식물 조직 내 Pseudomonas syringae 유전자 발현의 단일 세포 분석

요약

본 프로토콜은 식물 아포플라스트 내에서 성장한 슈도모나스 시린지와 집단에 대한 단일 세포 유전자 발현 분석을 허용하는 방법을 설명합니다.

초록

과다한 병원성 미생물이 지속적으로 식물을 공격합니다. 슈도모나스 주사기 종 복합체는 다양한 숙주와 특별한 관련이 있는 그람 음성 식물 병원성 박테리아를 포함합니다. P. syringae 는 잎 표면에서 식물로 들어가 아포플라스트 내에서 빠르게 증식하여 세포간 공간을 차지하는 미세 콜로니를 형성합니다. 박테리아에 의한 형광 단백질의 구성적 발현은 미세 콜로니의 시각화와 현미경 수준에서 감염의 발달을 모니터링할 수 있게 합니다. 단일 세포 분석의 최근 발전은 클론 동종 박테리아 집단이 도달하는 큰 복잡성을 밝혀냈습니다. 표현형 이질성(phenotypic heterogeneity)이라고 하는 이러한 복잡성은 박테리아 군집 간의 유전자 발현(유전적 차이와 관련이 없음)의 세포 간 차이의 결과입니다. 단일 세포 수준에서 개별 유전자좌의 발현을 분석하기 위해 형광 단백질에 대한 전사 융합이 널리 사용되었습니다. 식물 아포플라스트의 집락화 동안 발생하는 것과 같은 스트레스 조건에서 P. syringae 는 주요 독성 유전자(즉, Hrp 유형 III 분비 시스템)의 이질적인 발현을 기반으로 별개의 하위 집단으로 분화됩니다. 그러나 식물 조직에서 회수된 P. syringae 개체군의 단일 세포 분석은 접종 및 박테리아 추출 공정에 내재된 기계적 파괴 중에 방출되는 세포 파편으로 인해 어렵습니다. 본 보고서는 애기장대와 콩 식물의 집락화 동안 단일 세포 수준에서 관심 있는 P. syringae 유전자의 발현을 모니터링하기 위해 개발된 방법을 자세히 설명합니다. 식물의 제조 및 진공 챔버를 이용한 접종에 사용되는 박테리아 현탁액이 설명된다. 아포소성 유체 추출에 의한 감염된 잎에서 내생 박테리아의 회수도 여기에 설명되어 있습니다. 박테리아 접종 및 박테리아 추출 방법 모두 식물 및 박테리아 세포 손상을 최소화하도록 경험적으로 최적화되어 현미경 및 유세포 분석 분석에 최적의 박테리아 제제를 제공합니다.

서문

병원성 박테리아는 다양한 표현형의 차이를 나타내어 유전적으로 동일한 집단 내에서 하위 집단을 형성합니다. 이 현상은 표현형 이질성(phenotypic heterogeneity)으로 알려져 있으며, 박테리아-숙주 상호작용 중 적응 전략으로 제안되었다¹. 형광 단백질과 결합된 컨포칼 현미경, 유세포 분석 및 미세 유체의 광학 해상도의 최근 발전은 박테리아 개체군에 대한 단일 세포 분석을 촉진했습니다².

그람 음성균(Gram-negative Pseudomonas syringae)은 학문적, 경제적 중요성 때문에 전형적인 식물 병원성 박테리아이다³. P. syringae의 수명주기는 물 순환⁴과 관련이 있습니다. P. syringae는 기공이나 상처와 같은 자연적인 구멍을 통해 식물의 잎 아포플라스트인 중엽세포(mesophyll cell) 사이의 세포간 공간으로 들어간다⁵. 일단 아포플라스트에 들어가면, P. syringae는 III형 분비계(T3SS)와 III형-전위 이펙터(T3E)에 의존하여 식물 면역을 억제하고 병원체의 이익을 위해 식물 세포 기능을 조작한다⁶. T3SS 및 T3E의 발현은 표적 유전자⁷의 프로모터 영역에서 hrp-box 모티프에 결합하는 대체 시그마 인자인 마스터 조절인자 HrpL에 의존한다.

