Análise Unicelular da Expressão de Genes de Seringas de Pseudomonas syringae no Tecido Vegetal

Resumo

O presente protocolo descreve um método que permite a análise da expressão gênica unicelular em populações de Pseudomonas syringae cultivadas dentro do apoplasto vegetal.

Resumo

Uma infinidade de microrganismos patogênicos atacam constantemente as plantas. O complexo de espécies de Pseudomonas syringae engloba bactérias Gram-negativas fitopatogênicas de especial relevância para um grande número de hospedeiros. P. syringae entra na planta pela superfície foliar e se multiplica rapidamente dentro do apoplasto, formando microcolônias que ocupam o espaço intercelular. A expressão constitutiva de proteínas fluorescentes pelas bactérias permite a visualização das microcolônias e o monitoramento do desenvolvimento da infecção em nível microscópico. Avanços recentes na análise unicelular têm revelado a grande complexidade alcançada pelas populações clonais isogênicas de bactérias. Essa complexidade, chamada de heterogeneidade fenotípica, é consequência de diferenças célula a célula na expressão gênica (não ligadas a diferenças genéticas) entre a comunidade bacteriana. Para analisar a expressão de loci individuais em nível unicelular, fusões transcricionais a proteínas fluorescentes têm sido amplamente utilizadas. Sob condições de estresse, como as que ocorrem durante a colonização do apoplasto vegetal, P. syringae diferencia-se em subpopulações distintas com base na expressão heterogênea de genes-chave de virulência (i.e., o sistema de secreção Hrp tipo III). No entanto, a análise de célula única de qualquer população de P. syringae recuperada do tecido vegetal é desafiadora devido aos detritos celulares liberados durante a ruptura mecânica intrínseca aos processos de inoculação e extração bacteriana. O presente relato detalha um método desenvolvido para monitorar a expressão de genes de interesse de P. syringae em nível unicelular durante a colonização de Arabidopsis e feijoeiro. A preparação das plantas e as suspensões bacterianas utilizadas para inoculação em câmara de vácuo são descritas. A recuperação de bactérias endofíticas de folhas infectadas por extração com fluido apoplásico também é explicada aqui. Tanto a inoculação bacteriana quanto os métodos de extração bacteriana são empiricamente otimizados para minimizar danos às células vegetais e bacterianas, resultando em preparações bacterianas ideais para análise de microscopia e citometria de fluxo.

Introdução

Bactérias patogênicas apresentam diferenças em fenótipos diversos, dando origem à formação de subpopulações dentro de populações geneticamente idênticas. Esse fenômeno é conhecido como heterogeneidade fenotípica e tem sido proposto como estratégia de adaptação durante interações bactéria-hospedeiro¹. Avanços recentes na resolução óptica de microscópios confocais, citometria de fluxo e microfluídica, combinados com proteínas fluorescentes, têm fomentado análises unicelulares de populações bacterianas².

A Pseudomonas syringae Gram-negativa é uma bactéria fitopatogênica arquetípica devido à sua importância acadêmica e econômica³. O ciclo de vida de P. syringae está ligado ao ciclo da água⁴. A P. syringae adentra os espaços intercelulares entre as células do mesofilo, o apoplasto foliar da planta, através de aberturas naturais como estômatos ou feridas⁵. Uma vez dentro do apoplasto, P. syringae depende do sistema de secreção tipo III (T3SS) e dos efetores translocados tipo III (T3E) para suprimir a imunidade vegetal e manipular as funções celulares das plantas em benefício do patógeno⁶. A expressão de T3SS e T3E depende do regulador mestre HrpL, um fator sigma alternativo que se liga aos motivos hrp-box na região promotora dos genes alvo⁷.

