Bitki Dokusu İçindeki Pseudomonas syringae Genlerinin Ekspresyonunun Tek Hücreli Analizi

Özet

Bu protokol, bitki apoplastı içinde yetiştirilen Pseudomonas şırıngası popülasyonları üzerinde tek hücreli gen ekspresyon analizine izin veren bir yöntemi açıklamaktadır.

Özet

Patojenik mikroorganizmaların bolluğu sürekli olarak bitkilere saldırır. Pseudomonas syringae tür kompleksi, çok sayıda konakçı için özel öneme sahip Gram-negatif bitki-patojenik bakterileri kapsar. P. syringae bitkiye yaprak yüzeyinden girer ve apoplast içinde hızla çoğalarak hücreler arası boşluğu işgal eden mikrokoloniler oluşturur. Floresan proteinlerin bakteriler tarafından yapısal ekspresyonu, mikrokolonilerin görselleştirilmesine ve enfeksiyonun gelişiminin mikroskobik düzeyde izlenmesine izin verir. Tek hücreli analizdeki son gelişmeler, klonal izojenik bakteri popülasyonlarının ulaştığı büyük karmaşıklığı ortaya koymuştur. Fenotipik heterojenite olarak adlandırılan bu karmaşıklık, bakteri topluluğu arasındaki gen ekspresyonundaki (genetik farklılıklarla bağlantılı olmayan) hücreden hücreye farklılıkların sonucudur. Tek hücreli düzeyde bireysel lokusların ekspresyonunu analiz etmek için, floresan proteinlere transkripsiyonel füzyonlar yaygın olarak kullanılmaktadır. Bitki apoplastının kolonizasyonu sırasında meydana gelenler gibi stres koşulları altında, P. syringae , anahtar virülans genlerinin heterojen ekspresyonuna (yani, Hrp tip III sekresyon sistemi) dayanarak farklı alt popülasyonlara ayrılır. Bununla birlikte, bitki dokusundan geri kazanılan herhangi bir P. şırınga popülasyonunun tek hücreli analizi, aşılama ve bakteriyel ekstraksiyon işlemlerine özgü mekanik bozulma sırasında salınan hücresel enkaz nedeniyle zordur. Bu rapor, Arabidopsis ve fasulye bitkilerinin kolonizasyonu sırasında ilgilenilen P. syringae genlerinin ekspresyonunu tek hücre düzeyinde izlemek için geliştirilen bir yöntemi detaylandırmaktadır. Bitkilerin hazırlanması ve bir vakum odası kullanılarak aşılama için kullanılan bakteriyel süspansiyonlar açıklanmaktadır. Endofitik bakterilerin apoplastik sıvı ekstraksiyonu ile enfekte olmuş yapraklardan geri kazanımı da burada açıklanmaktadır. Hem bakteriyel aşılama hem de bakteriyel ekstraksiyon yöntemleri, bitki ve bakteri hücresi hasarını en aza indirmek için ampirik olarak optimize edilmiştir, bu da mikroskopi ve akış sitometri analizi için en uygun bakteriyel preparatlarla sonuçlanır.

Giriş

Patojenik bakteriler, çeşitli fenotiplerde farklılıklar göstererek, genetik olarak özdeş popülasyonlarda alt popülasyonların oluşumuna yol açar. Bu fenomen fenotipik heterojenite olarak bilinir ve bakteriyel-konakçı etkileşimleri sırasında bir adaptasyon stratejisi olarak önerilmiştir¹. Konfokal mikroskopların, akış sitometrisinin ve mikroakışkanların optik çözünürlüğündeki son gelişmeler, floresan proteinlerle birleştiğinde, bakteri popülasyonlarının tek hücreli analizlerini teşvik etmiştir².