관심 유전자의 하류에 있는 형광 단백질 유전자에 염색체 위치 전사 융합체를 생성함으로써, 단일 세포 수준⁸에서 방출되는 형광 수준을 기반으로 유전자 발현을 모니터링할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 hrpL의 발현은 실험실에서 자란 박테리아 배양과 식물 아포플라스트 ^8,9에서 회수된 박테리아 개체군 내에서 이질적이라는 것이 확인되었습니다. 단일 세포 수준의 유전자 발현 분석은 일반적으로 실험실 배지에서 성장한 박테리아 배양에서 수행되지만, 이러한 분석은 식물 내에서 자라는 박테리아 개체군에 대해서도 수행될 수 있으므로 자연적 맥락에서 하위 개체군 형성에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 식물에서 추출한 박테리아 개체군 분석에 대한 잠재적인 한계는 아포플라스트에 주사기 압력 침투에 의한 고전적인 접종 방법에 이어 잎 조직의 침용에 의한 박테리아 추출이 일반적으로 다운스트림 분석을 방해하는 다량의 세포 식물 파편을 생성한다는^{것입니다 10}. 대부분의 세포 파편은 GFP 형광과 겹치는 엽록체의 자가형광 단편으로 구성되어 있어 오해의 소지가 있는 결과를 초래합니다.

본 프로토콜은 2개의 모델 병리학에서 단세포 유전자 발현 이질성을 분석하는 과정을 설명한다: 하나는 P. syringae pv에 의해 형성된다. 토마토 균주는 DC3000 및 애기장대 탈리아나 (Col-0)이고, 다른 하나는 P. syringae pv에 의한 것이다. phaseolicola 균주 1448A 및 콩 식물 (Phaseolus vulgaris 품종 Canadian Wonder). 진공 챔버와 펌프를 이용한 진공 침투를 기반으로 한 접종 방법을 제안하여 잎 전체에 빠르고 손상없이 침투하는 방법을 제안합니다. 또한, 기존 프로토콜을 개선한 것으로, 주사기 내에서 소량의 부피를 사용하여 양압 및 음압 주기를 적용하여 아포성형액 추출을 기반으로 조직 파괴를 크게 줄이는 아포플라스트에서 박테리아 집단을 추출하는 더 부드러운 방법이 사용됩니다.

프로토콜

1. 식물 준비

1. 아래 단계에 따라 Arabidopsis Col-0 식물을 준비하십시오.
   1. 직경 10cm의 화분에 1:3 질석-식물 기질 혼합물( 재료 표 참조)을 채우고 이전에 물을 주고 15mm x 15mm 구멍이 있는 1.6cm x 1.6cm 금속 메쉬로 화분을 덮습니다. 고무 밴드를 사용하여 젖은 토양에 금속 메쉬를 조정합니다(그림 1A).
   2. 젖은 이쑤시개로 애기장대 씨앗을 금속 메쉬의 구멍에 뿌립니다. 냄비 안의 먼 위치에 3-4 개의 씨앗을 놓습니다 (그림 1B, C).
   3. 높은 상대 습도를 유지하기 위해 플라스틱 돔으로 냄비를 덮고 성층화를 위해 4°C에서 72시간 동안 배양합니다.
      참고: 층화(설명된 대로 높은 습도와 낮은 온도에서 배양)는 씨앗의 발아율과 동시성을 향상시킵니다.
   4. 짧은 하루 조건(8°C에서 16시간 밝음/21시간 어두움, 광도: 100μmol·^m-2·s-1, 상대 습도: 70%)에서 화분을 식물 성장 챔버로 옮깁니다.
   5. 종자 발아 후 (8-10 일), 핀셋을 사용하여 대부분의 묘목을 제거하고 냄비의 각 위치 (6 개의 묘목 / 냄비)에 하나의 묘목을 유지합니다 (그림 1D). 플라스틱 돔을 제거하여 냄비를 드러냅니다.
      참고: 식물은 발아 후 4-5주 후에 사용할 준비가 됩니다.
2. Phaseolus vulgaris 콩 (품종 Canadian Wonder) 식물을 준비하십시오.
   1. 페트리 접시의 바닥을 젖은 수건 종이로 덮고 그 위에 콩씨를 놓습니다. 페트리 접시를 수술용 테이프로 밀봉하고 28°C에서 3-4일 동안 배양합니다(그림 2A).
   2. 발아 된 씨앗을 젖은 10 : 1 질석-식물 기질 혼합물로 채워진 직경 3cm 냄비에 옮깁니다.
   3. 장일 설정(23°C에서 16시간 밝음/8시간 어두움, 광도: 100μmol·m−²·s⁻¹, 상대 습도: 70%)에서 식물 성장 챔버에서 배양합니다.
      알림: 식물은 발아 후 10일 후에 사용할 준비가 됩니다(그림 2B).

