Analisi unicellulare dell'espressione dei geni di Pseudomonas syringae all'interno del tessuto vegetale

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un metodo che consente l'analisi dell'espressione genica unicellulare su popolazioni di Pseudomonas syringae coltivate all'interno dell'apoplasto della pianta.

Abstract

Una pletora di microrganismi patogeni attacca costantemente le piante. Il complesso di specie Pseudomonas syringae comprende batteri patogeni delle piante Gram-negativi di particolare rilevanza per un ampio numero di ospiti. P. syringae entra nella pianta dalla superficie fogliare e si moltiplica rapidamente all'interno dell'apoplasto, formando microcolonie che occupano lo spazio intercellulare. L'espressione costitutiva delle proteine fluorescenti da parte dei batteri consente la visualizzazione delle microcolonie e il monitoraggio dello sviluppo dell'infezione a livello microscopico. I recenti progressi nell'analisi di singole cellule hanno rivelato la grande complessità raggiunta dalle popolazioni batteriche isogeniche clonali. Questa complessità, indicata come eterogeneità fenotipica, è la conseguenza delle differenze cellula-cellula nell'espressione genica (non legate a differenze genetiche) tra la comunità batterica. Per analizzare l'espressione dei singoli loci a livello di singola cellula, sono state ampiamente utilizzate fusioni trascrizionali in proteine fluorescenti. In condizioni di stress, come quelle che si verificano durante la colonizzazione dell'apoplasto della pianta, P. syringae si differenzia in sottopopolazioni distinte in base all'espressione eterogenea di geni chiave di virulenza (cioè il sistema di secrezione di tipo III Hrp). Tuttavia, l'analisi a singola cellula di una determinata popolazione di P. syringae recuperata dal tessuto vegetale è impegnativa a causa dei detriti cellulari rilasciati durante l'interruzione meccanica intrinseca ai processi di inoculazione ed estrazione batterica. Il presente rapporto descrive un metodo sviluppato per monitorare l'espressione dei geni P. syringae di interesse a livello di singola cellula durante la colonizzazione di piante di Arabidopsis e fagioli. Vengono descritte la preparazione delle piante e le sospensioni batteriche utilizzate per l'inoculazione mediante camera a vuoto. Qui viene spiegato anche il recupero dei batteri endofiti dalle foglie infette mediante estrazione di liquido apoplastico. Sia l'inoculazione batterica che i metodi di estrazione batterica sono ottimizzati empiricamente per ridurre al minimo il danno alle cellule vegetali e batteriche, risultando in preparati batterici ottimali per la microscopia e l'analisi della citometria a flusso.

Introduzione

I batteri patogeni mostrano differenze nei diversi fenotipi, dando origine alla formazione di sottopopolazioni all'interno di popolazioni geneticamente identiche. Questo fenomeno è noto come eterogeneità fenotipica ed è stato proposto come strategia di adattamento durante le interazioni batterio-ospite¹. I recenti progressi nella risoluzione ottica dei microscopi confocali, della citometria a flusso e della microfluidica, combinati con proteine fluorescenti, hanno favorito l'analisi a singola cellula delle popolazioni batteriche².

La Pseudomonas syringae Gram-negativa è un batterio patogeno delle piante archetipico a causa della sua importanza sia accademica che economica³. Il ciclo vitale di P. syringae è legato al ciclo dell'acqua⁴. P. syringae entra negli spazi intercellulari tra le cellule del mesofillo, la foglia della pianta apoplasta, attraverso aperture naturali come stomi o ferite⁵. Una volta all'interno dell'apoplasto, P. syringae si basa sul sistema di secrezione di tipo III (T3SS) e sugli effettori traslocati di tipo III (T3E) per sopprimere l'immunità delle piante e manipolare le funzioni cellulari delle piante a beneficio del patogeno⁶. L'espressione di T3SS e T3E dipende dal regolatore principale HrpL, un fattore sigma alternativo che si lega ai motivi hrp-box nella regione del promotore dei geni bersaglio⁷.

