Innesto di piantine scalabile, flessibile ed economico

Riepilogo

Questo protocollo descrive un robusto metodo di innesto di piantine che non richiede alcuna esperienza o formazione precedente e può essere eseguito a un costo molto basso utilizzando materiali facilmente accessibili nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare.

Abstract

L'innesto di piantine in fase iniziale è diventato uno strumento popolare nella genetica molecolare per studiare le relazioni radice-germoglio all'interno delle piante. L'innesto di piantine in fase iniziale della piccola pianta modello, Arabidopsis thaliana, è tecnicamente impegnativo e richiede tempo a causa delle dimensioni e della fragilità delle sue piantine. Una crescente raccolta di metodi pubblicati descrive questa tecnica con diversi tassi di successo, difficoltà e costi associati. Questo documento descrive una semplice procedura per realizzare un dispositivo di innesto riutilizzabile internamente utilizzando una miscela di elastomero siliconico e come utilizzare questo dispositivo per l'innesto di piantine. Al momento di questa pubblicazione, ogni dispositivo di innesto riutilizzabile costa solo $ 0,47 in materiali di consumo da produrre. Utilizzando questo metodo, i principianti possono avere le loro prime piantine innestate con successo in meno di 3 settimane dall'inizio alla fine. Questa procedura altamente accessibile consentirà ai laboratori di genetica molecolare vegetale di stabilire l'innesto di piantine come parte normale del loro processo sperimentale. A causa del pieno controllo che gli utenti hanno nella creazione e nella progettazione di questi dispositivi di innesto, questa tecnica potrebbe essere facilmente adattata per l'uso in piante più grandi, come il pomodoro o il tabacco, se lo si desidera.

Introduzione

L'innesto è un'antica tecnica orticola che divenne una pratica agricola consolidata dal 500 aC¹. L'innesto di diverse varietà di piante coltivate per migliorare le rese è stato il primo uso di questa tecnica e continua ad essere utilizzato per questo scopo oggi. Nell'ultimo decennio, l'innesto ha attirato una crescente attenzione come strumento per i biologi molecolari per studiare la segnalazione a lunga distanza nelle piante 2,3,4,5. Mentre l'innesto di piante adulte è relativamente facile, l'innesto di piante subito dopo la germinazione è impegnativo. Nonostante ciò, a volte è necessario valutare gli effetti della segnalazione a lunga distanza in processi come lo sviluppo delle piante, le risposte ambientali e la fioritura ^6,7,8.

Arabidopsis thaliana è stato stabilito come l'organismo modello nella biologia vegetale per molte ragioni, tra cui le sue dimensioni relativamente piccole, che lo rendono facile da coltivare all'interno di un laboratorio. Tuttavia, le piccole dimensioni e la fragilità delle piantine di Arabidopsis rendono l'innesto di giovani piantine molto impegnativo. In molti casi, è necessaria un'ampia formazione pratica per ottenere con successo gli innesti di piantina. Ci sono stati molti miglioramenti metodologici nel corso degli anni che hanno identificato condizioni di crescita ideali e nuove tecniche per aumentare il tasso di successo dell'innesto di piantine 9,10,11. Lo strumento più recente introdotto è stato un chip di innesto di piantine di Arabidopsis, che consente anche agli utenti inesperti di raggiungere livelli accettabili di successo dell'innesto¹². Mentre questo progresso ha abbassato significativamente la barriera tecnica dell'innesto di piantine, il dispositivo chip è costoso e il numero di innesti che possono essere condotti in parallelo diventa rapidamente proibitivo dal punto di vista dei costi.

Inoltre, questo dispositivo può essere utilizzato solo per piantine di Arabidopsis che hanno dimensioni ipocotiliche simili alle piantine selvatiche. Mentre Arabidopsis è la specie chiave nel mondo della genetica molecolare vegetale, recentemente è stato fatto un lavoro in altre specie utilizzando l'innesto di piantine. Gli esempi includono l'innesto di soia e fagiolo comune, tabacco a pomodoro e colza a Arabidopsis, e successivamente il campionamento di entrambi i tessuti per piccoli RNA^13,14. Pertanto, è altamente auspicabile un metodo di innesto accessibile alla maggior parte dei laboratori e facilmente adattabile a una vasta gamma di specie vegetali senza grandi cambiamenti tecnici.

Questo protocollo descrive un metodo che impiega la produzione interna di un semplice dispositivo di innesto che consente la completa personalizzazione del diametro e della lunghezza del canale di innesto per adattarsi a qualsiasi morfologia della piantina nella maggior parte delle specie vegetali. La produzione di questi dispositivi è molto economica e altamente scalabile, in quanto gli unici componenti necessari sono elastomero siliconico, cablaggio o tubo delle dimensioni corrette, una lama ad alta precisione e un contenitore che funge da stampo. Seguendo il protocollo di innesto descritto qui, gli utenti possono ottenere tassi di innesto di successo del 45% (n = 105), paragonabili ai risultati dell'innesto precedentemente riportati^10,12.

