Одноклеточный анализ экспрессии генов Pseudomonas syringae в растительной ткани

Резюме

В настоящем протоколе описывается способ, который позволяет проводить анализ экспрессии одноклеточных генов в популяциях Pseudomonas syringae , выращенных в апопласте растения.

Аннотация

Множество патогенных микроорганизмов постоянно атакуют растения. Видовой комплекс Pseudomonas syringae включает грамотрицательные растительно-патогенные бактерии, имеющие особое значение для широкого круга хозяев. P. syringae проникает в растение с поверхности листа и быстро размножается внутри апопласта, образуя микроколонии, занимающие межклеточное пространство. Конститутивная экспрессия флуоресцентных белков бактериями позволяет визуализировать микроколонии и отслеживать развитие инфекции на микроскопическом уровне. Последние достижения в области анализа отдельных клеток выявили большую сложность, достигаемую клональными изогенными бактериальными популяциями. Эта сложность, называемая фенотипической гетерогенностью, является следствием межклеточных различий в экспрессии генов (не связанных с генетическими различиями) среди бактериального сообщества. Для анализа экспрессии отдельных локусов на одноклеточном уровне широко использовались транскрипционные слияния с флуоресцентными белками. В стрессовых условиях, таких как те, которые возникают во время колонизации растительного апопласта, P. syringae дифференцируется в отдельные субпопуляции, основанные на гетерогенной экспрессии ключевых генов вирулентности (т.е. системы секреции Hrp типа III). Тем не менее, одноклеточный анализ любой данной популяции P. syringae , извлеченной из растительной ткани, затруднен из-за клеточного мусора, высвобождаемого во время механического разрушения, присущего процессам инокуляции и бактериальной экстракции. В настоящем докладе подробно описывается метод, разработанный для мониторинга экспрессии генов P. syringae , представляющих интерес, на одноклеточном уровне во время колонизации арабидопсиса и бобовых растений. Описана подготовка растений и бактериальных суспензий, используемых для инокуляции с помощью вакуумной камеры. Здесь также объясняется восстановление эндофитных бактерий из зараженных листьев путем экстракции апопластической жидкости. Методы бактериальной инокуляции и бактериальной экстракции эмпирически оптимизированы для минимизации повреждения растений и бактериальных клеток, в результате чего получаются бактериальные препараты, оптимальные для микроскопии и анализа проточной цитометрии.

Введение

Патогенные бактерии проявляют различия в различных фенотипах, что приводит к образованию субпопуляций в генетически идентичных популяциях. Это явление известно как фенотипическая гетерогенность и было предложено в качестве стратегии адаптации во время взаимодействия бактерий с хозяином¹. Последние достижения в области оптического разрешения конфокальных микроскопов, проточной цитометрии и микрофлюидики в сочетании с флуоресцентными белками способствовали одноклеточному анализу бактериальных популяций².

Грамотрицательная синегнойная палочка Pseudomonas syringae является архетипической ....

протокол

1. Подготовка растений

1. Подготовьте растения Arabidopsis Col-0, выполнив следующие действия.
   1. Заполните горшок диаметром 10 см предварительно политой смесью субстрата из вермикулита и растений (см. Таблицу материалов) и накройте горшок металлической сеткой размером 15 см х 15 см с отверстиями 1,6 мм х 1,6 мм. Приспособьте металлическую сетку к влажной почве с помощью резинки (рис. 1А).
   2. Влажной зубочисткой посейте семена арабидопсиса в отверстия металлической сетки. Поместите три-четыре семени в отдаленные места в горшке (рис. 1B, C).....

Результаты

Экспрессия системы секреции III типа имеет важное значение для роста бактерий в растении. Своевременная экспрессия генов T3SS достигается за счет сложной регуляции, в центре которой находится экстрацитоплазматический функционал (ECF) сигма-фактор HrpL, ключевой активатор экспрессии генов, с.......

Обсуждение

Представленный здесь способ описывает неинвазивную процедуру, которая позволяет инфильтрации бактерий в ткани листвы растений, что позволяет быстро инокуляцию больших объемов, сводя к минимуму разрушение тканей. Одной из характеристик видового комплекса P. syringae является способн.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.17 mm coverslip			No special requirements
1.6 x 1.6 mm metal mesh	Buzifu		Fiberglass screen mesh
10 cm diameter pots			No special requirements
140 mm Petri dishes			No special requirements
20 mL syringe			No special requirements
50 mL conical tubes	Sarstedt
Agarose	Merk
Ampicillin sodium	GoldBio
Bacteriological agar	Roko
Confocal Microscope Stellaris	Leica Microsystems
FACSVerse cell analyzer	BD Biosciences
Fiji software
Gentamycin sulfate	Duchefa	G-0124
Kanamycin monosulfate	Phytotechnology	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging
Plant substrate			No special requirements
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Toothpicks			No special requirements
Tryptone	Merk
Tweezers			No special requirements
Vacuum chamber 25 cm diameter	Kartell	554
Vacuum pump	GAST	DOA-P504-BN
Vermiculite			No special requirements
Yeast Extract	Merk