Generando fusioni trascrizionali localizzate dal cromosoma a geni proteici fluorescenti a valle del gene di interesse, è possibile monitorare l'espressione genica in base ai livelli di fluorescenza emessi^{a livello 8} di singola cellula. Utilizzando questo metodo, è stato stabilito che l'espressione di hrpL è eterogenea sia all'interno di colture batteriche coltivate in laboratorio che all'interno di popolazioni batteriche recuperate dalla pianta apoplast ^8,9. Sebbene l'analisi dell'espressione genica a livello monocellulare sia tipicamente eseguita in colture batteriche coltivate in terreni di laboratorio, tali analisi possono essere effettuate anche su popolazioni batteriche che crescono all'interno della pianta, fornendo così preziose informazioni sulla formazione di sottopopolazioni nel contesto naturale. Un potenziale limite per l'analisi delle popolazioni batteriche estratte dalla pianta è che i metodi classici di inoculazione mediante infiltrazione a pressione della siringa nell'apoplast, seguita dall'estrazione batterica mediante macerazione del tessuto fogliare, generano tipicamente una grande quantità di detriti vegetali cellulari che interferiscono con l'analisi a valle¹⁰. La maggior parte dei detriti cellulari è costituita da frammenti autofluorescenti di cloroplasti che si sovrappongono alla fluorescenza GFP, con risultati fuorvianti.

Il presente protocollo descrive il processo di analisi dell'eterogeneità dell'espressione genica di singole cellule in due patosistemi modello: quello formato da P. syringae pv. ceppo di pomodoro DC3000 e Arabidopsis thaliana (Col-0), e l'altro dal P. syringae pv. phaseolicola ceppo 1448A e piante di fagioli (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). Viene proposto un metodo di inoculazione basato sull'infiltrazione sotto vuoto utilizzando una camera a vuoto e una pompa, risultando in un metodo rapido e privo di danni per infiltrarsi nelle foglie intere. Inoltre, come miglioramento rispetto ai protocolli convenzionali, viene utilizzato un metodo più delicato per estrarre la popolazione batterica dall'apoplast che riduce significativamente la rottura dei tessuti, basato sull'estrazione del liquido apoplastico applicando cicli di pressione positiva e negativa utilizzando una piccola quantità di volume all'interno di una siringa.

Protocollo

1. Preparazione delle piante

1. Preparare le piante di Arabidopsis Col-0 seguendo i passaggi seguenti.
   1. Riempire un vaso di 10 cm di diametro con un mix di substrato vermiculite e pianta 1:3 (vedi Tabella dei materiali), precedentemente annaffiato, e coprire il vaso con una rete metallica di 15 cm x 15 cm con fori da 1,6 mm x 1,6 mm. Regolare la rete metallica sul terreno bagnato usando un elastico (Figura 1A).
   2. Con uno stuzzicadenti bagnato, semina i semi di Arabidopsis nei fori della rete metallica. Metti tre o quattro semi in posizioni distanti all'interno del vaso (Figura 1B, C).
   3. Coprire i vasi con una cupola di plastica per mantenere alta l'umidità relativa e incubarli per 72 h a 4 °C per la stratificazione.
      NOTA: La stratificazione (incubazione ad alta umidità e bassa temperatura, come descritto) migliora il tasso di germinazione e sincronia dei semi.
   4. Trasferire i vasi in una camera di crescita delle piante in condizioni di breve durata (8 ore di luce/16 ore di buio a 21 °C, intensità luminosa: 100 μmol·m−²·s⁻¹, umidità relativa: 70%).
   5. Dopo la germinazione dei semi (8-10 giorni), utilizzare le pinzette per rimuovere la maggior parte delle piantine, mantenendo una piantina in ciascuna delle posizioni del vaso (sei piantine / vaso) (Figura 1D). Rimuovere la cupola di plastica per scoprire i vasi.
      NOTA: Le piante saranno pronte all'uso 4-5 settimane dopo la germinazione.
2. Preparare le piante di fagiolo Phaseolus vulgaris (cultivar Canadian Wonder).
   1. Coprire il fondo di una capsula di Petri con un pezzo di carta assorbente bagnato e posizionare i semi di fagioli sopra di esso. Sigillare la capsula di Petri con nastro chirurgico e incubare a 28 °C per 3-4 giorni (Figura 2A).
   2. Trasferire i semi germinati in un vaso di 10 cm di diametro riempito con una miscela di substrato 1:3 umido di vermiculite-pianta.
   3. Incubare in una camera di crescita delle piante in condizioni di lunga giornata (16 ore di luce/8 ore di buio a 23 °C, intensità luminosa: 100 μmol·m−²·s⁻¹, umidità relativa: 70%).
      NOTA: Le piante saranno pronte per l'uso 10 giorni dopo la germinazione (Figura 2B).

