Einzelzellanalyse der Expression von Pseudomonas syringae-Genen im Pflanzengewebe

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode, die eine Einzelzell-Genexpressionsanalyse an Pseudomonas syringae-Populationen ermöglicht, die innerhalb des Pflanzenapoplasten gezüchtet werden.

Zusammenfassung

Eine Vielzahl pathogener Mikroorganismen greift ständig Pflanzen an. Der Artenkomplex von Pseudomonas syringae umfasst gramnegative pflanzenpathogene Bakterien, die für eine Vielzahl von Wirten von besonderer Bedeutung sind. P. syringae dringt von der Blattoberfläche in die Pflanze ein und vermehrt sich schnell innerhalb des Apoplasten, wobei Mikrokolonien gebildet werden, die den Interzellularraum einnehmen. Die konstitutive Expression von fluoreszierenden Proteinen durch die Bakterien ermöglicht die Visualisierung der Mikrokolonien und die Überwachung der Entwicklung der Infektion auf mikroskopischer Ebene. Jüngste Fortschritte in der Einzelzellanalyse haben die große Komplexität klonaler isogener Bakterienpopulationen aufgezeigt. Diese Komplexität, die als phänotypische Heterogenität bezeichnet wird, ist die Folge von Zell-zu-Zell-Unterschieden in der Genexpression (die nicht mit genetischen Unterschieden verbunden sind) in der Bakteriengemeinschaft. Um die Expression einzelner Loci auf Einzelzellebene zu analysieren, sind transkriptionelle Fusionen mit fluoreszierenden Proteinen weit verbreitet. Unter Stressbedingungen, wie sie bei der Besiedlung des Pflanzenapoplasten auftreten, differenziert sich P. syringae aufgrund der heterogenen Expression wichtiger Virulenzgene (d.h. des Hrp-Typ-III-Sekretionssystems) in unterschiedliche Subpopulationen. Die Einzelzellanalyse einer bestimmten P. syringae-Population , die aus Pflanzengewebe gewonnen wurde, ist jedoch aufgrund der Zelltrümmer, die während der mechanischen Störung freigesetzt werden, die den Inokulations- und Bakterienextraktionsprozessen innewohnt, eine Herausforderung. Der vorliegende Bericht beschreibt eine Methode, die entwickelt wurde, um die Expression von P. syringae-Genen von Interesse auf Einzelzellebene während der Besiedlung von Arabidopsis und Bohnenpflanzen zu überwachen. Die Herstellung der Pflanzen und die zur Inokulation verwendeten Bakteriensuspensionen unter Verwendung einer Vakuumkammer werden beschrieben. Hier wird auch die Rückgewinnung von endophytischen Bakterien aus infizierten Blättern durch apoplastische Flüssigkeitsextraktion erläutert. Sowohl die bakterielle Inokulation als auch die bakterielle Extraktionsmethode sind empirisch optimiert, um die Schädigung von Pflanzen- und Bakterienzellen zu minimieren, was zu bakteriellen Präparaten führt, die für die Mikroskopie und Durchflusszytometrieanalyse optimal sind.

Einleitung

Pathogene Bakterien weisen Unterschiede in verschiedenen Phänotypen auf, was zur Bildung von Subpopulationen innerhalb genetisch identischer Populationen führt. Dieses Phänomen wird als phänotypische Heterogenität bezeichnet und wurde als Anpassungsstrategie während der Bakterien-Wirt-Interaktionen vorgeschlagen¹. Jüngste Fortschritte in der optischen Auflösung von konfokalen Mikroskopen, Durchflusszytometrie und Mikrofluidik in Kombination mit fluoreszierenden Proteinen haben Einzelzellanalysen von Bakterienpopulationen gefördert².

