Одноклеточный анализ экспрессии генов Pseudomonas syringae в растительной ткани

Резюме

В настоящем протоколе описывается способ, который позволяет проводить анализ экспрессии одноклеточных генов в популяциях Pseudomonas syringae , выращенных в апопласте растения.

Аннотация

Множество патогенных микроорганизмов постоянно атакуют растения. Видовой комплекс Pseudomonas syringae включает грамотрицательные растительно-патогенные бактерии, имеющие особое значение для широкого круга хозяев. P. syringae проникает в растение с поверхности листа и быстро размножается внутри апопласта, образуя микроколонии, занимающие межклеточное пространство. Конститутивная экспрессия флуоресцентных белков бактериями позволяет визуализировать микроколонии и отслеживать развитие инфекции на микроскопическом уровне. Последние достижения в области анализа отдельных клеток выявили большую сложность, достигаемую клональными изогенными бактериальными популяциями. Эта сложность, называемая фенотипической гетерогенностью, является следствием межклеточных различий в экспрессии генов (не связанных с генетическими различиями) среди бактериального сообщества. Для анализа экспрессии отдельных локусов на одноклеточном уровне широко использовались транскрипционные слияния с флуоресцентными белками. В стрессовых условиях, таких как те, которые возникают во время колонизации растительного апопласта, P. syringae дифференцируется в отдельные субпопуляции, основанные на гетерогенной экспрессии ключевых генов вирулентности (т.е. системы секреции Hrp типа III). Тем не менее, одноклеточный анализ любой данной популяции P. syringae , извлеченной из растительной ткани, затруднен из-за клеточного мусора, высвобождаемого во время механического разрушения, присущего процессам инокуляции и бактериальной экстракции. В настоящем докладе подробно описывается метод, разработанный для мониторинга экспрессии генов P. syringae , представляющих интерес, на одноклеточном уровне во время колонизации арабидопсиса и бобовых растений. Описана подготовка растений и бактериальных суспензий, используемых для инокуляции с помощью вакуумной камеры. Здесь также объясняется восстановление эндофитных бактерий из зараженных листьев путем экстракции апопластической жидкости. Методы бактериальной инокуляции и бактериальной экстракции эмпирически оптимизированы для минимизации повреждения растений и бактериальных клеток, в результате чего получаются бактериальные препараты, оптимальные для микроскопии и анализа проточной цитометрии.

Введение

Патогенные бактерии проявляют различия в различных фенотипах, что приводит к образованию субпопуляций в генетически идентичных популяциях. Это явление известно как фенотипическая гетерогенность и было предложено в качестве стратегии адаптации во время взаимодействия бактерий с хозяином¹. Последние достижения в области оптического разрешения конфокальных микроскопов, проточной цитометрии и микрофлюидики в сочетании с флуоресцентными белками способствовали одноклеточному анализу бактериальных популяций².

Грамотрицательная синегнойная палочка Pseudomonas syringae является архетипической патогенной бактерией растений из-за ее академического и экономического значения³. Жизненный цикл P. syringae связан с водным циклом⁴. P. syringae проникает в межклеточные промежутки между клетками мезофилла, апопластом листа растения, через естественные отверстия, такие как устьица или раны⁵. Попав в апопласт, P. syringae полагается на систему секреции III типа (T3SS) и транслоцированные эффекторы III типа (T3E) для подавления иммунитета растений и манипулирования клеточными функциями растений в интересах патогена⁶. Экспрессия T3SS и T3E зависит от главного регулятора HrpL, альтернативного сигма-фактора, который связывается с мотивами hrp-бокса в промоторной области генов-мишеней⁷.

