Прививайте саженцы через 5-7 дней после обложки. Поместите прививочную полосу поверх саженцев, вставив их гипокотили в каналы. Аккуратно расположите саженец так, чтобы соединение корня и гипокотила было расположено в нижней части силиконовой полосы, чтобы подготовить саженец к срезке (рис. 1D).

3. Процедура прививки

1. Подготовьте стерильную рабочую среду, продезинфицировав диссекционный прицел 70% этанолом и автоклавируя две пары щипцов с тонкими наконечниками и ручку скальпеля. Выполняйте все процедуры прививки в стерильном капюшоне и с помощью диссекционного эндоскопа по мере необходимости. Выполняют большую часть черенкования, используя увеличение в 10,5 раза.
2. Подготовьте отпрыски. Используйте свежее лезвие скальпеля, чтобы разрезать гипокотиль перпендикулярно, чтобы создать прямой чистый срез. Толкайте лезвие вперед, а не вдавливайте в растение, чтобы саженец не вдавливался в агар (видео 1).
3. Удалите побег. Следите за тем, чтобы срезанная часть побега была увлажненной, обеспечивая контакт с поверхностью среды. В качестве альтернативы переместите побег в специально отведенную зону хранения, например, в верхнюю часть чашки Петри, заполненную стерильным dH₂O, до тех пор, пока он не будет готов к использованию.
4. Подготовьте подвои. Аккуратно вытяните корень, зацепив корень за пространство, оставшееся между закрытыми щипцами, и повернув их, оставив срезанный участок подвоя посередине полосы (Видео 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хрупкий корень будет поврежден, если его раздавить непосредственно между закрытыми щипцами, что потребует расклинивания корня под острым углом концов пинцета для манипуляций с тканью.
5. Аккуратно возьмите нужный побег с помощью щипцов с тонкими наконечниками и вставьте в верхнюю часть канала.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно визуально подтвердить контакт между привоями и подвоями, чтобы получить успешный привой (видео 3).
6. После того, как все прививки сделаны, оберните пластины парапленкой и дышащей лентой и установите пластины так же, как и раньше, не нарушая рассаду или силиконовые полоски. Осторожно переместите пластины в камеру для роста, установленную при температуре 26 °C, с циклами 16 часов света и 8 часов темноты.
7. Оценивают привитые саженцы в стерильных условиях через 7-10 дней. Аккуратно удалите силиконовую полоску с помощью щипцов, отслаивая одну сторону, позволяя каналам освободить рассаду. Удалите все придаточные корни, растущие из привоя, отрезав их от привоя свежим лезвием скальпеля или раздавив щипцами с тонкими наконечниками. Визуально оцените, прочно ли прикрепился подвой к привою, чтобы сформировать удачный привой (рисунок 2).
8. Переместите успешные прививки в почву для размножения рассады, чтобы они росли столько, сколько потребуется. Накройте почву прозрачным пластиком на несколько дней, пока рассада не укоренится. После переноса растений в почву растут при ранее упомянутых светлых и темных циклах при 21 ° C.

Результаты

Были протестированы различные аспекты конструкции прививочной полосы для определения оптимальных условий прививки, требующих наименьшего количества технических навыков (табл. 1). Все испытания по прививке были завершены на 0,5% сахарозе MS, которая, как сообщалось ранее, являет?...

Обсуждение

Резюме и значение
Формирование привоя имеет решающее значение для успешной прививки, которая требует прямого и беспрепятственного контакта между подвоем и привоем. Миниатюрный размер и хрупкость саженцев небольших растений, таких как арабидопсис, делает технически сл...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tubes	VWR International Inc	10026-076
ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L	VWR	BJAH010-4
BactoAgar	Sigma	A1296-500g
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit	Dow	2646340
D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg	Fisher Scientific	BP220-1
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500	Fisher Scientific	20901-551 / 05-402
Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-164
Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape	Fisher Scientific	15-901-111
Fisherbrand square petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711A
Leica Zoom 2000 Stereo Microscope	Microscope Central	L-Z2000
Micropore Tape	3M	B0082A9FEM
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519-10L
Parafilm	Genesee Scientific	16-101
potassium hydroxide	VWR International Inc	AA13451-36
Redi-earth Plug and Seedling Mix	Sun Gro Horticulture	SUN239274728CFLP
Scotts Osmocote Plus	Hummert International	7630600
Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade	Fisher Scientific	22-079-697
Tween 20, 500 mL	Fisher Scientific	BP337500
TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM	VWR	102091-580