Der gramnegative Pseudomonas syringae ist aufgrund seiner akademischen und wirtschaftlichen Bedeutung ein archetypisches pflanzenpathogenes Bakterium³. Der Lebenszyklus von P. syringae ist mit dem Wasserkreislauf^{verbunden 4}. P. syringae dringt durch natürliche Öffnungen wie Stomata oder Wunden in die Interzellularräume zwischen den Mesophyllzellen, dem Pflanzenblattapoplasten, ein⁵. Im Apoplast verlässt sich P. syringae auf das Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) und die Typ-III-translozierten Effektoren (T3E), um die pflanzliche Immunität zu unterdrücken und pflanzliche Zellfunktionen zum Wohle des Erregers zu manipulieren⁶. Die Expression von T3SS und T3E hängt vom Hauptregulator HrpL ab, einem alternativen Sigma-Faktor, der an die hrp-Box-Motive in der Promotorregion der Zielgene⁷ bindet.

Durch die Erzeugung chromosomenlokaler transkriptioneller Fusionen mit fluoreszierenden Proteingenen stromabwärts des interessierenden Gens kann man die Genexpression basierend auf den Fluoreszenzniveaus überwachen, die auf Einzelzellebene emittiert werden⁸. Mit dieser Methode wurde festgestellt, dass die Expression von hrpL sowohl innerhalb von Bakterienkulturen, die im Labor gezüchtet wurden, als auch innerhalb von Bakterienpopulationen, die aus dem Pflanzenapoplasten ^8,9 gewonnen wurden, heterogen ist. Obwohl Genexpressionsanalysen auf Einzelzellebene typischerweise in Bakterienkulturen durchgeführt werden, die in Labormedien gezüchtet werden, können solche Analysen auch an Bakterienpopulationen durchgeführt werden, die in der Pflanze wachsen, und liefern so wertvolle Informationen über die Bildung von Subpopulationen im natürlichen Kontext. Eine mögliche Einschränkung für die Analyse von Bakterienpopulationen, die aus der Pflanze extrahiert werden, besteht darin, dass klassische Inokulationsmethoden durch Spritzendruckinfiltration in den Apoplasten, gefolgt von einer bakteriellen Extraktion durch Mazeration des Blattgewebes, typischerweise eine große Menge zellulärer Pflanzenreste erzeugen, die die nachgeschaltete Analyse stören¹⁰. Die meisten Zelltrümmer bestehen aus autofluoreszierenden Fragmenten von Chloroplasten, die sich mit der GFP-Fluoreszenz überlappen, was zu irreführenden Ergebnissen führt.

Das vorliegende Protokoll beschreibt den Prozess der Analyse der Heterogenität der Einzelzell-Genexpression in zwei Modell-Pathosystemen: dem von der P. syringae pv. Tomatenstamm DC3000 und Arabidopsis thaliana (Col-0), und der andere durch die P. syringae pv. Phaseolicola-Stamm 1448A und Bohnenpflanzen (Phaseolus vulgaris-Sorte , Canadian Wonder). Es wird eine Inokulationsmethode vorgeschlagen, die auf einer Vakuuminfiltration unter Verwendung einer Vakuumkammer und einer Pumpe basiert, was zu einer schnellen und schadensfreien Methode zum Infiltrieren ganzer Blätter führt. Darüber hinaus wird als Verbesserung gegenüber herkömmlichen Protokollen eine schonendere Methode verwendet, um die Bakterienpopulation aus dem Apoplasten zu extrahieren, die die Gewebezerstörung signifikant reduziert, basierend auf der Extraktion von apoplastischer Flüssigkeit durch Anlegen von Über- und Unterdruckzyklen mit einer kleinen Menge Volumen innerhalb einer Spritze.