Gram-negatif Pseudomonas şırıngası, hem akademik hem de ekonomik önemi nedeniyle arketipik bir bitki patojenik bakterisidir³. P. syringae'nin yaşam döngüsü^{su döngüsü 4} ile bağlantılıdır. P. syringae, mezofil hücreleri, bitki yaprağı apoplastı arasındaki hücreler arası boşluklara, stoma veya yaralar gibi doğal açıklıklardan girer⁵. Apoplastın içine girdikten sonra, P. syringae, bitki bağışıklığını baskılamak ve patojen^6'nın yararına bitki hücresel fonksiyonlarını manipüle etmek için tip III sekresyon sistemine (T3SS) ve tip III-translokasyonlu efektörlere (T3E) güvenir. T3SS ve T3E'nin ekspresyonu, hedef genlerin^promotör bölgesindeki hrp-box motiflerine bağlanan alternatif bir sigma faktörü olan ana düzenleyici HrpL'ye bağlıdır 7.

İlgili genin aşağı yönündeki floresan protein genlerine kromozom yerleşimli transkripsiyonel füzyonlar üreterek, tek hücreli seviye^8'de yayılan floresan seviyelerine dayanarak gen ekspresyonunu izleyebiliriz. Bu yöntem kullanılarak, hrpL ekspresyonunun hem laboratuvarda yetiştirilen bakteri kültürlerinde hem de apoplast ^8,9 bitkisinden elde edilen bakteri popülasyonlarında heterojen olduğu tespit edilmiştir. Tek hücreli düzeyde gen ekspresyon analizi tipik olarak laboratuvar ortamında yetiştirilen bakteri kültürlerinde yapılmasına rağmen, bu tür analizler bitki içinde büyüyen bakteri popülasyonları üzerinde de gerçekleştirilebilir, böylece doğal bağlamda alt popülasyonların oluşumu hakkında değerli bilgiler sağlanır. Bitkiden ekstrakte edilen bakteri popülasyonlarının analizi için potansiyel bir sınırlama, apoplasta şırınga basıncı infiltrasyonu ile klasik aşılama yöntemlerinin, ardından yaprak dokusunun maserasyonu ile bakteriyel ekstraksiyonun tipik olarak aşağı akış analizine müdahale eden büyük miktarda hücresel bitki kalıntısı oluşturmasıdır¹⁰. Çoğu hücresel enkaz, GFP floresansı ile örtüşen ve yanıltıcı sonuçlara neden olan otofloresan kloroplast parçalarından oluşur.

Mevcut protokol, iki model patosistemde tek hücreli gen ekspresyon heterojenitesini analiz etme sürecini açıklamaktadır: P. syringae pv tarafından oluşturulan. domates suşu DC3000 ve Arabidopsis thaliana (Col-0), diğeri ise P. syringae pv. phaseolicola suşu 1448A ve fasulye bitkileri (Phaseolus vulgaris çeşidi Kanada Harikası). Bir vakum odası ve bir pompa kullanılarak vakum infiltrasyonuna dayanan bir aşılama yöntemi önerilmiştir, bu da tüm yapraklara sızmak için hızlı ve hasarsız bir yöntemle sonuçlanır. Ayrıca, geleneksel protokollerde bir gelişme olarak, bakteri popülasyonunu apoplasttan çıkarmak için, bir şırınga içinde az miktarda hacim kullanarak pozitif ve negatif basınç döngüleri uygulayarak apoplastik sıvının ekstraksiyonuna dayanarak, doku bozulmasını önemli ölçüde azaltan daha yumuşak bir yöntem kullanılır.

