Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae dentro del tejido vegetal

Resumen

El presente protocolo describe un método que permite el análisis de expresión génica unicelular en poblaciones de Pseudomonas syringae cultivadas dentro del apoplasto vegetal.

Resumen

Una gran cantidad de microorganismos patógenos atacan constantemente a las plantas. El complejo de especies de Pseudomonas syringae engloba bacterias fitopatógenas gramnegativas de especial relevancia para un amplio número de hospedadores. P. syringae entra en la planta desde la superficie de la hoja y se multiplica rápidamente dentro del apoplasto, formando microcolonias que ocupan el espacio intercelular. La expresión constitutiva de proteínas fluorescentes por parte de las bacterias permite la visualización de las microcolonias y el seguimiento del desarrollo de la infección a nivel microscópico. Los avances recientes en el análisis de células individuales han revelado la gran complejidad alcanzada por las poblaciones bacterianas isogénicas clonales. Esta complejidad, conocida como heterogeneidad fenotípica, es la consecuencia de las diferencias de célula a célula en la expresión génica (no vinculadas a diferencias genéticas) entre la comunidad bacteriana. Para analizar la expresión de loci individuales a nivel de una sola célula, se han utilizado ampliamente fusiones transcripcionales a proteínas fluorescentes. Bajo condiciones de estrés, como las que ocurren durante la colonización del apoplasto de la planta, P. syringae se diferencia en distintas subpoblaciones basadas en la expresión heterogénea de genes clave de virulencia (es decir, el sistema de secreción Hrp tipo III). Sin embargo, el análisis unicelular de cualquier población dada de P. syringae recuperada del tejido vegetal es un desafío debido a los desechos celulares liberados durante la interrupción mecánica intrínseca a los procesos de inoculación y extracción bacteriana. En el presente informe se detalla un método elaborado para vigilar la expresión de los genes de P. syringae de interés a nivel unicelular durante la colonización de Arabidopsis y plantas de frijol. Se describe la preparación de las plantas y las suspensiones bacterianas utilizadas para la inoculación mediante una cámara de vacío. La recuperación de bacterias endófitas de hojas infectadas por extracción de fluido apoplástico también se explica aquí. Tanto la inoculación bacteriana como los métodos de extracción bacteriana están optimizados empíricamente para minimizar el daño de las células vegetales y bacterianas, lo que resulta en preparaciones bacterianas óptimas para el análisis de microscopía y citometría de flujo.

Introducción

Las bacterias patógenas muestran diferencias en diversos fenotipos, dando lugar a la formación de subpoblaciones dentro de poblaciones genéticamente idénticas. Este fenómeno se conoce como heterogeneidad fenotípica y ha sido propuesto como una estrategia de adaptación durante las interacciones bacteriano-huésped¹. Los avances recientes en la resolución óptica de microscopios confocales, citometría de flujo y microfluídica, combinados con proteínas fluorescentes, han fomentado el análisis unicelular de poblaciones bacterianas².

La Pseudomonas syringae gramnegativa es una bacteria patógena vegetal arquetípica debido a su importancia académica y económica³. El ciclo de vida de P. syringae está ligado al ciclo del agua⁴. P. syringae entra en los espacios intercelulares entre las células mesófilas, el apoplasto de la hoja de la planta, a través de aberturas naturales como estomas o heridas⁵. Una vez dentro del apoplasto, P. syringae se basa en el sistema de secreción tipo III (T3SS) y los efectores translocados tipo III (T3E) para suprimir la inmunidad de la planta y manipular las funciones celulares de la planta en beneficio del patógeno⁶. La expresión de T3SS y T3E depende del regulador maestro HrpL, un factor sigma alternativo que se une a los motivos hrp-box en la región promotora de los genes diana⁷.

