تحليل الخلية الواحدة للتعبير عن جينات حقنة الزائفة داخل الأنسجة النباتية

Summary

يصف البروتوكول الحالي طريقة تسمح بتحليل التعبير الجيني أحادي الخلية على مجموعات محاقن Pseudomonas المزروعة داخل نبات apoplast.

Abstract

عدد كبير من الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض تهاجم النباتات باستمرار. يشمل مجمع أنواع Pseudomonas syringae البكتيريا المسببة للأمراض النباتية سالبة الجرام ذات الأهمية الخاصة لعدد كبير من المضيفين. تدخل P. syringae النبات من سطح الورقة وتتكاثر بسرعة داخل apoplast ، وتشكل مستعمرات دقيقة تشغل الفضاء بين الخلايا. يسمح التعبير التأسيسي للبروتينات الفلورية بواسطة البكتيريا بتصور المستعمرات الدقيقة ومراقبة تطور العدوى على المستوى المجهري. كشفت التطورات الحديثة في تحليل الخلية الواحدة عن التعقيد الكبير الذي وصلت إليه مجموعات البكتيريا المتجانسة المولدة للتنسيج. هذا التعقيد ، الذي يشار إليه باسم عدم التجانس الظاهري ، هو نتيجة للاختلافات من خلية إلى أخرى في التعبير الجيني (غير المرتبط بالاختلافات الجينية) بين المجتمع البكتيري. لتحليل التعبير عن المواقع الفردية على مستوى الخلية الواحدة ، تم استخدام عمليات الاندماج النسخية للبروتينات الفلورية على نطاق واسع. في ظل ظروف الإجهاد ، مثل تلك التي تحدث أثناء استعمار نبات apoplast ، تتمايز P. syringae إلى مجموعات فرعية متميزة بناء على التعبير غير المتجانس لجينات الفوعة الرئيسية (أي نظام إفراز Hrp من النوع الثالث). ومع ذلك ، فإن تحليل الخلية الواحدة لأي مجموعة معينة من P. syringae المستعادة من الأنسجة النباتية يمثل تحديا بسبب الحطام الخلوي المنبعث أثناء الاضطراب الميكانيكي الجوهري لعمليات التلقيح والاستخراج البكتيري. ويفصل هذا التقرير طريقة وضعت لرصد التعبير عن جينات P. syringae ذات الأهمية على مستوى الخلية الواحدة أثناء استعمار نبات الأرابيدوبسيس والفاصوليا. يتم وصف تحضير النباتات والمعلقات البكتيرية المستخدمة للتلقيح باستخدام غرفة مفرغة. كما يتم شرح تعافي البكتيريا الداخلية من الأوراق المصابة عن طريق استخراج السوائل apoplastic هنا. تم تحسين كل من طرق التلقيح البكتيري والاستخراج البكتيري تجريبيا لتقليل تلف الخلايا النباتية والبكتيرية ، مما أدى إلى الاستعدادات البكتيرية المثلى للفحص المجهري وتحليل التدفق الخلوي.

Introduction

تظهر البكتيريا المسببة للأمراض اختلافات في الأنماط الظاهرية المتنوعة ، مما يؤدي إلى تكوين مجموعات فرعية داخل مجموعات متطابقة وراثيا. تعرف هذه الظاهرة باسم عدم التجانس الظاهري وقد تم اقتراحها كاستراتيجية تكيف أثناء التفاعلات بين البكتيريا^{والمضيف 1}. عززت التطورات الحديثة في الدقة البصرية للمجاهر متحدة البؤر ، وقياس التدفق الخلوي ، والموائع الدقيقة ، جنبا إلى جنب مع البروتينات الفلورية ، تحليلات الخلية الواحدة لمجموعات البكتيريا².