Protokol

1. Bitki hazırlama

1. Aşağıdaki adımları izleyerek Arabidopsis Col-0 tesislerini hazırlayın.
   1. 10 cm çapında bir tencereyi, daha önce sulanmış 1:3 vermikülit-bitki substrat karışımı ile doldurun (bkz. Malzeme Tablosuna bakınız) ve tencereyi 1,6 mm x 1,6 mm deliklere sahip 15 cm x 15 cm metal bir ağ ile örtün. Metal ağı bir lastik bant kullanarak ıslak toprağa ayarlayın (Şekil 1A).
   2. Islak bir kürdanla, Arabidopsis tohumlarını metal ağın deliklerine ekin. Üç ila dört tohumu saksı içinde uzak konumlara yerleştirin (Şekil 1B, C).
   3. Yüksek bağıl nemi korumak için saksıları plastik bir kubbe ile örtün ve tabakalaşma için 4 ° C'de 72 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Tabakalaşma (tarif edildiği gibi yüksek nem ve düşük sıcaklıkta inkübasyon), tohumların çimlenme hızını ve senkronizasyonunu arttırır.
   4. Saksıları kısa gün koşullarında bir bitki büyüme odasına aktarın (21 °C'de 8 saat ışık/16 saat karanlık, ışık yoğunluğu: 100 μmol·m⁻²·s⁻¹, bağıl nem: %70).
   5. Tohum çimlenmesinden sonra (8-10 gün), fidelerin çoğunu çıkarmak için cımbız kullanın, saksının her bir pozisyonunda (altı fide / saksı) bir fide tutun (Şekil 1D). Saksıları ortaya çıkarmak için plastik kubbeyi çıkarın.
      NOT: Bitkiler çimlenmeden 4-5 hafta sonra kullanıma hazır olacaktır.
2. Phaseolus vulgaris fasulyesi (çeşit Kanada Harikası) bitkilerini hazırlayın.
   1. Bir Petri kabının altını ıslak bir havlu kağıdı ile örtün ve fasulye tohumlarını üstüne yerleştirin. Petri kabını cerrahi bantla kapatın ve 3-4 gün boyunca 28 ° C'de inkübe edin (Şekil 2A).
   2. Çimlenmiş tohumları ıslak 1: 3 vermikülit-bitki substrat karışımı ile doldurulmuş 10 cm çapında bir tencereye aktarın.
   3. Uzun gün ayarlarında bir bitki büyüme odasında kuluçkaya yatın (23 °C'de 16 saat ışık/8 saat karanlık, ışık yoğunluğu: 100 μmol·m⁻²·s⁻¹, bağıl nem: %70).
      NOT: Bitkiler çimlenmeden 10 gün sonra kullanıma hazır olacaktır (Şekil 2B).

2. Arabidopsis ve fasulye bitkilerinin aşılanması

NOT: Bu çalışmada P. syringae pv. domates DC3000 ve P. şırınga, pv. phaseolicola 1448A kullanıldı.

1. P. syringae inoculum'u hazırlayın.
   1. İlgilenilen P. syringae suşunu -80 ° C'lik bir gliserol stoğundan, uygun antibiyotiklerle desteklenmiş bir LB plakasına (10 g / L tripton, 5 g / L NaCl, 5 g / L maya ekstresi ve 16 g / L bakteriyolojik agar, Malzeme Tablosuna bakınız) çizin. 40-48 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin.
      NOT: İlgilenilen suş bir plazmid veya genomik direnç geni taşıyorsa antibiyotik kullanımı önerilir. P. syringae için önerilen antibiyotik konsantrasyonları aşağıdaki gibidir: kanamisin (15 μg / mL), gentamisin (10 μg / mL), ampisilin (300 μg / mL) ( bakınız Malzeme Tablosu).
   2. Bakteriyel biyokütleyi kazıyın ve 5 mL'de 10 mM MgCl_2'de yeniden askıya alın. OD_600'ü ölçün ve 10 mM MgCl₂ ekleyerek 0,1'e ayarlayın.
      NOT: Bir P. syringae kültürünün 0,1'lik bir OD 600'ü 5 x₁₀ ⁷ CFU·mL^−1'e karşılık gelir.
   3. 5 x 10^{5 CFU}·mL⁻¹ nihai inokülum konsantrasyonuna ulaşmak için 10 mM MgCl_2'ye seri seyreltmeler gerçekleştirin. Arabidopsis bitkileri için 200 mL ve fasulye bitkileri için 50 mL inokulum hazırlayın.
   4. Aşılamadan hemen önce, yüzey aktif madde Silwett L-77'yi ( bakınız Malzeme Tablosu) fasulye aşılaması için% 0.02 ve Arabidopsis için% 0.01'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Silwett'in Arabidopsis dokusuna biraz zararlı olduğunu unutmayın.
2. Vakum infiltrasyonu gerçekleştirin.
   1. Arabidopsis infiltrasyonu için, tencerenin üzerine bir X oluşturan iki tahta çubuk yerleştirin (Şekil 1E) ve tencereyi 200 mL inokulum içeren 14 cm çapında bir Petri kabının üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirin (Şekil 1F).
   2. Fasulye yapraklarının aşılanması için, yaprağı inokulumu içeren 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne sokun (Şekil 2C).
   3. İnokulum çözeltisine batırılmış bitkileri bir vakum odasına yerleştirin (Şekil 1G ve Şekil 2D) ve yapraklara sızması için 30 s boyunca 500 mbar'lık bir darbe verin. Yaprak tamamen sızana kadar vakum darbesini 2-3 kez tekrarlayın (Şekil 1H ve Şekil 2E).
   4. Fazla inokülum çözeltisini bir parça kağıtla boşaltın ve bitkileri karşılık gelen büyüme odalarına geri getirin.