Al generar fusiones transcripcionales localizadas en cromosomas a genes de proteínas fluorescentes aguas abajo del gen de interés, se puede monitorear la expresión génica en función de los niveles de fluorescencia emitidos a nivel de una sola célula⁸. Utilizando este método, se ha establecido que la expresión de hrpL es heterogénea tanto dentro de cultivos bacterianos cultivados en el laboratorio como dentro de poblaciones bacterianas recuperadas de la planta apoplast ^8,9. Aunque el análisis de la expresión génica a nivel unicelular se realiza típicamente en cultivos bacterianos cultivados en medios de laboratorio, tales análisis también pueden llevarse a cabo en poblaciones bacterianas que crecen dentro de la planta, proporcionando así información valiosa sobre la formación de subpoblaciones en el contexto natural. Una limitación potencial para el análisis de poblaciones bacterianas extraídas de la planta es que los métodos clásicos de inoculación por infiltración de presión de jeringa en el apoplasto, seguidos de extracción bacteriana por maceración del tejido foliar, típicamente generan una gran cantidad de restos celulares de plantas que interfieren con el análisis aguas abajo¹⁰. La mayoría de los desechos celulares consisten en fragmentos autofluorescentes de cloroplastos que se superponen con la fluorescencia GFP, lo que resulta en resultados engañosos.

El presente protocolo describe el proceso de análisis de la heterogeneidad de la expresión génica unicelular en dos patosistemas modelo: el formado por P. syringae pv. cepa de tomate DC3000 y Arabidopsis thaliana (Col-0), y la otra por la P. syringae pv. phaseolicola cepa 1448A y plantas de frijol (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). Se propone un método de inoculación basado en la infiltración al vacío utilizando una cámara de vacío y una bomba, lo que resulta en un método rápido y sin daños para infiltrar hojas enteras. Además, como mejora de los protocolos convencionales, se utiliza un método más suave para extraer la población bacteriana del apoplast que reduce significativamente la alteración tisular, basado en la extracción de líquido apoplástico mediante la aplicación de ciclos de presión positiva y negativa utilizando una pequeña cantidad de volumen dentro de una jeringa.

Protocolo

1. Preparación de la planta

1. Prepare las plantas de Arabidopsis Col-0 siguiendo los pasos a continuación.
   1. Llene una maceta de 10 cm de diámetro con una mezcla de sustrato de planta de vermiculita 1:3 (consulte la Tabla de materiales), previamente regada, y cubra la maceta con una malla metálica de 15 cm x 15 cm con agujeros de 1,6 mm x 1,6 mm. Ajuste la malla metálica al suelo húmedo con una banda elástica (Figura 1A).
   2. Con un palillo de dientes húmedo, siembre semillas de Arabidopsis en los agujeros de la malla metálica. Coloque de tres a cuatro semillas en posiciones distantes dentro de la maceta (Figura 1B, C).
   3. Cubra las macetas con una cúpula de plástico para mantener una humedad relativa alta e incube durante 72 h a 4 °C para su estratificación.
      NOTA: La estratificación (incubación a alta humedad y baja temperatura, como se describe) mejora la tasa de germinación y la sincronía de las semillas.
   4. Transfiera las macetas a una cámara de crecimiento vegetal en condiciones de días cortos (8 h de luz/16 h de oscuridad a 21 °C, intensidad de luz: 100 μmol·m−²·^s−1, humedad relativa: 70%).
   5. Después de la germinación de la semilla (8-10 días), use las pinzas para eliminar la mayoría de las plántulas, manteniendo una plántula en cada una de las posiciones de la maceta (seis plántulas/maceta) (Figura 1D). Retire la cúpula de plástico para destapar las macetas.
      NOTA: Las plantas estarán listas para usar 4-5 semanas después de la germinación.
2. Prepare plantas de frijol Phaseolus vulgaris (cultivar Canadian Wonder).
   1. Cubra el fondo de una placa de Petri con un pedazo de papel de toalla húmedo y coloque las semillas de frijol encima. Sellar la placa de Petri con cinta quirúrgica e incubar a 28 °C durante 3-4 días (Figura 2A).
   2. Transfiera las semillas germinadas a una maceta de 10 cm de diámetro llena de una mezcla húmeda de sustrato de planta de vermiculita 1: 3.
   3. Incubar en una cámara de crecimiento vegetal en condiciones de día largo (16 h de luz/8 h de oscuridad a 23 °C, intensidad de luz: 100 μmol·m−²·s⁻¹, humedad relativa: 70%).
      NOTA: Las plantas estarán listas para usar 10 días después de la germinación (Figura 2B).