حقنة Pseudomonas سالبة الجرام هي بكتيريا ممرضة نباتية نموذجية نظرا لأهميتها الأكاديمية والاقتصادية³. ترتبط دورة حياة P. syringae بدورة المياه⁴. تدخل P. syringae إلى الفراغات بين الخلايا بين خلايا الميزوفيل ، وهي أبوبلاست أوراق النبات ، من خلال فتحات طبيعية مثل الثغور أو الجروح⁵. بمجرد دخول P. syringae إلى apoplast ، يعتمد على نظام إفراز النوع الثالث (T3SS) والمستجيبات المنقولة من النوع الثالث (T3E) لقمع مناعة النبات والتعامل مع الوظائف الخلوية للنبات لصالح العامل الممرض⁶. يعتمد التعبير عن T3SS و T3E على المنظم الرئيسي HrpL ، وهو عامل سيجما بديل يرتبط بزخارف صندوق hrp في منطقة المروج للجينات المستهدفة⁷.

من خلال توليد اندماجات نسخية موجودة بالكروموسوم إلى جينات البروتين الفلوري في اتجاه مجرى الجين محل الاهتمام ، يمكن للمرء مراقبة التعبير الجيني بناء على مستويات التألق المنبعثة على مستوى الخلية^{الواحدة 8}. باستخدام هذه الطريقة ، ثبت أن التعبير عن hrpL غير متجانس داخل كل من الثقافات البكتيرية المزروعة في المختبر وداخل المجموعات البكتيرية المستعادة من نبات apoplast ^8,9. على الرغم من أن تحليل التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة يتم إجراؤه عادة في المزارع البكتيرية المزروعة في الوسائط المختبرية ، إلا أنه يمكن أيضا إجراء مثل هذه التحليلات على المجموعات البكتيرية التي تنمو داخل النبات ، وبالتالي توفير معلومات قيمة عن تكوين مجموعات فرعية في السياق الطبيعي. أحد القيود المحتملة لتحليل المجموعات البكتيرية المستخرجة من النبات هو أن طرق التلقيح الكلاسيكية عن طريق تسلل ضغط الحقن إلى الأبوبلاست ، يليها الاستخراج البكتيري عن طريق نقع أنسجة الأوراق ، عادة ما تولد كمية كبيرة من حطام النبات الخلوي الذي يتداخل مع تحليل المصب¹⁰. يتكون معظم الحطام الخلوي من شظايا الفلورسنت الذاتي من البلاستيدات الخضراء التي تتداخل مع مضان GFP ، مما يؤدي إلى نتائج مضللة.

يصف البروتوكول الحالي عملية تحليل عدم تجانس التعبير الجيني أحادي الخلية في نظامين مرضيين نموذجيين: النظام الذي تشكله P. syringae pv. سلالة الطماطم DC3000 و Arabidopsis thaliana (Col-0) ، والآخر بواسطة P. syringae الكهروضوئية. سلالة فاسوليكولا 1448A ونباتات الفاصوليا (صنف Phaseolus vulgaris الكندي العجائب). يقترح طريقة التلقيح على أساس التسلل الفراغي باستخدام غرفة فراغ ومضخة ، مما يؤدي إلى طريقة سريعة وخالية من التلف للتسلل إلى الأوراق الكاملة. علاوة على ذلك ، كتحسين للبروتوكولات التقليدية ، يتم استخدام طريقة ألطف لاستخراج البكتيريا من apoplast التي تقلل بشكل كبير من اضطراب الأنسجة ، بناء على استخراج السائل apoplastic عن طريق تطبيق دورات من الضغط الإيجابي والسلبي باستخدام كمية صغيرة من الحجم داخل حقنة.