Protocollo

1. Preparazione del dispositivo

1. Realizzare il dispositivo di innesto di silicone colando una soluzione di elastomero siliconico in una capsula di Petri quadrata (100 mm x 100 mm). Preparare 15 ml della soluzione di elastomero, seguendo le linee guida del produttore.
   NOTA: I kit di elastomero siliconico includono in genere un liquido a base di silicone e un agente polimerizzante che, se miscelati insieme, consentono al silicone di solidificarsi.
2. Preparare la capsula di Petri quadrata posando quattro pezzi dritti di filo da 29 G nella capsula di Petri quadrata, equidistanti l'uno dall'altro (Figura 1A). Assicurarsi che il filo si trovi a filo con il fondo dello stampo. Per raddrizzare completamente il filo, arrotolarlo su una superficie uniforme dura con un oggetto pesante e piatto (ad esempio, una cremagliera metallica).
   NOTA: Le cravatte a torsione contengono spesso filo da 29 G e possono essere utilizzate dopo aver rimosso il rivestimento esterno di carta con acetone.
3. Versare la soluzione mista di elastomero siliconico sopra i fili e coprire con la parte superiore della capsula di Petri. Lasciare polimerizzare il silicone per 24-48 ore a temperatura ambiente.
4. Rimuovere il foglio di silicone dalla piastra di Petri con una pinza pulita e spostarlo su una superficie piana pulita.
5. Rimuovere i fili dal foglio di silicone. Rimuovere il sottile strato di silicone rimasto all'esterno del canale con una pinza a punta fine, per consentire al canale di essere aperto su un lato (Figura 1A).
6. Tagliare il foglio di silicone perpendicolarmente ai canali in strisce da 3 mm usando delle forbici pulite. Spostare ogni striscia su una busta di alluminio e sigillare con nastro adesivo.
7. Autoclavare le strisce a 121 °C per almeno 30 minuti e conservare fino al momento dell'uso.

2. Preparazione della piantina

1. Sterilizzare e vernalizzare i semi.
   1. Sospendere fino a 100 semi di Arabidopsis in 1 ml di soluzione di candeggina al 50% contenente lo 0,1% di Tween 20 in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e incubare per 5-10 minuti. Rimuovere la soluzione di candeggina mediante pipettaggio o aspirazione in condizioni sterili. Risciacquare i semi con 1 mL di dH₂O sterilizzato. Assicurati di capovolgere i tubi per sciacquare adeguatamente i semi e rimuovere qualsiasi soluzione di candeggina rimasta nella parte superiore del tubo. Ripetere il risciacquo 4x.
   2. Lasciare circa 0,25 ml di acqua nei tubi con i semi e conservare a 4 °C per 3 giorni al buio.
2. Impiattare i semi in preparazione per l'innesto.
   1. Preparare una piastra MS di agar all'1% come segue: per 1 L di MS (0,5% di saccarosio) terreno solido, mescolare 4,4 g di sale MS, 5 g di saccarosio e 10 g di agar in 800 ml di acqua, regolare il pH a 5,7 con KOH, quindi portare il volume totale a 1 L con acqua aggiuntiva. Autoclave per almeno 20, min prima di versare ~25 mL nelle piastre di Petri quadrate.
   2. In condizioni sterili, spostare il numero appropriato di semi preparati sulla piastra, utilizzando una punta di pipetta da 20 μL per aspirare e trasferire i semi.
   3. Posizionare una striscia sterile sulla superficie della piastra per guidare il posizionamento dei semi, in modo che i semi siano allineati con i canali sulla striscia. Rimuovere la striscia una volta che i semi sono placcati.
      NOTA: Una piastra quadrata da 100 mm x 100 mm può ospitare due file di piantine (Figura 1B).
   4. Una volta che le piastre sono in piedi, lasciare che il liquido evapori fuori dal mezzo solido e si accumuli sul fondo del piatto. Dopo aver posto i semi sulla piastra, mettere sul coperchio della piastra e sigillare un lato della piastra parallelo alle due file di semi (indicato dalla regione evidenziata in blu nella Figura 1B) con parafilm. Avvolgere il nastro traspirante sulla parte superiore del parafilm e attorno a tutti gli altri bordi della piastra.
3. Posizionare con cautela due piastre con il lato sigillato con parafilm rivolto verso il basso. Separare le due piastre sul fondo posizionando un tubo di centrifuga orizzontale da 15 mL tra di loro e fissarle con un elastico. Assicurarsi che le superfici della piastra formino un angolo di 100°-110° con la superficie del piano di lavoro (Figura 1C).
4. Conservare le piastre in questo orientamento per 72 ore in totale oscurità a 21 °C, per consentire agli ipocotili della piantina di crescere ~5 mm di lunghezza. Dopo 72 h, rimuovere le piastre dal buio e crescere sotto 16 h di luce (intensità di 100 μE m-2 sec-1) e 8 h cicli di buio per altri ^2-4 giorni alla stessa temperatura prima dell'innesto.
5. Innesare le piantine tra 5 e 7 giorni dopo essere state placcate. Posizionare una striscia di innesto sulle piantine, adattando i loro ipocotili nei canali. Posizionare delicatamente la piantina in modo che la giunzione radice-ipocotile sia posizionata sul fondo della striscia di silicone per preparare la piantina per il taglio (Figura 1D).