Генерируя расположенные в хромосомах слияния транскрипции с генами флуоресцентных белков ниже по течению от интересующего гена, можно контролировать экспрессию генов на основе уровней флуоресценции, испускаемых на уровне⁸ отдельных клеток. С помощью этого метода установлено, что экспрессия hrpL неоднородна как в бактериальных культурах, выращенных в лаборатории, так и в бактериальных популяциях, извлеченных из растительного апопласта ^8,9. Хотя анализ экспрессии генов на уровне отдельных клеток обычно проводится в бактериальных культурах, выращенных в лабораторных средах, такие анализы также могут проводиться на бактериальных популяциях, растущих внутри растения, что дает ценную информацию о формировании субпопуляций в естественном контексте. Потенциальным ограничением для анализа бактериальных популяций, извлеченных из растения, является то, что классические методы инокуляции путем инфильтрации под давлением шприца в апопласт с последующей бактериальной экстракцией путем мацерации ткани листа обычно генерируют большое количество клеточных растительных остатков, которые мешают последующему анализу¹⁰. Большая часть клеточного мусора состоит из автофлуоресцентных фрагментов хлоропластов, которые перекрываются флуоресценцией GFP, что приводит к вводящим в заблуждение результатам.

Настоящий протокол описывает процесс анализа гетерогенности экспрессии одноклеточных генов в двух модельных патосистемах: той, которая сформирована P. syringae pv. штамм томатов DC3000 и Arabidopsis thaliana (Col-0), а другой - P. syringae pv. фазоликола штамма 1448А и бобовые растения (сорт Phaseolus vulgaris Canadian Wonder). Предложен метод инокуляции, основанный на вакуумной инфильтрации с использованием вакуумной камеры и насоса, что позволяет быстро и без повреждений проникать в целые листья. Кроме того, в качестве улучшения по сравнению с традиционными протоколами используется более щадящий метод извлечения бактериальной популяции из апопласта, который значительно уменьшает разрушение тканей, основанный на извлечении апопластической жидкости путем применения циклов положительного и отрицательного давления с использованием небольшого объема в шприце.

протокол

1. Подготовка растений

1. Подготовьте растения Arabidopsis Col-0, выполнив следующие действия.
   1. Заполните горшок диаметром 10 см предварительно политой смесью субстрата из вермикулита и растений (см. Таблицу материалов) и накройте горшок металлической сеткой размером 15 см х 15 см с отверстиями 1,6 мм х 1,6 мм. Приспособьте металлическую сетку к влажной почве с помощью резинки (рис. 1А).
   2. Влажной зубочисткой посейте семена арабидопсиса в отверстия металлической сетки. Поместите три-четыре семени в отдаленные места в горшке (рис. 1B, C).
   3. Накройте горшки пластиковым куполом для поддержания высокой относительной влажности и инкубируйте их в течение 72 ч при температуре 4 °C для стратификации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стратификация (инкубация при высокой влажности и низкой температуре, как описано) улучшает всхожесть и синхронность семян.
   4. Перенесите горшки в камеру для выращивания растений в условиях короткого дня (8 ч света / 16 ч темноты при 21 ° C, интенсивность света: 100 мкмоль · ^{м − 2} · с ^{− 1}, относительная влажность воздуха: 70 %).
   5. После прорастания семян (через 8-10 дней) пинцетом удалите большую часть рассады, держа по одному саженцу в каждом из положений горшка (шесть сеянцев/горшок) (рисунок 1D). Снимите пластиковый купол, чтобы открыть горшки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растения будут готовы к употреблению через 4-5 недель после появления всходов.
2. Подготовьте растения фасоли Phaseolus vulgaris (сорт канадского чуда).
   1. Накройте дно чашки Петри влажным куском бумаги для полотенец и положите на него семена фасоли. Запечатайте чашку Петри хирургической лентой и инкубируйте при 28 °C в течение 3-4 дней (рис. 2A).
   2. Переложите пророщенные семена в горшок диаметром 10 см, заполненный влажной смесью субстрата из вермикулита и растений в соотношении 1:3.
   3. Инкубация в камере для выращивания растений в условиях длительного дня (16 ч света / 8 ч темноты при 23 ° C, интенсивность света: 100 мкмоль · м ^{− 2} · с ^{− 1}, относительная влажность: 70 %).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растения будут готовы к использованию через 10 дней после появления всходов (рис. 2B).