Protocol

1. إعداد النبات

1. قم بإعداد نباتات Arabidopsis Col-0 باتباع الخطوات أدناه.
   1. املأ أصيصا بقطر 10 سم بمزيج ركيزة نبات الفيرميكوليت 1: 3 (انظر جدول المواد) ، الذي تم سقيه مسبقا ، وقم بتغطية الوعاء بشبكة معدنية مقاس 15 سم × 15 سم بفتحات 1.6 مم × 1.6 مم. اضبط الشبكة المعدنية على التربة الرطبة باستخدام شريط مطاطي (الشكل 1 أ).
   2. باستخدام مسواك مبلل ، زرع بذور أرابيدوبسيس في ثقوب الشبكة المعدنية. ضع ثلاث إلى أربع بذور في مواضع بعيدة داخل الأصيص (الشكل 1 ب ، ج).
   3. قم بتغطية الأواني بقبة بلاستيكية للحفاظ على رطوبة نسبية عالية واحتضانها لمدة 72 ساعة عند 4 درجات مئوية للتقسيم الطبقي.
      ملاحظة: التقسيم الطبقي (الحضانة في الرطوبة العالية ودرجة الحرارة المنخفضة ، كما هو موضح) يحسن معدل إنبات البذور وتزامنها.
   4. انقل الأواني إلى غرفة نمو النبات في ظروف يوم قصير (8 ساعات فاتحة / 16 ساعة داكنة عند 21 درجة مئوية ، شدة الضوء: 100 ميكرومول · م − ² · ثانية ^{− 1} ، الرطوبة النسبية: 70٪).
   5. بعد إنبات البذور (8-10 أيام) ، استخدم الملقط لإزالة معظم الشتلات ، مع الاحتفاظ بشتلة واحدة في كل موضع من مواضع الوعاء (ستة شتلات / وعاء) (الشكل 1 د). قم بإزالة القبة البلاستيكية للكشف عن الأواني.
      ملاحظة: ستكون النباتات جاهزة للاستخدام بعد 4-5 أسابيع من الإنبات.
2. تحضير نباتات فول فاسولوس فولغاريس (الصنف الكندي العجيب).
   1. غطي قاع طبق بتري بقطعة مبللة من ورق المنشفة ، وضع بذور الفاصوليا فوقه. ختم طبق بتري بشريط جراحي واحتضانه عند 28 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام (الشكل 2 أ).
   2. انقل البذور النابتة إلى إناء قطره 10 سم مملوء بمزيج الركيزة الرطب 1: 3 من نبات الفيرميكوليت.
   3. احتضان في غرفة نمو النبات تحت إعدادات اليوم الطويل (16 ساعة ضوء / 8 ساعات مظلمة عند 23 درجة مئوية ، شدة الضوء: 100 ميكرومول · م − ² · ثانية ^{− 1} ، الرطوبة النسبية: 70٪).
      ملاحظة: ستكون النباتات جاهزة للاستخدام بعد 10 أيام من الإنبات (الشكل 2 ب).

2. تلقيح نباتات أرابيدوبسيس والفاصوليا

ملاحظة: في هذه الدراسة ، سلالات P. syringae pv. الطماطم DC3000 و P. syringae الكهروضوئية. تم استخدام فاسوليكولا 1448A.

