Análise Unicelular da Expressão de Genes de Seringas de Pseudomonas syringae no Tecido Vegetal

Resumo

O presente protocolo descreve um método que permite a análise da expressão gênica unicelular em populações de Pseudomonas syringae cultivadas dentro do apoplasto vegetal.

Resumo

Uma infinidade de microrganismos patogênicos atacam constantemente as plantas. O complexo de espécies de Pseudomonas syringae engloba bactérias Gram-negativas fitopatogênicas de especial relevância para um grande número de hospedeiros. P. syringae entra na planta pela superfície foliar e se multiplica rapidamente dentro do apoplasto, formando microcolônias que ocupam o espaço intercelular. A expressão constitutiva de proteínas fluorescentes pelas bactérias permite a visualização das microcolônias e o monitoramento do desenvolvimento da infecção em nível microscópico. Avanços recentes na análise unicelular têm revelado a grande complexidade alcançada pelas populações clonais isogênicas de bactérias. Essa complexidade, chamada de heterogeneidade fenotípica, é consequência de diferenças célula a célula na expressão gênica (não ligadas a diferenças genéticas) entre a comunidade bacteriana. Para analisar a expressão de loci individuais em nível unicelular, fusões transcricionais a proteínas fluorescentes têm sido amplamente utilizadas. Sob condições de estresse, como as que ocorrem durante a colonização do apoplasto vegetal, P. syringae diferencia-se em subpopulações distintas com base na expressão heterogênea de genes-chave de virulência (i.e., o sistema de secreção Hrp tipo III). No entanto, a análise de célula única de qualquer população de P. syringae recuperada do tecido vegetal é desafiadora devido aos detritos celulares liberados durante a ruptura mecânica intrínseca aos processos de inoculação e extração bacteriana. O presente relato detalha um método desenvolvido para monitorar a expressão de genes de interesse de P. syringae em nível unicelular durante a colonização de Arabidopsis e feijoeiro. A preparação das plantas e as suspensões bacterianas utilizadas para inoculação em câmara de vácuo são descritas. A recuperação de bactérias endofíticas de folhas infectadas por extração com fluido apoplásico também é explicada aqui. Tanto a inoculação bacteriana quanto os métodos de extração bacteriana são empiricamente otimizados para minimizar danos às células vegetais e bacterianas, resultando em preparações bacterianas ideais para análise de microscopia e citometria de fluxo.

Introdução

Bactérias patogênicas apresentam diferenças em fenótipos diversos, dando origem à formação de subpopulações dentro de populações geneticamente idênticas. Esse fenômeno é conhecido como heterogeneidade fenotípica e tem sido proposto como estratégia de adaptação durante interações bactéria-hospedeiro¹. Avanços recentes na resolução óptica de microscópios confocais, citometria de fluxo e microfluídica, combinados com proteínas fluorescentes, têm fomentado análises unicelulares de populações bacterianas².

A Pseudomonas syringae Gram-negativa é uma bactéria fitopatogênica arquetípica devid....

Protocolo

1. Preparo das plantas

1. Prepare plantas de Arabidopsis Col-0 seguindo os passos abaixo.
   1. Encha um vaso de 10 cm de diâmetro com uma mistura de substrato vermiculita-planta 1:3 (ver Tabela de Materiais), previamente regado, e cubra o vaso com uma malha metálica de 15 cm x 15 cm com furos de 1,6 mm x 1,6 mm. Ajustar a malha metálica ao solo úmido com elástico (Figura 1A).
   2. Com um palito molhado, semeie sementes de Arabidopsis nos buracos da malha metálica. Coloque de três a quatro sementes em posições distantes dentro do vaso (Figura 1B, C

Resultados

A expressão do sistema de secreção tipo III é essencial para o crescimento bacteriano dentro da planta. A expressão oportuna dos genes T3SS é obtida através de uma intrincada regulação, cujo centro é o fator sigma HrpL da função extracitoplasmática (LEC), o principal ativador da expressão de genes relacionados ao T3SS¹¹. Uma análise da expressão de hrpL foi previamente realizada usando uma fusão transcricional localizada em cromossomos com um gene gfp sem promoto.......

Discussão

O método aqui apresentado descreve um procedimento não invasivo que permite a infiltração de bactérias no tecido foliar da planta, permitindo a inoculação rápida de grandes volumes e minimizando a ruptura tecidual. Uma das características do complexo de espécies de P. syringae é a capacidade de sobreviver e proliferar no interior do apoplasto vegetal e na superfície da planta como epífita¹⁴. Assim, não se pode descartar a possibilidade de que as bactérias extraídas pelo pr.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.17 mm coverslip			No special requirements
1.6 x 1.6 mm metal mesh	Buzifu		Fiberglass screen mesh
10 cm diameter pots			No special requirements
140 mm Petri dishes			No special requirements
20 mL syringe			No special requirements
50 mL conical tubes	Sarstedt
Agarose	Merk
Ampicillin sodium	GoldBio
Bacteriological agar	Roko
Confocal Microscope Stellaris	Leica Microsystems
FACSVerse cell analyzer	BD Biosciences
Fiji software
Gentamycin sulfate	Duchefa	G-0124
Kanamycin monosulfate	Phytotechnology	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging
Plant substrate			No special requirements
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Toothpicks			No special requirements
Tryptone	Merk
Tweezers			No special requirements
Vacuum chamber 25 cm diameter	Kartell	554
Vacuum pump	GAST	DOA-P504-BN
Vermiculite			No special requirements
Yeast Extract	Merk