2. Инокуляция арабидопсиса и бобовых растений

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании штаммы P. syringae pv. томат DC3000 и P. syringae pv. Использовались фазоликолы 1448А.

1. Подготовьте посевной материал P. syringae.
   1. Выведите интересующий штамм P. syringae из запаса глицерина при температуре -80 °C на планшет LB (10 г/л триптона, 5 г/л NaCl, 5 г/л дрожжевого экстракта и 16 г/л бактериологического агара, см. Таблицу материалов) с добавлением соответствующих антибиотиков. Инкубировать при 28 °C в течение 40-48 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование антибиотиков рекомендуется, если интересующий штамм несет ген плазмиды или геномной резистентности. Рекомендуемые концентрации антибиотиков для P. syringae следующие: канамицин (15 мкг/мл), гентамицин (10 мкг/мл), ампициллин (300 мкг/мл) (см. Таблицу материалов).
   2. Соскребите бактериальную биомассу и ресуспендируют в 5 мл 10 мМ MgCl₂. Измерьте OD₆₀₀ и отрегулируйте до 0,1, добавив 10 мМ MgCl₂.
      ПРИМЕЧАНИЕ: OD₆₀₀ 0,1 культуры P. syringae соответствует 5 x 10⁷ КОЕ^·мл-1.
   3. Проводят серийные разведения в 10 мМ MgCl₂ для достижения конечной концентрации инокулята 5 x 10⁵ КОЕ^·мл-1. Приготовьте 200 мл инокулята для растений арабидопсиса и 50 мл для бобовых.
   4. Непосредственно перед инокуляцией добавьте поверхностно-активное вещество Silwett L-77 (см. Таблицу материалов) до конечной концентрации 0,02% для инокуляции фасоли и 0,01% для арабидопсиса. Обратите внимание, что Silwett несколько вреден для тканей Arabidopsis.
2. Выполните вакуумную инфильтрацию.
   1. Для инфильтрации арабидопсиса поместите две деревянные палочки, образующие X, над горшком (рис. 1E) и поместите горшок лицевой стороной вниз на чашку Петри диаметром 14 см, содержащую инокулят объемом 200 мл (рис. 1F).
   2. Для инокуляции листьев фасоли вводите лист в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую инокулят (рис. 2C).
   3. Вставьте растения, погруженные в раствор инокулята, в вакуумную камеру (рис. 1G и рис . 2D) и дайте импульс 500 мбар в течение 30 с, чтобы проникнуть в листья. Повторите вакуумный импульс 2-3 раза до полного проникновения листа (рис. 1H и рис. 2E).
   4. Слейте излишки инокуляционного раствора с помощью листа бумаги и верните растения в соответствующую камеру роста.

3. Извлечение бактерий из апопласта

1. Через четыре дня после инокуляции срежьте надземную часть растения Arabidopsis или привитый лист с растения фасоли и поместите его в шприц объемом 20 мл без иглы (рис. 2G). Для листьев фасоли сверните лист на себя, оставляя абаксиальную поверхность наружу, как показано на рисунке 2F.
2. Добавьте достаточный объем дистиллированной воды, чтобы покрыть ткань (обычно 10-15 мл).
3. Вставьте поршень и, установив шприц в вертикальном положении наконечником вверх, удалите лишний воздух и пузырьки воздуха внутри шприца, осторожно постукивая по стволу, пока весь воздух не окажется рядом с наконечником. Затем сдвиньте поршень, чтобы выпустить воздух. Как только внутри шприца останется как можно меньше воздуха, накройте наконечник цилиндра шприца парафиновой пленкой.
4. Осторожно нажимайте на поршень, чтобы создать положительное давление, пока ткань не потемнеет (рис. 1I и рис. 2H). Затем потяните за поршень, чтобы создать отрицательное давление (рис. 1J и рис. 2I). Повторите этот шаг 3-5 раз.
5. Удалите парафиновую пленку и поршень и соберите жидкость, содержащую бактерии, экстрагированные апопластом, как показано на рисунке 2J.