Protokoll

1. Pflanzenvorbereitung

1. Bereiten Sie Arabidopsis Col-0-Pflanzen vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Füllen Sie einen Topf mit einem Durchmesser von 10 cm mit einer zuvor bewässerten 1:3-Vermiculit-Pflanzensubstratmischung (siehe Materialtabelle) und decken Sie den Topf mit einem 15 cm x 15 cm großen Metallgitter mit 1,6 mm x 1,6 mm großen Löchern ab. Passen Sie das Metallgitter mit einem Gummiband an den nassen Boden an (Abbildung 1A).
   2. Säen Sie Arabidopsis-Samen mit einem feuchten Zahnstocher in die Löcher des Metallgitters. Platzieren Sie drei bis vier Samen an entfernten Positionen im Topf (Abbildung 1B, C).
   3. Decken Sie die Töpfe mit einer Kunststoffkuppel ab, um eine hohe relative Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, und inkubieren Sie sie 72 h bei 4 °C zur Schichtung.
      HINWEIS: Die Schichtung (Inkubation bei hoher Luftfeuchtigkeit und niedriger Temperatur, wie beschrieben) verbessert die Keimrate und Synchronität der Samen.
   4. Überführen der Töpfe in eine Pflanzenwachstumskammer unter Kurztagesbedingungen (8 h hell/16 h dunkel bei 21 °C, Lichtintensität: 100 μmol·m−²·s⁻¹, relative Luftfeuchtigkeit: 70%).
   5. Entfernen Sie nach der Samenkeimung (8-10 Tage) mit der Pinzette die meisten Sämlinge und halten Sie einen Sämling in jeder der Positionen des Topfes (sechs Sämlinge/Topf) (Abbildung 1D). Entfernen Sie die Plastikkuppel, um die Töpfe freizulegen.
      HINWEIS: Die Pflanzen sind 4-5 Wochen nach der Keimung gebrauchsfertig.
2. Bereiten Sie Phaseolus vulgaris-Bohnenpflanzen (Sorte Canadian Wonder) vor.
   1. Decken Sie den Boden einer Petrischale mit einem feuchten Stück Handtuchpapier ab und legen Sie die Bohnensamen darauf. Verschließen Sie die Petrischale mit chirurgischem Klebeband und inkubieren Sie sie 3-4 Tage lang bei 28 °C (Abbildung 2A).
   2. Übertragen Sie die gekeimten Samen in einen Topf mit einem Durchmesser von 10 cm, der mit einer feuchten 1:3-Mischung aus Vermiculit-Pflanzensubstrat gefüllt ist.
   3. Inkubation in einer Pflanzenwachstumskammer unter Langzeiteinstellungen (16 h hell/8 h dunkel bei 23 °C, Lichtintensität: 100 μmol·m−²·s⁻¹, relative Luftfeuchtigkeit: 70%).
      HINWEIS: Die Pflanzen sind 10 Tage nach der Keimung gebrauchsfertig (Abbildung 2B).

2. Inokulation von Arabidopsis und Bohnenpflanzen

HINWEIS: In dieser Studie wurden die Stämme P. syringae pv. Tomate DC3000 und P. syringae pv. Es wurden Phaseolicola 1448A verwendet.

1. Bereiten Sie das Inokulum von P. syringae vor.
   1. Den interessierenden P. syringae-Stamm aus einem Glycerinvorrat von −80 °C auf eine LB-Platte (10 g/l Trypton, 5 g/l NaCl, 5 g/l Hefeextrakt und 16 g/l bakteriologisches Agar, siehe Materialtabelle) auftragen, die mit den entsprechenden Antibiotika ergänzt wird. Bei 28 °C 40-48 h inkubieren.
      HINWEIS: Die Verwendung von Antibiotika wird empfohlen, wenn der interessierende Stamm ein Plasmid oder ein genomisches Resistenzgen trägt. Die empfohlenen Antibiotika-Konzentrationen für P. syringae sind wie folgt: Kanamycin (15 μg/ml), Gentamycin (10 μg/ml), Ampicillin (300 μg/ml) (siehe Materialtabelle).
   2. Die bakterielle Biomasse wird ausgekratzt und in 5 ml 10 mM MgCl₂ resuspendiert. Messen Sie den OD₆₀₀ und stellen Sie ihn durch Zugabe von 10 mM MgCl₂ auf 0,1 ein.
      ANMERKUNG: Ein OD₆₀₀ von 0,1 einer P. syringae-Kultur entspricht 5 x 10⁷ KBE^·ml−1.
   3. Führen Sie serielle Verdünnungen in 10 mM MgCl₂ durch, um eine endgültige Inokulumkonzentration von 5 x 10⁵ KBE^·ml−1 zu erreichen. Bereiten Sie 200 ml Inokulum für die Arabidopsis-Pflanzen und 50 ml für die Bohnenpflanzen vor.
   4. Kurz vor der Inokulation wird das Tensid Silwett L-77 (siehe Materialtabelle) bis zu einer Endkonzentration von 0,02 % für die Bohneninokulation und 0,01 % für Arabidopsis zugegeben. Beachten Sie, dass Silwett für das Arabidopsis-Gewebe etwas schädlich ist.
2. Führen Sie eine Vakuuminfiltration durch.
   1. Für die Arabidopsis-Infiltration legen Sie zwei Holzstäbchen, die ein X bilden, über den Topf (Abbildung 1E) und stellen Sie den Topf mit der Vorderseite nach unten auf eine Petrischale mit einem Durchmesser von 14 cm, die das 200-ml-Inokulum enthält (Abbildung 1F).
   2. Für die Inokulation mit Bohnenblättern wird das Blatt in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben, das das Inokulum enthält (Abbildung 2C).
   3. Setzen Sie die in die Inokulumlösung getauchten Pflanzen in eine Vakuumkammer ein (Abbildung 1G und Abbildung 2D) und geben Sie einen Impuls von 500 mbar für 30 s, um die Blätter zu infiltrieren. Wiederholen Sie den Vakuumimpuls 2-3 Mal, bis das Blatt vollständig infiltriert ist (Abbildung 1H und Abbildung 2E).
   4. Lassen Sie die überschüssige Inokulumlösung mit einem Blatt Papier ab und bringen Sie die Pflanzen in die entsprechende Wachstumskammer zurück.