1. تحضير لقاح P. syringae.
   1. قم بإخراج سلالة P. syringae ذات الأهمية من مخزون الجلسرين -80 درجة مئوية على صفيحة LB (10 جم / لتر تريبتون ، 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 5 جم / لتر مستخلص خميرة ، و 16 جم / لتر أجار بكتريولوجي ، انظر جدول المواد) مكملة بالمضادات الحيوية المناسبة. احتضان في 28 درجة مئوية لمدة 40-48 ساعة.
      ملاحظة: يوصى باستخدام المضادات الحيوية إذا كانت السلالة محل الاهتمام تحمل بلازميد أو جين مقاومة جينومية. تركيزات المضادات الحيوية الموصى بها ل P. syringae هي كما يلي: كاناميسين (15 ميكروغرام / مل) ، جنتاميسين (10 ميكروغرام / مل) ، أمبيسلين (300 ميكروغرام / مل) (انظر جدول المواد).
   2. كشط الكتلة الحيوية البكتيرية وإعادة تعليقها في 5 مل من 10 mM MgCl₂. قم بقياس OD₆₀₀ واضبطه على 0.1 بإضافة 10 mM MgCl₂.
      ملاحظة: OD₆₀₀ من 0.1 من P. syringae المستنبتة يتوافق مع 5 × 10⁷ CFU · ^{mL − 1}.
   3. قم بإجراء التخفيفات التسلسلية إلى 10 mM MgCl₂ للوصول إلى تركيز اللقاح النهائي 5 × 10⁵ CFU · ^{mL − 1}. تحضير 200 مل من اللقاح لنباتات أرابيدوبسيس و 50 مل لنباتات الفاصوليا.
   4. قبل التلقيح مباشرة ، أضف الفاعل بالسطح Silwett L-77 (انظر جدول المواد) إلى تركيز نهائي قدره 0.02٪ لتلقيح الفاصوليا و 0.01٪ ل Arabidopsis. لاحظ أن Silwett ضار إلى حد ما بأنسجة Arabidopsis.
2. أداء تسلل فراغ.
   1. لتسلل Arabidopsis ، ضع اثنين من العصي الخشبية لتشكيل X فوق القدر (الشكل 1E) ، ووضع القدر متجها لأسفل فوق طبق بتري قطره 14 سم يحتوي على لقاح 200 مل (الشكل 1F).
   2. لتلقيح أوراق الفاصوليا ، أدخل الورقة في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل يحتوي على اللقاح (الشكل 2C).
   3. أدخل النباتات المغمورة في محلول اللقاح في غرفة مفرغة (الشكل 1G والشكل 2D) وأعط نبضة 500 ملي بار لمدة 30 ثانية للتسلل إلى الأوراق. كرر نبضة الفراغ 2-3 مرات حتى تتسلل الورقة تماما (الشكل 1H والشكل 2E).
   4. استنزاف محلول اللقاح الزائد بقطعة من الورق وأعد النباتات إلى غرفة النمو المقابلة لها.

3. استخراج البكتيريا من apoplast

1. بعد أربعة أيام من التلقيح ، اقطع إما الجزء الجوي من نبات Arabidopsis أو الورقة الملقحة من نبات الفاصوليا وضعها في حقنة سعة 20 مل بدون إبرة (الشكل 2G). بالنسبة لأوراق الفاصوليا ، لف الورقة على نفسها ، مع ترك الوجه المحوري للخارج ، كما هو موضح في الشكل 2F.
2. أضف كمية كافية من الماء المقطر لتغطية الأنسجة (عادة 10-15 مل).
3. أدخل المكبس ، ومع وضع المحقنة في الوضع الرأسي مع توجيه الطرف لأعلى ، قم بإزالة الهواء الزائد وفقاعات الهواء داخل المحقنة عن طريق النقر برفق على البرميل حتى يقع كل الهواء بالقرب من الحافة. حرك ثم المكبس لإخراج الهواء. بمجرد وجود أقل قدر ممكن من الهواء داخل المحقنة ، قم بتغطية طرف برميل المحقنة بغشاء البارافين.
4. اضغط بعناية على المكبس لتوليد ضغط إيجابي حتى يصبح النسيج أغمق (الشكل 1I والشكل 2H). ثم اسحب المكبس لتوليد ضغط سلبي (الشكل 1J والشكل 2I). كرر هذه الخطوة 3-5 مرات.
5. قم بإزالة غشاء البارافين والمكبس واجمع السائل الذي يحتوي على البكتيريا المستخرجة من الأبوبلاست ، كما في الشكل 2J.