2. Inoculación de Arabidopsis y plantas de frijol

NOTA: En este estudio, las cepas P. syringae pv. tomate DC3000 y P. syringae pv. se utilizó phaseolicola 1448A.

1. Preparar el inóculo de P. syringae.
   1. Rayar la cepa de P. syringae de interés de una cepa de glicerol de -80 °C en una placa LB (10 g/L triptona, 5 g/L de NaCl, 5 g/L de extracto de levadura y 16 g/L de agar bacteriológico, ver Tabla de materiales) suplementada con los antibióticos apropiados. Incubar a 28 °C durante 40-48 h.
      NOTA: Se recomienda el uso de antibióticos si la cepa de interés porta un plásmido o un gen de resistencia genómica. Las concentraciones recomendadas de antibióticos para P. syringae son las siguientes: kanamicina (15 μg/ml), gentamicina (10 μg/ml), ampicilina (300 μg/ml) (ver tabla de materiales).
   2. Raspar la biomasa bacteriana y resuspender en 5 mL de 10 mM MgCl₂. Mida el OD₆₀₀ y ajuste a 0.1 agregando 10 mM MgCl₂.
      NOTA: Un OD₆₀₀ de 0,1 de un cultivo de P. syringae corresponde a 5 x 10⁷ UFC·mL⁻¹.
   3. Realizar diluciones seriadas en 10 mM de MgCl₂ para alcanzar una concentración final de inóculo de 5 x 10⁵ UFC·mL⁻¹. Preparar 200 mL de inóculo para las plantas de Arabidopsis y 50 mL para las plantas de frijol.
   4. Inmediatamente antes de la inoculación, agregue el surfactante Silwett L-77 (ver Tabla de materiales) a una concentración final de 0.02% para la inoculación de frijol y 0.01% para Arabidopsis. Tenga en cuenta que Silwett es algo perjudicial para el tejido de Arabidopsis.
2. Realizar infiltración de vacío.
   1. Para la infiltración de Arabidopsis, coloque dos palos de madera formando una X sobre la olla (Figura 1E) y coloque la olla boca abajo sobre una placa de Petri de 14 cm de diámetro que contenga el inóculo de 200 ml (Figura 1F).
   2. Para la inoculación de hojas de frijol, introducir la hoja en un tubo de centrífuga cónica de 50 ml que contenga el inóculo (Figura 2C).
   3. Introducir las plantas sumergidas en la solución de inóculo en una cámara de vacío (Figura 1G y Figura 2D) y dar un pulso de 500 mbar durante 30 s para infiltrarse en las hojas. Repita el pulso de vacío 2-3 veces hasta que la hoja esté completamente infiltrada (Figura 1H y Figura 2E).
   4. Escurrir el exceso de solución de inóculo con un trozo de papel y devolver las plantas a su cámara de crecimiento correspondiente.

3. Extracción de bacterias del apoplast

1. Cuatro días después de la inoculación, cortar la parte aérea de la planta Arabidopsis o la hoja inoculada de la planta de frijol y colocarla en una jeringa de 20 ml sin aguja (Figura 2G). Para las hojas de frijol, enrolle la hoja sobre sí misma, dejando la cara abaxial hacia afuera, como se muestra en la Figura 2F.
2. Agregue suficiente volumen de agua destilada para cubrir el tejido (generalmente 10-15 ml).
3. Inserte el émbolo y, con la jeringa en posición vertical con la punta apuntando hacia arriba, retire el exceso de aire y las burbujas de aire dentro de la jeringa golpeando suavemente el barril hasta que todo el aire se encuentre cerca de la punta. Deslice entonces el émbolo para sacar el aire. Una vez que haya la menor cantidad de aire posible dentro de la jeringa, cubra la punta del cilindro de la jeringa con una película de parafina.
4. Presione con cuidado el émbolo para generar presión positiva hasta que el tejido se oscurezca (Figura 1I y Figura 2H). Luego, tire del émbolo para generar presión negativa (Figura 1J y Figura 2I). Repita este paso 3-5 veces.
5. Retire la película de parafina y el émbolo y recoja el líquido que contiene las bacterias extraídas con apoplastos, como se muestra en la Figura 2J.