3. Extraktion von Bakterien aus dem Apoplast

1. Schneiden Sie vier Tage nach der Inokulation entweder den oberirdischen Teil der Arabidopsis-Pflanze oder das beimpfte Blatt von der Bohnenpflanze ab und geben Sie es ohne Nadel in eine 20-ml-Spritze (Abbildung 2G). Rollen Sie bei Bohnenblättern das Blatt auf sich selbst und lassen Sie die abaxiale Fläche nach außen, wie in Abbildung 2F dargestellt.
2. Fügen Sie genügend destilliertes Wasser hinzu, um das Gewebe zu bedecken (normalerweise 10-15 ml).
3. Setzen Sie den Kolben ein und entfernen Sie mit der Spritze in vertikaler Position mit der Spitze nach oben die überschüssige Luft und die Luftblasen in der Spritze, indem Sie vorsichtig auf den Zylinder klopfen, bis sich die gesamte Luft in der Nähe der Spitze befindet. Schieben Sie dann den Kolben, um die Luft herauszunehmen. Sobald sich so wenig Luft wie möglich in der Spritze befindet, bedecken Sie die Spitze des Spritzenzylinders mit Paraffinfolie.
4. Drücken Sie vorsichtig auf den Kolben, um einen Überdruck zu erzeugen, bis das Gewebe dunkler wird (Abbildung 1I und Abbildung 2H). Ziehen Sie dann am Kolben, um Unterdruck zu erzeugen (Abbildung 1J und Abbildung 2I). Wiederholen Sie diesen Schritt 3-5 Mal.
5. Entfernen Sie den Paraffinfilm und den Kolben und sammeln Sie die Flüssigkeit, die die aus dem Apoplast extrahierten Bakterien enthält, wie in Abbildung 2J dargestellt.