2. Inoculazione di Arabidopsis e piante di fagioli

NOTA: In questo studio, i ceppi P. syringae pv. pomodoro DC3000 e P. syringae pv. phaseolicola 1448A.

1. Preparare l'inoculo di P. syringae.
   1. Filtrare il ceppo di interesse di P. syringae da uno stock di glicerolo a -80 °C su una piastra LB (10 g/L di triptone, 5 g/L di NaCl, 5 g/L di estratto di lievito e 16 g/L di agar batteriologico, vedi Tabella dei materiali) integrata con gli antibiotici appropriati. Incubare a 28 °C per 40-48 h.
      NOTA: L'uso di antibiotici è raccomandato se il ceppo di interesse porta un plasmide o un gene di resistenza genomica. Le concentrazioni antibiotiche raccomandate per P. syringae sono le seguenti: kanamicina (15 μg/ml), gentamicina (10 μg/ml), ampicillina (300 μg/ml) (vedere Tabella dei materiali).
   2. Raschiare via la biomassa batterica e risospendere in 5 ml di 10 mM MgCl₂. Misurare l'OD₆₀₀ e regolare a 0,1 aggiungendo 10 mM MgCl₂.
      NOTA: Un OD₆₀₀ di 0,1 di una coltura di P. syringae corrisponde a 5 x 10⁷ CFU·mL⁻¹.
   3. Eseguire diluizioni seriali in 10 mM MgCl₂ per raggiungere una concentrazione finale di inoculo di 5 x 10⁵ CFU·mL⁻¹. Preparare 200 ml di inoculo per le piante di Arabidopsis e 50 ml per le piante di fagioli.
   4. Subito prima dell'inoculazione, aggiungere il tensioattivo Silwett L-77 (vedi tabella dei materiali) ad una concentrazione finale dello 0,02% per l'inoculazione dei fagioli e dello 0,01% per l'arabidopsis. Si noti che Silwett è in qualche modo dannoso per il tessuto Arabidopsis.
2. Eseguire l'infiltrazione sotto vuoto.
   1. Per l'infiltrazione di Arabidopsis, posizionare due bastoncini di legno che formano una X sopra il vaso (Figura 1E) e posizionare il vaso rivolto verso il basso su una capsula di Petri di 14 cm di diametro contenente l'inoculo da 200 ml (Figura 1F).
   2. Per l'inoculazione delle foglie di fagiolo, introdurre la foglia in una provetta conica da centrifuga da 50 mL contenente l'inoculo (Figura 2C).
   3. Inserire le piante immerse nella soluzione di inoculo in una camera a vuoto (Figura 1G e Figura 2D) e dare un impulso di 500 mbar per 30 s per infiltrarsi nelle foglie. Ripetere l'impulso del vuoto 2-3 volte fino a quando la foglia è completamente infiltrata (Figura 1H e Figura 2E).
   4. Scolare la soluzione di inoculo in eccesso con un pezzo di carta e riportare le piante nella loro camera di crescita corrispondente.

3. Estrazione di batteri dall'apoplast

1. Quattro giorni dopo l'inoculazione, tagliare la parte aerea della pianta di Arabidopsis o la foglia inoculata dalla pianta di fagioli e metterla in una siringa da 20 ml senza ago (Figura 2G). Per le foglie di fagiolo, arrotolare la foglia su se stessa, lasciando la faccia abassiale verso l'esterno, come mostrato nella Figura 2F.
2. Aggiungere un volume sufficiente di acqua distillata per coprire il tessuto (di solito 10-15 ml).
3. Inserire lo stantuffo e, con la siringa in posizione verticale con la punta rivolta verso l'alto, rimuovere l'aria in eccesso e le bolle d'aria all'interno della siringa picchiettando delicatamente il cilindro fino a quando tutta l'aria si trova vicino alla punta. Far scorrere quindi lo stantuffo per estrarre l'aria. Una volta che c'è meno aria possibile all'interno della siringa, coprire la punta del cilindro della siringa con pellicola di paraffina.
4. Premere con attenzione lo stantuffo per generare una pressione positiva fino a quando il tessuto diventa più scuro (Figura 1I e Figura 2H). Quindi, tirare lo stantuffo per generare una pressione negativa (Figura 1J e Figura 2I). Ripeti questo passaggio 3-5 volte.
5. Rimuovere la pellicola di paraffina e lo stantuffo e raccogliere il fluido contenente i batteri estratti dall'apoplasto, come nella figura 2J.