4. Одноклеточный анализ бактерий, экстрагированных апопластом

1. Визуализируйте с помощью конфокальной микроскопии, выполнив следующие действия.
   1. Приготовьте 1,5%-ный раствор агарозы в дистиллированной воде. После плавления добавьте достаточно объема, чтобы заполнить пространство между двумя предметными стеклами микроскопии, установленными рядом, и поместите на него еще одно предметное стекло (рис. 3). Дайте им высохнуть в течение 15 минут и осторожно снимите горку, установленную сверху. С помощью лезвия разрежьте агарозную подушечку на кусочки размером 5 мм х 5 мм непосредственно перед использованием.
   2. Параллельно центрифугируют 1 мл экстрагированных апопластом бактерий в дозе 12 000 x g в течение 1 мин при комнатной температуре, осторожно удаляют надосадочную жидкость с помощью пипетки и ресуспендируют гранулу в 20 мкл воды для концентрации клеток. Поместите каплю концентрированных клеток объемом 2 мкл на покровное стекло толщиной 0,17 мм и накройте каплю кусочком агарозной прокладки размером 5 мм x 5 мм, ранее полученной на шаге 1, как показано на рисунке 3.
   3. Визуализируйте бактериальный препарат под конфокальным микроскопом (см. Таблицу материалов). Для идентификации зелено-флуоресцентных бактерий используют возбуждающий лазер на длине волны 488 нм и эмиссионный фильтр в диапазоне от 500 до 550 нм. Чтобы идентифицировать все бактерии, используйте светлое поле и объедините оба поля.
   4. Обработайте конфокальные изображения с помощью Фиджи (см. Таблицу материалов). Для этого используйте плагин MicrobeJ для определения контура бактериальной клетки и измерения интенсивности флуоресценции внутри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого анализа рекомендуется получение изображений от изолированных бактерий (не кластеризованных).
2. Проведите анализ методом проточной цитометрии.
   1. Возьмите аликвоту суспензий бактерий, экстрагированных апопластом, для анализа с помощью проточного цитометра. Приобретите 100 000 событий.
   2. Чтобы различать бактерии и растительные остатки, проанализируйте апопласт, извлеченный из неинокулированного растения, и сравните точечную диаграмму, показывающую размер клеток прямого рассеяния (FSC) по сравнению с размером клеток бокового рассеяния (SSC) с размером бактериальной суспензии, экстрагированной апопластом. Для идентификации нефлуоресцентных бактерий используют апопласты, извлеченные из растений, инокулированных нефлуоресцентными изогенными бактериями, и сравнивают их флуоресцентные излучения.

Результаты

Экспрессия системы секреции III типа имеет важное значение для роста бактерий в растении. Своевременная экспрессия генов T3SS достигается за счет сложной регуляции, в центре которой находится экстрацитоплазматический функционал (ECF) сигма-фактор HrpL, ключевой активатор экспрессии генов, с...

Обсуждение

Представленный здесь способ описывает неинвазивную процедуру, которая позволяет инфильтрации бактерий в ткани листвы растений, что позволяет быстро инокуляцию больших объемов, сводя к минимуму разрушение тканей. Одной из характеристик видового комплекса P. syringae является способн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.17 mm coverslip			No special requirements
1.6 x 1.6 mm metal mesh	Buzifu		Fiberglass screen mesh
10 cm diameter pots			No special requirements
140 mm Petri dishes			No special requirements
20 mL syringe			No special requirements
50 mL conical tubes	Sarstedt
Agarose	Merk
Ampicillin sodium	GoldBio
Bacteriological agar	Roko
Confocal Microscope Stellaris	Leica Microsystems
FACSVerse cell analyzer	BD Biosciences
Fiji software
Gentamycin sulfate	Duchefa	G-0124
Kanamycin monosulfate	Phytotechnology	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging
Plant substrate			No special requirements
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Toothpicks			No special requirements
Tryptone	Merk
Tweezers			No special requirements
Vacuum chamber 25 cm diameter	Kartell	554
Vacuum pump	GAST	DOA-P504-BN
Vermiculite			No special requirements
Yeast Extract	Merk