3. Procedura di innesto

1. Preparare un ambiente di lavoro sterile sanificando un cannocchiale di dissezione con etanolo al 70% e autoclavando due paia di pinze a punta fine e un manico di bisturi. Eseguire tutte le procedure di innesto in un cappuccio sterile e con l'aiuto di un cannocchiale di dissezione, se necessario. Eseguire la maggior parte dell'innesto utilizzando un ingrandimento di 10,5x.
2. Preparare i rampolli. Utilizzare una lama di bisturi fresca per tagliare l'ipocotile perpendicolarmente per creare un taglio netto e dritto. Spingere la lama in avanti piuttosto che premere verso il basso nella pianta per evitare che la piantina venga spinta nell'agar (Video 1).
3. Rimuovi le riprese. Fare attenzione a mantenere idratata la parte tagliata del germoglio assicurando il contatto con la superficie del supporto. In alternativa, spostare il germoglio in un'area di attesa designata, come la parte superiore di una capsula di Petri riempita con dH₂O sterile, fino al momento dell'uso.
4. Preparare i portinnesti. Tirare delicatamente la radice afferrando la radice nello spazio rimasto tra le pinze chiuse e girandole, lasciando la sezione tagliata dei portainnesti nel mezzo della striscia (Video 2).
   NOTA: La radice fragile sarà danneggiata se schiacciata direttamente tra le pinze chiuse, rendendo necessario incuneare la radice nell'angolo acuto delle estremità della pinzetta per manipolare il tessuto.
5. Raccogli delicatamente il germoglio desiderato usando la pinza a punta fine e inseriscilo nella parte superiore del canale.
   NOTA: È fondamentale confermare visivamente il contatto tra i rampolli e i portainnesti per ottenere un innesto di successo (Video 3).
6. Dopo aver fatto tutti gli innesti, avvolgere le piastre con parafilm e nastro traspirante e sistemare le piastre nello stesso modo di prima, senza disturbare le piantine o le strisce di silicone. Spostare con cautela le piastre in una camera di crescita impostata a 26 °C con cicli di luce e 8 ore di buio.
7. Valutare le piantine innestate in condizioni sterili dopo 7-10 giorni. Rimuovere con attenzione la striscia di silicone usando una pinza staccando un lato, consentendo ai canali di liberare le piantine. Rimuovere eventuali radici avventizie che crescono dal rampollo tagliandole dal rampollo con una lama di bisturi fresca o schiacciandole con una pinza a punta fine. Valutare visivamente se il portainnesto è diventato saldamente attaccato al rampollo per formare un innesto di successo (Figura 2).
8. Spostare gli innesti di successo nel terreno di propagazione della piantina per crescere per tutto il tempo necessario. Coprire il terreno con plastica trasparente per alcuni giorni man mano che le piantine si stabiliscono. Dopo aver trasferito le piante nel terreno, crescere sotto i cicli di luce e buio precedentemente menzionati a 21 ° C.

Risultati

Sono stati testati vari aspetti del design della striscia di innesto per identificare le condizioni ottimali di innesto che richiedevano la minima quantità di abilità tecnica (Tabella 1). Tutte le prove di innesto sono state completate su terreno MS di saccarosio allo 0,5%, che è stato precedentemente segnalato come un mezzo di innesto ideale^11,12.

La crescita ottimale della piantina non può essere raggiunt...

Discussione

Riassunto e significato
La formazione di un'unione di innesto è fondamentale per un innesto di successo, che richiede un contatto diretto e indisturbato tra il portinnesto e il rampollo. Le dimensioni in miniatura e la fragilità delle piantine di piccole piante come Arabidopsis rendono tecnicamente difficile soddisfare questo requisito. Una tecnica sviluppata nei primi metodi di innesto della piantina di Arabidopsis era quella di inserire sia il rampollo che il portainnesto in un c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tubes	VWR International Inc	10026-076
ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L	VWR	BJAH010-4
BactoAgar	Sigma	A1296-500g
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit	Dow	2646340
D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg	Fisher Scientific	BP220-1
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500	Fisher Scientific	20901-551 / 05-402
Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-164
Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape	Fisher Scientific	15-901-111
Fisherbrand square petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711A
Leica Zoom 2000 Stereo Microscope	Microscope Central	L-Z2000
Micropore Tape	3M	B0082A9FEM
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519-10L
Parafilm	Genesee Scientific	16-101
potassium hydroxide	VWR International Inc	AA13451-36
Redi-earth Plug and Seedling Mix	Sun Gro Horticulture	SUN239274728CFLP
Scotts Osmocote Plus	Hummert International	7630600
Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade	Fisher Scientific	22-079-697
Tween 20, 500 mL	Fisher Scientific	BP337500
TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM	VWR	102091-580