3. Apoplasttan bakteri ekstraksiyonu

1. Aşılamadan dört gün sonra, Arabidopsis bitkisinin hava kısmını veya fasulye bitkisinden aşılanmış yaprağı kesin ve iğnesiz 20 mL'lik bir şırıngaya yerleştirin (Şekil 2G). Fasulye yaprakları için, yaprağı kendi üzerine yuvarlayın, Şekil 2F'de gösterildiği gibi abaksiyel yüzü dışa doğru bırakın.
2. Dokuyu örtmek için yeterli miktarda damıtılmış su ekleyin (genellikle 10-15 mL).
3. Pistonu yerleştirin ve şırınga, ucu yukarı bakacak şekilde dikey konumdayken, tüm hava ucun yanına yerleştirilene kadar namluya hafifçe dokunarak şırınganın içindeki fazla hava ve hava kabarcıklarını çıkarın. Havayı dışarı çıkarmak için pistonu kaydırın. Şırınganın içinde mümkün olduğunca az hava olduğunda, şırınga namlusunun ucunu parafin filmi ile örtün.
4. Doku koyulaşana kadar pozitif basınç oluşturmak için pistona dikkatlice bastırın (Şekil 1I ve Şekil 2H). Ardından, negatif basınç oluşturmak için pistonu çekin (Şekil 1J ve Şekil 2I). Bu adımı 3-5 kez tekrarlayın.
5. Parafin filmi ve pistonu çıkarın ve Şekil 2J'de olduğu gibi apoplastla ekstrakte edilen bakterileri içeren sıvıyı toplayın.