4. تحليل الخلية الواحدة للبكتيريا المستخرجة من أبوبلاست

1. تصور عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر باتباع الخطوات أدناه.
   1. تحضير محلول أغاروز 1.5 ٪ في الماء المقطر. بمجرد الذوبان ، أضف حجما كافيا لملء الفراغ بين شريحتين مجهريتين جنبا إلى جنب وضع شريحة أخرى فوقها (الشكل 3). اتركها تجف لمدة 15 دقيقة وقم بإزالة الشريحة الموضوعة في الأعلى بعناية. باستخدام شفرة ، قم بقطع وسادة الأغاروز إلى قطع 5 مم × 5 مم قبل الاستخدام مباشرة.
   2. بالتوازي مع ذلك ، فإن أجهزة الطرد المركزي 1 مل من البكتيريا المستخرجة من أبوبلاست عند 12000 × جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة ، وأعد تعليق الحبيبات إلى 20 ميكرولتر من الماء لتركيز الخلايا. ضع قطرة 2 ميكرولتر من الخلايا المركزة على غطاء 0.17 مم وقم بتغطية القطرة بقطعة 5 مم × 5 مم من وسادة الأغاروز التي تم الحصول عليها مسبقا في الخطوة 1 ، كما هو موضح في الشكل 3.
   3. تصور التحضير البكتيري تحت المجهر متحد البؤر (انظر جدول المواد). لتحديد البكتيريا الفلورية الخضراء ، استخدم ليزر الإثارة عند 488 نانومتر ومرشح انبعاث يتراوح من 500 نانومتر إلى 550 نانومتر. لتحديد جميع البكتيريا ، استخدم الحقل الساطع وادمج كلا الحقلين.
   4. معالجة الصور متحدة البؤر باستخدام فيجي (انظر جدول المواد). للقيام بذلك ، استخدم المكون الإضافي MicrobeJ لتحديد محيط الخلية البكتيرية وقياس شدة التألق بداخلها.
      ملاحظة: يوصى بالحصول على الصور من البكتيريا المعزولة (غير المجمعة) لهذا التحليل.
2. إجراء التحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي.
   1. خذ حصة من معلقات البكتيريا المستخرجة من apoplast لتحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي. الحصول على 100000 حدث.
   2. للتمييز بين البكتيريا وحطام النبات ، قم بتحليل apoplast المستخرج من نبات غير ملقح وقارن الرسم البياني النقطي الذي يوضح حجم خلية التشتت الأمامي (FSC) مقابل حجم خلية التشتت الجانبي (SSC) مع حجم المعلق البكتيري المستخرج من أبوبلاست. لتحديد البكتيريا غير الفلورية ، استخدم apoplasts المستخرجة من النباتات الملقحة بالبكتيريا متساوية المنشأ غير الفلورية وقارن انبعاثاتها الفلورية.

النتائج

يعد التعبير عن نظام الإفراز من النوع الثالث ضروريا لنمو البكتيريا داخل النبات. يتم تحقيق التعبير في الوقت المناسب عن جينات T3SS من خلال التنظيم المعقد ، وفي مركزه عامل سيغما للوظيفة خارج الهيولى (ECF) HrpL ، المنشط الرئيسي للتعبير عن الجينات المرتبطة ب T3SS¹¹. تم إجراء تحليل للتعبير عن...

Discussion

تصف الطريقة المعروضة هنا إجراء غير جراحي يسمح بتسلل البكتيريا إلى الأنسجة الورقية النباتية ، مما يسمح بالتلقيح السريع لكميات كبيرة مع تقليل اضطراب الأنسجة. واحدة من خصائص مجمع أنواع P. syringae هي القدرة على البقاء والتكاثر داخل apoplast النبات وعلى سطح النبات كما epiphyte¹⁴. وبالتال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.17 mm coverslip			No special requirements
1.6 x 1.6 mm metal mesh	Buzifu		Fiberglass screen mesh
10 cm diameter pots			No special requirements
140 mm Petri dishes			No special requirements
20 mL syringe			No special requirements
50 mL conical tubes	Sarstedt
Agarose	Merk
Ampicillin sodium	GoldBio
Bacteriological agar	Roko
Confocal Microscope Stellaris	Leica Microsystems
FACSVerse cell analyzer	BD Biosciences
Fiji software
Gentamycin sulfate	Duchefa	G-0124
Kanamycin monosulfate	Phytotechnology	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging
Plant substrate			No special requirements
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Toothpicks			No special requirements
Tryptone	Merk
Tweezers			No special requirements
Vacuum chamber 25 cm diameter	Kartell	554
Vacuum pump	GAST	DOA-P504-BN
Vermiculite			No special requirements
Yeast Extract	Merk