Ao gerar fusões transcricionais localizadas no cromossomo com genes de proteínas fluorescentes a jusante do gene de interesse, pode-se monitorar a expressão gênica com base nos níveis de fluorescência emitidos em nível de célula única⁸. Usando este método, estabeleceu-se que a expressão de hrpL é heterogênea tanto dentro de culturas bacterianas cultivadas em laboratório quanto dentro de populações bacterianas recuperadas do apoplasto vegetal ^8,9. Embora a análise da expressão gênica em nível unicelular seja tipicamente realizada em culturas bacterianas cultivadas em meios de laboratório, tais análises também podem ser realizadas em populações bacterianas que crescem dentro da planta, fornecendo informações valiosas sobre a formação de subpopulações no contexto natural. Uma limitação potencial para a análise de populações bacterianas extraídas da planta é que os métodos clássicos de inoculação por infiltração por pressão de seringa no apoplasto, seguida de extração bacteriana por maceração do tecido foliar, tipicamente geram uma grande quantidade de restos celulares vegetais que interferem na análise a jusante¹⁰. A maioria dos debris celulares consiste em fragmentos autofluorescentes de cloroplastos que se sobrepõem à fluorescência da GFP, resultando em resultados enganosos.

O presente protocolo descreve o processo de análise da heterogeneidade da expressão gênica unicelular em dois fisiossistemas modelo: o formado por P. syringae pv. tomateiro cepa DC3000 e Arabidopsis thaliana (Col-0), e a outra pelo P. syringae pv. phaseolicola cepa 1448A e plantas de feijão (cultivar Phaseolus vulgaris Canadian Wonder). Um método de inoculação é proposto baseado na infiltração a vácuo usando uma câmara de vácuo e uma bomba, resultando em um método rápido e livre de danos para infiltração de folhas inteiras. Além disso, como um aprimoramento dos protocolos convencionais, um método mais suave é usado para extrair a população bacteriana do apoplasto que reduz significativamente a ruptura tecidual, baseado na extração de fluido apoplástico através da aplicação de ciclos de pressão positiva e negativa usando uma pequena quantidade de volume dentro de uma seringa.

Protocolo

1. Preparo das plantas

1. Prepare plantas de Arabidopsis Col-0 seguindo os passos abaixo.
   1. Encha um vaso de 10 cm de diâmetro com uma mistura de substrato vermiculita-planta 1:3 (ver Tabela de Materiais), previamente regado, e cubra o vaso com uma malha metálica de 15 cm x 15 cm com furos de 1,6 mm x 1,6 mm. Ajustar a malha metálica ao solo úmido com elástico (Figura 1A).
   2. Com um palito molhado, semeie sementes de Arabidopsis nos buracos da malha metálica. Coloque de três a quatro sementes em posições distantes dentro do vaso (Figura 1B, C).
   3. Cubra os vasos com uma cúpula de plástico para manter a umidade relativa alta e incube-os por 72 h a 4 °C para estratificação.
      OBS: A estratificação (incubação em alta umidade e baixa temperatura, conforme descrito) melhora a velocidade de germinação e sincronia das sementes.
   4. Transfira os vasos para uma câmara de crescimento de plantas em condições de dias curtos (8 h claro/16 h escuro a 21 °C, intensidade luminosa: 100 μmol·m−²·s⁻¹, umidade relativa: 70%).
   5. Após a germinação das sementes (8-10 dias), utilizar a pinça para retirar a maior parte das plântulas, mantendo uma plântula em cada uma das posições do vaso (seis plântulas/vaso) (Figura 1D). Retire a cúpula de plástico para descobrir os potes.
      NOTA: As plantas estarão prontas para uso 4-5 semanas após a germinação.
2. Preparar plantas de feijão Phaseolus vulgaris (cultivar Canadian Wonder).
   1. Cubra o fundo de uma placa de Petri com um pedaço de papel toalha molhado e coloque as sementes de feijão por cima. Selar a placa de Petri com fita cirúrgica e incubar a 28 °C por 3-4 dias (Figura 2A).
   2. Transfira as sementes germinadas para um vaso de 10 cm de diâmetro preenchido com uma mistura úmida de vermiculita e substrato vegetal 1:3.
   3. Incubar em uma câmara de crescimento de plantas em ambientes de dias longos (16 h claro/8 h escuro a 23 °C, intensidade de luz: 100 μmol·m−²·s⁻¹, umidade relativa: 70%).
      OBS: As plantas estarão prontas para uso 10 dias após a germinação (Figura 2B).

