Bitki Dokusu İçindeki Pseudomonas syringae Genlerinin Ekspresyonunun Tek Hücreli Analizi

Özet

Bu protokol, bitki apoplastı içinde yetiştirilen Pseudomonas şırıngası popülasyonları üzerinde tek hücreli gen ekspresyon analizine izin veren bir yöntemi açıklamaktadır.

Özet

Patojenik mikroorganizmaların bolluğu sürekli olarak bitkilere saldırır. Pseudomonas syringae tür kompleksi, çok sayıda konakçı için özel öneme sahip Gram-negatif bitki-patojenik bakterileri kapsar. P. syringae bitkiye yaprak yüzeyinden girer ve apoplast içinde hızla çoğalarak hücreler arası boşluğu işgal eden mikrokoloniler oluşturur. Floresan proteinlerin bakteriler tarafından yapısal ekspresyonu, mikrokolonilerin görselleştirilmesine ve enfeksiyonun gelişiminin mikroskobik düzeyde izlenmesine izin verir. Tek hücreli analizdeki son gelişmeler, klonal izojenik bakteri popülasyonlarının ulaştığı büyük karmaşıklığı ortaya koymuştur. Fenotipik heterojenite olarak adlandırılan bu karmaşıklık, bakteri topluluğu arasındaki gen ekspresyonundaki (genetik farklılıklarla bağlantılı olmayan) hücreden hücreye farklılıkların sonucudur. Tek hücreli düzeyde bireysel lokusların ekspresyonunu analiz etmek için, floresan proteinlere transkripsiyonel füzyonlar yaygın olarak kullanılmaktadır. Bitki apoplastının kolonizasyonu sırasında meydana gelenler gibi stres koşulları altında, P. syringae , anahtar virülans genlerinin heterojen ekspresyonuna (yani, Hrp tip III sekresyon sistemi) dayanarak farklı alt popülasyonlara ayrılır. Bununla birlikte, bitki dokusundan geri kazanılan herhangi bir P. şırınga popülasyonunun tek hücreli analizi, aşılama ve bakteriyel ekstraksiyon işlemlerine özgü mekanik bozulma sırasında salınan hücresel enkaz nedeniyle zordur. Bu rapor, Arabidopsis ve fasulye bitkilerinin kolonizasyonu sırasında ilgilenilen P. syringae genlerinin ekspresyonunu tek hücre düzeyinde izlemek için geliştirilen bir yöntemi detaylandırmaktadır. Bitkilerin hazırlanması ve bir vakum odası kullanılarak aşılama için kullanılan bakteriyel süspansiyonlar açıklanmaktadır. Endofitik bakterilerin apoplastik sıvı ekstraksiyonu ile enfekte olmuş yapraklardan geri kazanımı da burada açıklanmaktadır. Hem bakteriyel aşılama hem de bakteriyel ekstraksiyon yöntemleri, bitki ve bakteri hücresi hasarını en aza indirmek için ampirik olarak optimize edilmiştir, bu da mikroskopi ve akış sitometri analizi için en uygun bakteriyel preparatlarla sonuçlanır.

Giriş

Patojenik bakteriler, çeşitli fenotiplerde farklılıklar göstererek, genetik olarak özdeş popülasyonlarda alt popülasyonların oluşumuna yol açar. Bu fenomen fenotipik heterojenite olarak bilinir ve bakteriyel-konakçı etkileşimleri sırasında bir adaptasyon stratejisi olarak önerilmiştir¹. Konfokal mikroskopların, akış sitometrisinin ve mikroakışkanların optik çözünürlüğündeki son gelişmeler, floresan proteinlerle birleştiğinde, bakteri popülasyonlarının tek hücreli analizlerini teşvik etmiştir².

Gram-negatif Pseudomonas şırıngası, hem akademik hem de ekonomik önemi nedeniyle arketipik b....

Protokol

1. Bitki hazırlama

1. Aşağıdaki adımları izleyerek Arabidopsis Col-0 tesislerini hazırlayın.
   1. 10 cm çapında bir tencereyi, daha önce sulanmış 1:3 vermikülit-bitki substrat karışımı ile doldurun (bkz. Malzeme Tablosuna bakınız) ve tencereyi 1,6 mm x 1,6 mm deliklere sahip 15 cm x 15 cm metal bir ağ ile örtün. Metal ağı bir lastik bant kullanarak ıslak toprağa ayarlayın (Şekil 1A).
   2. Islak bir kürdanla, Arabidopsis tohumlarını metal ağın deliklerine ekin. Üç ila dört tohumu saksı içinde uzak konumlara yerleştirin (Şekil 1B, C).
   3. ....

Sonuçlar

Tip III sekresyon sisteminin ekspresyonu, bitki içindeki bakteri büyümesi için gereklidir. T3SS genlerinin zamanında ekspresyonu, merkezinde T3SS ile ilişkili genlerin ekspresyonunun anahtar aktivatörü olan ekstrasitoplazmik fonksiyon (ECF) sigma faktörü HrpL olan karmaşık düzenleme yoluyla elde edilir¹¹. HRPL ekspresyonunun bir analizi daha önce aşağı akış promotersiz gfp genine kromozom yerleşimli bir transkripsiyonel füzyon kullanılarak ve konfokal mikros.......

Tartışmalar

Burada sunulan yöntem, bakterilerin bitki yaprak dokusuna sızmasına izin veren, doku bozulmasını en aza indirirken büyük hacimlerin hızlı bir şekilde aşılanmasına izin veren invaziv olmayan bir prosedürü açıklamaktadır. P. syringae tür kompleksinin özelliklerinden biri, bitki apoplastının içinde ve bitki yüzeyinde epifit¹⁴ olarak hayatta kalma ve çoğalma yeteneğidir. Bu nedenle, mevcut protokol kullanılarak ekstrakte edilen bakterilerin sadece bitki apoplastın.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.17 mm coverslip			No special requirements
1.6 x 1.6 mm metal mesh	Buzifu		Fiberglass screen mesh
10 cm diameter pots			No special requirements
140 mm Petri dishes			No special requirements
20 mL syringe			No special requirements
50 mL conical tubes	Sarstedt
Agarose	Merk
Ampicillin sodium	GoldBio
Bacteriological agar	Roko
Confocal Microscope Stellaris	Leica Microsystems
FACSVerse cell analyzer	BD Biosciences
Fiji software
Gentamycin sulfate	Duchefa	G-0124
Kanamycin monosulfate	Phytotechnology	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging
Plant substrate			No special requirements
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Toothpicks			No special requirements
Tryptone	Merk
Tweezers			No special requirements
Vacuum chamber 25 cm diameter	Kartell	554
Vacuum pump	GAST	DOA-P504-BN
Vermiculite			No special requirements
Yeast Extract	Merk