2. 애기장대와 콩식물의 접종

참고: 이 연구에서 균주 P. syringae pv. 토마토 DC3000 및 P. syringae pv. phaseolicola 1448A를 사용하였다.

1. P. syringae 접종물을 준비합니다.
   1. 적절한 항생제가 보충된 LB 플레이트(10g/L 트립톤, 5g/L NaCl, 5g/L 효모 추출물 및 16g/L 세균 한천, 표 참조)에 -80°C 글리세롤 스톡에서 관심 있는 P. syringae 균주를 줄무늬로 제거합니다. 28°C에서 40-48시간 동안 배양합니다.
      참고: 관심 균주가 플라스미드 또는 게놈 내성 유전자를 가지고 있는 경우 항생제를 사용하는 것이 좋습니다. P. syringae 에 권장되는 항생제 농도는 다음과 같습니다: 카나마이신(15μg/mL), 겐타마이신(10μg/mL), 암피실린(300μg/mL)( 재료 표 참조).
   2. 박테리아 바이오매스를 긁어내고 5mL의 10mM_MgCl2에 재현탁합니다. _OD600을 측정하고 10 mM_MgCl2를 첨가하여 0.1로 조정한다.
      참고: P. syringae 배양액의 OD₆₀₀ 0.1은 5 x 10⁷ CFU·^mL-1에 해당합니다.
   3. 10mM MgCl₂로 연속 희석을 수행하여 최종 접종물 농도 5 x 10⁵ CFU·^mL-1에 도달합니다. 애기장대 식물에 200mL, 콩 식물에 50mL의 접종물을 준비합니다.
   4. 접종 직전에 계면활성제인 Silwett L-77( 표 참조)을 최종 농도로 콩 접종의 경우 0.02%, 애기장대의 경우 0.01%로 첨가합니다. Silwett는 애기장대 조직에 다소 해롭습니다.
2. 진공 침투를 수행합니다.
   1. 애기장대 침윤의 경우 냄비 위에 X를 형성하는 두 개의 나무 막대기를 놓고(그림 1E) 200mL 접종물이 들어 있는 직경 14cm의 페트리 접시 위에 냄비를 아래로 향하게 놓습니다(그림 1F).
   2. 콩 잎 접종의 경우 접종물이 들어 있는 50mL 원추형 원심분리기 튜브에 잎을 넣습니다(그림 2C).
   3. 접종 용액에 담근 식물을 진공 챔버 (그림 1G 및 그림 2D)에 넣고 30 초 동안 500mbar의 펄스를 주어 잎에 침투시킵니다. 잎이 완전히 침투 할 때까지 진공 펄스를 2-3 회 반복합니다 (그림 1H 및 그림 2E).
   4. 종이로 초과 접종 용액을 배출하고 식물을 해당 성장 챔버로 되돌립니다.

3. 아포플라스트에서 박테리아 추출

1. 접종 4일 후, 애기장대 식물의 공중 부분이나 콩 식물의 접종된 잎을 잘라내어 바늘 없이 20mL 주사기에 넣습니다(그림 2G). 콩 잎의 경우 그림 2F와 같이 잎을 굴리고 축면이 바깥쪽을 향하도록 합니다.
2. 조직을 덮을 수 있도록 충분한 양의 증류수를 추가합니다(보통 10-15mL).
3. 플런저를 삽입하고 팁이 위를 향하도록 주사기를 수직 위치에 놓고 모든 공기가 팁 근처에 위치할 때까지 배럴을 부드럽게 두드려 주사기 내부의 과도한 공기와 기포를 제거합니다. 그런 다음 플런저를 밀어 공기를 빼냅니다. 주사기 내부에 가능한 한 적은 공기가 있으면 주사기 배럴의 끝을 파라핀 필름으로 덮습니다.
4. 조직이 어두워질 때까지 플런저를 조심스럽게 눌러 양압을 생성합니다(그림 1I 및 그림 2H). 그런 다음 플런저를 당겨 음압을 생성합니다(그림 1J 및 그림 2I). 이 단계를 3-5 번 반복하십시오.
5. 파라핀 필름과 플런저를 제거하고 도 2J에서와 같이 아포플라스트 추출 박테리아를 포함하는 유체를 수집합니다.