4. Apoplastla ekstrakte edilen bakterilerin tek hücreli analizi

1. Aşağıdaki adımları izleyerek konfokal mikroskopi ile görselleştirin.
   1. Damıtılmış suda% 1.5'lik bir agaroz çözeltisi hazırlayın. Eritildikten sonra, yan yana yerleştirilmiş iki mikroskopi slaytı arasındaki boşluğu doldurmak için yeterli hacim ekleyin ve üstüne başka bir slayt yerleştirin (Şekil 3). 15 dakika kurumasını bekleyin ve üstüne yerleştirilen slaytı dikkatlice çıkarın. Bir bıçak kullanarak, agaroz pedini kullanımdan hemen önce 5 mm x 5 mm parçalara ayırın.
   2. Buna paralel olarak, apoplastla ekstrakte edilen bakterilerin 1 mL'sini oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüjleyin, bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücreleri konsantre etmek için peleti 20 μL suya yeniden askıya alın. Konsantre hücrelerin 2 μL'lik bir damlasını 0,17 mm'lik bir kapak kayması üzerine yerleştirin ve damlayı, Şekil 3'te gösterildiği gibi, daha önce adım 1'de elde edilen 5 mm x 5 mm'lik agaroz pedi parçası ile örtün.
   3. Bakteriyel preparatı konfokal mikroskop altında görselleştirin (bakınız Malzeme Tablosu). Yeşil floresan bakterileri tanımlamak için, 488 nm'de uyarma lazerini ve 500 nm ila 550 nm arasında değişen bir emisyon filtresi kullanın. Tüm bakterileri tanımlamak için parlak alanı kullanın ve her iki alanı birleştirin.
   4. Fiji'yi kullanarak konfokal görüntüleri işleyin (bkz. Bunu yapmak için, bakteri hücresinin konturunu tanımlamak ve içindeki floresan yoğunluğunu ölçmek için MicrobeJ eklentisini kullanın.
      NOT: Bu analiz için izole edilmiş bakterilerden (kümelenmemiş) görüntü elde edilmesi önerilir.
2. Akış sitometrisi ile analiz yapın.
   1. Akış sitometresini kullanarak analiz etmek için apoplastla ekstrakte edilen bakteri süspansiyonlarının bir alikotunu alın. 100.000 etkinlik alın.
   2. Bakteriler ve bitki kalıntıları arasında ayrım yapmak için, aşılanmamış bir bitkiden ekstrakte edilen apoplastı analiz edin ve ileri saçılma (FSC) hücre boyutunu yan saçılma (SSC) hücre boyutuna karşı gösteren nokta grafiğini apoplastla ekstrakte edilen bakteriyel süspansiyonunkiyle karşılaştırın. Floresan olmayan bakterileri tanımlamak için, floresan olmayan izojenik bakterilerle aşılanmış bitkilerden ekstrakte edilen apoplastları kullanın ve floresan emisyonlarını karşılaştırın.

Sonuçlar

Tip III sekresyon sisteminin ekspresyonu, bitki içindeki bakteri büyümesi için gereklidir. T3SS genlerinin zamanında ekspresyonu, merkezinde T3SS ile ilişkili genlerin ekspresyonunun anahtar aktivatörü olan ekstrasitoplazmik fonksiyon (ECF) sigma faktörü HrpL olan karmaşık düzenleme yoluyla elde edilir¹¹. HRPL ekspresyonunun bir analizi daha önce aşağı akış promotersiz gfp genine kromozom yerleşimli bir transkripsiyonel füzyon kullanılarak ve konfokal mikros...

Tartışmalar

Burada sunulan yöntem, bakterilerin bitki yaprak dokusuna sızmasına izin veren, doku bozulmasını en aza indirirken büyük hacimlerin hızlı bir şekilde aşılanmasına izin veren invaziv olmayan bir prosedürü açıklamaktadır. P. syringae tür kompleksinin özelliklerinden biri, bitki apoplastının içinde ve bitki yüzeyinde epifit¹⁴ olarak hayatta kalma ve çoğalma yeteneğidir. Bu nedenle, mevcut protokol kullanılarak ekstrakte edilen bakterilerin sadece bitki apoplastın...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.17 mm coverslip			No special requirements
1.6 x 1.6 mm metal mesh	Buzifu		Fiberglass screen mesh
10 cm diameter pots			No special requirements
140 mm Petri dishes			No special requirements
20 mL syringe			No special requirements
50 mL conical tubes	Sarstedt
Agarose	Merk
Ampicillin sodium	GoldBio
Bacteriological agar	Roko
Confocal Microscope Stellaris	Leica Microsystems
FACSVerse cell analyzer	BD Biosciences
Fiji software
Gentamycin sulfate	Duchefa	G-0124
Kanamycin monosulfate	Phytotechnology	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging
Plant substrate			No special requirements
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Toothpicks			No special requirements
Tryptone	Merk
Tweezers			No special requirements
Vacuum chamber 25 cm diameter	Kartell	554
Vacuum pump	GAST	DOA-P504-BN
Vermiculite			No special requirements
Yeast Extract	Merk