2. Inoculação de Arabidopsis e feijoeiro

OBS: Neste estudo, as cepas P. syringae pv. tomateiro DC3000 e P. syringae pv. phaseolicola 1448A.

1. Preparar o inóculo de P. syringae.
   1. Estirpe de P. syringae de interesse de um stock de glicerol de -80 °C para uma placa LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de NaCl, 5 g/L de extracto de levedura e 16 g/L de ágar bacteriológico, ver Tabela de Materiais) suplementada com os antibióticos adequados. Incubar a 28 °C durante 40-48 h.
      NOTA: O uso de antibióticos é recomendado se a cepa de interesse carrega um plasmídeo ou um gene de resistência genômica. As concentrações recomendadas de antibióticos para P. syringae são as seguintes: canamicina (15 μg/mL), gentamicina (10 μg/mL), ampicilina (300 μg/mL) (ver Tabela de Materiais).
   2. Raspar a biomassa bacteriana e ressuspender em 5 mL de MgCl₂ 10 mM. Meça o OD₆₀₀ e ajuste para 0,1 adicionando 10 mM MgCl₂.
      NOTA: Um OD₆₀₀ de 0,1 de uma cultura de P. syringae corresponde a 5 x 10⁷ UFC·mL⁻¹.
   3. Realizar diluições seriadas em 10 mM MgCl₂ para atingir uma concentração final de inóculo de 5 x 10⁵ UFC·mL⁻¹. Preparar 200 mL de inóculo para as plantas de Arabidopsis e 50 mL para as plantas de feijão.
   4. Imediatamente antes da inoculação, adicionar o tensoativo Silwett L-77 (ver Tabela de Materiais) a uma concentração final de 0,02% para inoculação de feijão e 0,01% para Arabidopsis. Note que Silwett é um pouco prejudicial para o tecido Arabidopsis.
2. Realizar infiltração a vácuo.
   1. Para a infiltração de Arabidopsis, colocar dois palitos de madeira formando um X sobre o vaso (Figura 1E) e colocá-lo virado para baixo sobre uma placa de Petri de 14 cm de diâmetro contendo o inóculo de 200 mL (Figura 1F).
   2. Para a inoculação das folhas de feijão, introduzir a folha em um tubo centrífugo cônico de 50 mL contendo o inóculo (Figura 2C).
   3. Inserir as plantas imersas na solução de inóculo em câmara de vácuo (Figura 1G e Figura 2D) e dar um pulso de 500 mbar por 30 s para infiltração das folhas. Repetir o pulso de vácuo 2-3 vezes até que a folha esteja completamente infiltrada (Figura 1H e Figura 2E).
   4. Escorra o excesso de solução de inóculo com um pedaço de papel e devolva as plantas à câmara de crescimento correspondente.

3. Extração de bactérias do apoplasto

1. Quatro dias após a inoculação, cortar a parte aérea da planta Arabidopsis ou a folha inoculada da planta de feijão e colocá-la em uma seringa de 20 mL sem agulha (Figura 2G). Para folhas de feijão, enrole a folha sobre si mesma, deixando a face abaxial para fora, como mostra a Figura 2F.
2. Adicione volume suficiente de água destilada para cobrir o tecido (geralmente 10-15 mL).
3. Insira o êmbolo e, com a seringa na posição vertical com a ponta apontada para cima, remova o excesso de ar e bolhas de ar dentro da seringa, batendo suavemente no barril até que todo o ar esteja localizado perto da ponta. Deslize então o êmbolo para retirar o ar. Quando houver o mínimo de ar possível dentro da seringa, cubra a ponta do barril da seringa com filme de parafina.
4. Pressionar cuidadosamente o êmbolo para gerar pressão positiva até que o tecido fique mais escuro (Figura 1I e Figura 2H). Em seguida, truxe o êmbolo para gerar pressão negativa (Figura 1J e Figura 2I). Repita esta etapa de 3 a 5 vezes.
5. Retirar o filme de parafina e o êmbolo e coletar o líquido contendo as bactérias extraídas do apoplasto, conforme Figura 2J.