4. 아포플라스트 추출 박테리아의 단세포 분석

1. 아래 단계에 따라 컨포칼 현미경으로 시각화합니다.
   1. 증류수에 1.5% 아가로스 용액을 준비한다. 녹으면 나란히 놓인 두 현미경 슬라이드 사이의 공간을 채울 만큼 충분한 부피를 추가하고 그 위에 다른 슬라이드를 놓습니다(그림 3). 15분 동안 건조시킨 후 상단에 놓인 슬라이드를 조심스럽게 제거합니다. 칼날을 사용하여 사용 직전에 아가로스 패드를 5mm x 5mm 조각으로 자릅니다.
   2. 동시에, 실온에서 1분 동안 12,000 x g 에서 추출된 아포플라스트 박테리아 1mL를 원심분리하고, 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고, 펠릿을 물 20μL에 재현탁하여 세포를 농축합니다. 농축된 세포 2μL 방울을 0.17mm 커버슬립에 놓고 그림 3과 같이 이전에 1단계에서 얻은 5mm x 5mm 아가로스 패드 조각으로 방울을 덮습니다.
   3. 컨포칼 현미경으로 박테리아 준비를 시각화합니다( 재료 표 참조). 녹색 형광 박테리아를 식별하려면 488nm의 여기 레이저와 500nm에서 550nm 범위의 방출 필터를 사용하십시오. 모든 박테리아를 식별하려면 명시 필드를 사용하고 두 필드를 병합하십시오.
   4. Fiji를 사용하여 컨포칼 이미지를 처리합니다( 재료 표 참조). 이를 위해 MicrobeJ 플러그인을 사용하여 박테리아 세포의 윤곽을 식별하고 내부의 형광 강도를 측정합니다.
      참고: 이 분석에는 분리된 박테리아(클러스터되지 않음)에서 이미지를 획득하는 것이 좋습니다.
2. 유세포 분석에 의한 분석을 수행합니다.
   1. 아포플라스트에서 추출한 박테리아 현탁액의 분취량을 채취하여 유세포 분석기를 사용하여 분석합니다. 이벤트 100,000개를 획득합니다.
   2. 박테리아와 식물 파편을 구별하기 위해 접종하지 않은 식물에서 추출한 아포플라스트를 분석하고 전방 산란(FSC) 세포 크기와 측면 산란(SSC) 세포 크기를 보여주는 점도표를 아포플라스트에서 추출한 박테리아 현탁액의 세포 크기와 비교합니다. 비형광 박테리아를 식별하려면 비형광 동종 박테리아를 접종한 식물에서 추출한 아포플라스트를 사용하고 형광 방출을 비교하십시오.

결과

III형 분비 시스템의 발현은 식물 내 박테리아 성장에 필수적입니다. T3SS 유전자의 적시 발현은 복잡한 조절을 통해 이루어지며, 그 중심에는 T3SS 관련 유전자 발현의 핵심 활성화인자인 세포외 기능(ECF) 시그마 인자 HrpL이 있다¹¹. hrpL의 발현 분석은 이전에 하류 프로모터가 없는 gfp 유전자에 대한 염색체 위치 전사 융합을 사용하고 공초점 현미경 및 유세포 분석에 ?...

토론

여기에 제시된 방법은 박테리아가 식물 잎 조직으로 침투할 수 있도록 하는 비침습적 절차를 설명하여 조직 파괴를 최소화하면서 대량의 신속한 접종을 가능하게 합니다. P. syringae 종 복합체의 특징 중 하나는 식물 아포플라스트 내부와 식물 표면에서 착생식물(epiphyte)로 생존하고 증식하는 능력이다¹⁴. 따라서 본 프로토콜을 사용하여 추출된 박테리아가 식물 아포플라스?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.17 mm coverslip			No special requirements
1.6 x 1.6 mm metal mesh	Buzifu		Fiberglass screen mesh
10 cm diameter pots			No special requirements
140 mm Petri dishes			No special requirements
20 mL syringe			No special requirements
50 mL conical tubes	Sarstedt
Agarose	Merk
Ampicillin sodium	GoldBio
Bacteriological agar	Roko
Confocal Microscope Stellaris	Leica Microsystems
FACSVerse cell analyzer	BD Biosciences
Fiji software
Gentamycin sulfate	Duchefa	G-0124
Kanamycin monosulfate	Phytotechnology	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging
Plant substrate			No special requirements
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Toothpicks			No special requirements
Tryptone	Merk
Tweezers			No special requirements
Vacuum chamber 25 cm diameter	Kartell	554
Vacuum pump	GAST	DOA-P504-BN
Vermiculite			No special requirements
Yeast Extract	Merk