4. Einzelzellanalyse der Apoplast-extrahierten Bakterien

1. Visualisieren Sie durch konfokale Mikroskopie, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Bereiten Sie eine 1,5% ige Agaroselösung in destilliertem Wasser vor. Fügen Sie nach dem Schmelzen genügend Volumen hinzu, um den Raum zwischen zwei nebeneinander angeordneten Objektträgern zu füllen, und legen Sie einen weiteren Objektträger darauf (Abbildung 3). Lassen Sie sie 15 Minuten trocknen und entfernen Sie vorsichtig den Objektträger auf der Oberseite. Schneiden Sie das Agarosepad kurz vor Gebrauch mit einer Klinge in 5 mm x 5 mm große Stücke.
   2. Parallel dazu wird 1 ml der Apoplast-extrahierten Bakterien bei 12.000 x g für 1 Minute bei Raumtemperatur zentrifugiert, der Überstand vorsichtig mit einer Pipette entfernt und das Pellet in 20 μl Wasser resuspendiert, um die Zellen zu konzentrieren. Geben Sie einen 2-μl-Tropfen der konzentrierten Zellen auf ein 0,17-mm-Deckglas und bedecken Sie den Tropfen mit einem 5 mm x 5 mm großen Stück des zuvor in Schritt 1 erhaltenen Agarosekissens, wie in Abbildung 3 dargestellt.
   3. Visualisieren Sie das bakterielle Präparat unter dem konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle). Um grün fluoreszierende Bakterien zu identifizieren, verwenden Sie den Anregungslaser bei 488 nm und einen Emissionsfilter im Bereich von 500 nm bis 550 nm. Um alle Bakterien zu identifizieren, verwenden Sie das helle Feld und führen Sie beide Felder zusammen.
   4. Verarbeiten Sie die konfokalen Bilder mit Fidschi (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie dazu das MicrobeJ-Plugin, um die Kontur der Bakterienzelle zu identifizieren und die Fluoreszenzintensität im Inneren zu messen.
      HINWEIS: Für diese Analyse wird die Aufnahme von Bildern von isolierten Bakterien (nicht geclustert) empfohlen.
2. Führen Sie eine Analyse mittels Durchflusszytometrie durch.
   1. Nehmen Sie ein Aliquot der Apoplast-extrahierten Bakteriensuspensionen, um es mit dem Durchflusszytometer zu analysieren. Erwerben Sie 100.000 Ereignisse.
   2. Um zwischen Bakterien und Pflanzenresten zu unterscheiden, analysieren Sie den Apoplasten, der aus einer nicht inokulierten Pflanze extrahiert wurde, und vergleichen Sie das Punktdiagramm, das seine Vorwärtsstreuzellgröße (FSC) im Vergleich zur Seitenstreuzellgröße (SSC) zeigt, mit der der Apoplast-extrahierten Bakteriensuspension. Um nicht fluoreszierende Bakterien zu identifizieren, verwenden Sie die Apoplasten, die aus den Pflanzen extrahiert wurden, die mit nicht fluoreszierenden isogenen Bakterien geimpft wurden, und vergleichen Sie ihre fluoreszierenden Emissionen.

Ergebnisse

Die Expression des Typ-III-Sekretionssystems ist essentiell für das Bakterienwachstum innerhalb der Pflanze. Die rechtzeitige Expression von T3SS-Genen wird durch eine komplizierte Regulation erreicht, in deren Zentrum der extrazytoplasmatische Funktion (ECF) Sigma-Faktor HrpL steht, der Schlüsselaktivator der Expression von T3SS-verwandten Genen¹¹. Eine Analyse der Expression von hrpL wurde zuvor unter Verwendung einer chromosomenlokalisierten transkriptionellen Fusion zu einem nachges...

Diskussion

Die hier vorgestellte Methode beschreibt ein nicht-invasives Verfahren, das die Infiltration von Bakterien in das pflanzliche Blattgewebe ermöglicht und so die schnelle Inokulation großer Volumina bei gleichzeitiger Minimierung des Gewebeaufschlusses ermöglicht. Eines der Merkmale des P. syringae-Artenkomplexes ist die Fähigkeit, im Pflanzenapoplasten und auf der Pflanzenoberfläche als Epiphyt¹⁴ zu überleben und sich zu vermehren. Somit kann nicht ausgeschlossen werden, dass die unt...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.17 mm coverslip			No special requirements
1.6 x 1.6 mm metal mesh	Buzifu		Fiberglass screen mesh
10 cm diameter pots			No special requirements
140 mm Petri dishes			No special requirements
20 mL syringe			No special requirements
50 mL conical tubes	Sarstedt
Agarose	Merk
Ampicillin sodium	GoldBio
Bacteriological agar	Roko
Confocal Microscope Stellaris	Leica Microsystems
FACSVerse cell analyzer	BD Biosciences
Fiji software
Gentamycin sulfate	Duchefa	G-0124
Kanamycin monosulfate	Phytotechnology	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging
Plant substrate			No special requirements
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Toothpicks			No special requirements
Tryptone	Merk
Tweezers			No special requirements
Vacuum chamber 25 cm diameter	Kartell	554
Vacuum pump	GAST	DOA-P504-BN
Vermiculite			No special requirements
Yeast Extract	Merk