4. Análisis unicelular de las bacterias extraídas con apoplastos

1. Visualice por microscopía confocal siguiendo los pasos a continuación.
   1. Prepare una solución de agarosa al 1,5% en agua destilada. Una vez fundido, agregue suficiente volumen para llenar el espacio entre dos portaobjetos de microscopía colocados uno al lado del otro y coloque otro portaobjetos encima sobre él (Figura 3). Déjelos secar durante 15 minutos y retire con cuidado el tobogán colocado en la parte superior. Con una cuchilla, corte la almohadilla de agarosa en trozos de 5 mm x 5 mm justo antes de usarla.
   2. Paralelamente, centrifugar 1 ml de las bacterias extraídas con apoplasto a 12.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente, retirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y resuspender el pellet en 20 μL de agua para concentrar las células. Coloque una gota de 2 μL de las células concentradas en un cubreobjetos de 0,17 mm y cubra la gota con una pieza de 5 mm x 5 mm de la almohadilla de agarosa obtenida previamente en el paso 1, como se representa en la Figura 3.
   3. Visualice la preparación bacteriana bajo el microscopio confocal (consulte la Tabla de materiales). Para identificar bacterias verdes-fluorescentes, use el láser de excitación a 488 nm y un filtro de emisión que oscile entre 500 nm y 550 nm. Para identificar todas las bacterias, use el campo brillante y combine ambos campos.
   4. Procese las imágenes confocales utilizando Fiji (consulte la Tabla de materiales). Para hacer esto, use el complemento MicrobeJ para identificar el contorno de la célula bacteriana y medir la intensidad de fluorescencia en su interior.
      NOTA: Se recomienda la adquisición de imágenes de bacterias aisladas (no agrupadas) para este análisis.
2. Realizar análisis por citometría de flujo.
   1. Tome una alícuota de las suspensiones de bacterias extraídas con apoplastos para analizar utilizando el citómetro de flujo. Adquiere 100.000 eventos.
   2. Para discriminar entre bacterias y restos vegetales, analice el apoplast extraído de una planta no inoculada y compare el diagrama de puntos que muestra su tamaño de célula de dispersión directa (FSC) frente al tamaño de célula de dispersión lateral (SSC) con el de la suspensión bacteriana extraída de apoplastos. Para identificar bacterias no fluorescentes, utilice los apoplastos extraídos de las plantas inoculadas con bacterias isogénicas no fluorescentes y compare sus emisiones fluorescentes.

Resultados

La expresión del sistema de secreción tipo III es esencial para el crecimiento bacteriano dentro de la planta. La expresión oportuna de los genes T3SS se logra a través de una regulación intrincada, en cuyo centro se encuentra el factor sigma HrpL de función extracitoplasmática (ECF), el activador clave de la expresión de genes relacionados con T3SS¹¹. Previamente se realizó un análisis de la expresión de hrpL utilizando una fusión transcripcional localizada en cromosomas a un...

Discusión

El método presentado aquí describe un procedimiento no invasivo que permite la infiltración de bacterias en el tejido foliar de la planta, lo que permite la inoculación rápida de grandes volúmenes y minimiza la interrupción del tejido. Una de las características del complejo de especies de P. syringae es la capacidad de sobrevivir y proliferar dentro del apoplasto de la planta y en la superficie de la planta como epífita¹⁴. Por lo tanto, no se puede descartar la posibilidad de qu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.17 mm coverslip			No special requirements
1.6 x 1.6 mm metal mesh	Buzifu		Fiberglass screen mesh
10 cm diameter pots			No special requirements
140 mm Petri dishes			No special requirements
20 mL syringe			No special requirements
50 mL conical tubes	Sarstedt
Agarose	Merk
Ampicillin sodium	GoldBio
Bacteriological agar	Roko
Confocal Microscope Stellaris	Leica Microsystems
FACSVerse cell analyzer	BD Biosciences
Fiji software
Gentamycin sulfate	Duchefa	G-0124
Kanamycin monosulfate	Phytotechnology	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging
Plant substrate			No special requirements
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Toothpicks			No special requirements
Tryptone	Merk
Tweezers			No special requirements
Vacuum chamber 25 cm diameter	Kartell	554
Vacuum pump	GAST	DOA-P504-BN
Vermiculite			No special requirements
Yeast Extract	Merk