4. Análise unicelular das bactérias extraídas do apoplasto

1. Visualize por microscopia confocal seguindo os passos abaixo.
   1. Preparar uma solução de agarose a 1,5% em água destilada. Depois de derretido, adicione volume suficiente para preencher o espaço entre duas lâminas de microscopia colocadas lado a lado e coloque outra lâmina sobre ela (Figura 3). Deixe secar por 15 min e retire com cuidado a lâmina colocada na parte superior. Usando uma lâmina, corte a almofada de agarose em pedaços de 5 mm x 5 mm antes de usar.
   2. Paralelamente, centrifugar 1 mL da bactéria extraída do apoplasto a 12.000 x g por 1 min à temperatura ambiente, remover cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspender o pellet em 20 μL de água para concentrar as células. Coloque uma gota de 2 μL das células concentradas sobre uma lamínula de 0,17 mm e cubra a gota com um pedaço de 5 mm x 5 mm da almofada de agarose previamente obtida na etapa 1, conforme representado na Figura 3.
   3. Visualize a preparação bacteriana sob o microscópio confocal (ver Tabela de Materiais). Para identificar bactérias verde-fluorescentes, utilizar o laser de excitação a 488 nm e um filtro de emissão variando de 500 nm a 550 nm. Para identificar todas as bactérias, use o campo brilhante e mescle os dois campos.
   4. Processe as imagens confocais usando Fiji (consulte Tabela de Materiais). Para fazer isso, use o plugin MicrobeJ para identificar o contorno da célula bacteriana e medir a intensidade da fluorescência em seu interior.
      NOTA: A aquisição de imagens a partir de bactérias isoladas (não agrupadas) é recomendada para esta análise.
2. Realizar análise por citometria de fluxo.
   1. Pegue uma alíquota das suspensões de bactérias extraídas do apoplasto para analisar usando o citômetro de fluxo. Adquira 100.000 eventos.
   2. Para discriminar entre bactérias e restos vegetais, analise o apoplasto extraído de uma planta não inoculada e compare o dot plot mostrando seu tamanho de célula de dispersão direta (FSC) versus tamanho de célula de dispersão lateral (SSC) com o da suspensão bacteriana extraída de apoplasto. Para identificar bactérias não fluorescentes, utilizar os apoplastos extraídos das plantas inoculadas com bactérias isogênicas não fluorescentes e comparar suas emissões fluorescentes.

Resultados

A expressão do sistema de secreção tipo III é essencial para o crescimento bacteriano dentro da planta. A expressão oportuna dos genes T3SS é obtida através de uma intrincada regulação, cujo centro é o fator sigma HrpL da função extracitoplasmática (LEC), o principal ativador da expressão de genes relacionados ao T3SS¹¹. Uma análise da expressão de hrpL foi previamente realizada usando uma fusão transcricional localizada em cromossomos com um gene gfp sem promoto...

Discussão

O método aqui apresentado descreve um procedimento não invasivo que permite a infiltração de bactérias no tecido foliar da planta, permitindo a inoculação rápida de grandes volumes e minimizando a ruptura tecidual. Uma das características do complexo de espécies de P. syringae é a capacidade de sobreviver e proliferar no interior do apoplasto vegetal e na superfície da planta como epífita¹⁴. Assim, não se pode descartar a possibilidade de que as bactérias extraídas pelo pr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.17 mm coverslip			No special requirements
1.6 x 1.6 mm metal mesh	Buzifu		Fiberglass screen mesh
10 cm diameter pots			No special requirements
140 mm Petri dishes			No special requirements
20 mL syringe			No special requirements
50 mL conical tubes	Sarstedt
Agarose	Merk
Ampicillin sodium	GoldBio
Bacteriological agar	Roko
Confocal Microscope Stellaris	Leica Microsystems
FACSVerse cell analyzer	BD Biosciences
Fiji software
Gentamycin sulfate	Duchefa	G-0124
Kanamycin monosulfate	Phytotechnology	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging
Plant substrate			No special requirements
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Toothpicks			No special requirements
Tryptone	Merk
Tweezers			No special requirements
Vacuum chamber 25 cm diameter	Kartell	554
Vacuum pump	GAST	DOA-P504-BN
Vermiculite			No special requirements
Yeast Extract	Merk