4. Analisi unicellulare dei batteri estratti dall'apoplasto

1. Visualizza al microscopio confocale seguendo i passaggi seguenti.
   1. Preparare una soluzione di agarosio all'1,5% in acqua distillata. Una volta fuso, aggiungere un volume sufficiente a riempire lo spazio tra due vetrini da microscopia affiancati e posizionare un altro vetrino sopra di esso (Figura 3). Lasciateli asciugare per 15 minuti e rimuovete con cura il vetrino posto sulla parte superiore. Utilizzando una lama, tagliare il tampone di agarosio in pezzi da 5 mm x 5 mm subito prima dell'uso.
   2. Parallelamente, centrifugare 1 mL dei batteri estratti dall'apoplasto a 12.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente, rimuovere con attenzione il surnatante usando una pipetta e risospendere il pellet in 20 μL di acqua per concentrare le cellule. Porre una goccia di 2 μL delle cellule concentrate su un coprivetrino di 0,17 mm e coprire la goccia con un pezzo di 5 mm x 5 mm del tampone di agarosio precedentemente ottenuto nella fase 1, come illustrato nella figura 3.
   3. Visualizza la preparazione batterica al microscopio confocale (vedi Tabella dei materiali). Per identificare i batteri fluorescenti verdi, utilizzare il laser di eccitazione a 488 nm e un filtro di emissione che va da 500 nm a 550 nm. Per identificare tutti i batteri, utilizzare il campo luminoso e unire entrambi i campi.
   4. Elaborare le immagini confocali utilizzando le Figi (vedi Tabella dei materiali). Per fare ciò, utilizzare il plug-in MicrobeJ per identificare il contorno della cellula batterica e misurare l'intensità della fluorescenza all'interno.
      NOTA: l'acquisizione di immagini da batteri isolati (non raggruppati) è raccomandata per questa analisi.
2. Eseguire analisi mediante citometria a flusso.
   1. Prendi un'aliquota delle sospensioni di batteri estratti dall'apoplasto da analizzare usando il citometro a flusso. Acquisisci 100.000 eventi.
   2. Per discriminare tra batteri e detriti vegetali, analizzare l'apoplast estratto da una pianta non inoculata e confrontare il dot plot che mostra la sua dimensione della cellula di diffusione diretta (FSC) rispetto alla dimensione della cellula di dispersione laterale (SSC) con quella della sospensione batterica estratta dall'apoplasto. Per identificare i batteri non fluorescenti, utilizzare gli apoplasti estratti dalle piante inoculate con batteri isogeni non fluorescenti e confrontare le loro emissioni fluorescenti.

Risultati

L'espressione del sistema di secrezione di tipo III è essenziale per la crescita batterica all'interno della pianta. L'espressione tempestiva dei geni T3SS è ottenuta attraverso una regolazione complessa, al centro della quale c'è il fattore sigma della funzione extracitoplasmatica (ECF) HrpL, l'attivatore chiave dell'espressione dei geni correlati a T3SS¹¹. Un'analisi dell'espressione di hrpL è stata precedentemente effettuata utilizzando una fusione trascrizionale localizzata dal cr...

Discussione

Il metodo qui presentato descrive una procedura non invasiva che consente l'infiltrazione di batteri nel tessuto fogliare vegetale, consentendo la rapida inoculazione di grandi volumi riducendo al minimo la distruzione del tessuto. Una delle caratteristiche del complesso di specie P. syringae è la capacità di sopravvivere e proliferare all'interno dell'apoplast della pianta e sulla superficie della pianta come epifita¹⁴. Pertanto, non si può escludere la possibilità che i batteri estr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.17 mm coverslip			No special requirements
1.6 x 1.6 mm metal mesh	Buzifu		Fiberglass screen mesh
10 cm diameter pots			No special requirements
140 mm Petri dishes			No special requirements
20 mL syringe			No special requirements
50 mL conical tubes	Sarstedt
Agarose	Merk
Ampicillin sodium	GoldBio
Bacteriological agar	Roko
Confocal Microscope Stellaris	Leica Microsystems
FACSVerse cell analyzer	BD Biosciences
Fiji software
Gentamycin sulfate	Duchefa	G-0124
Kanamycin monosulfate	Phytotechnology	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging
Plant substrate			No special requirements
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Toothpicks			No special requirements
Tryptone	Merk
Tweezers			No special requirements
Vacuum chamber 25 cm diameter	Kartell	554
Vacuum pump	GAST	DOA-P504-BN
Vermiculite			No special requirements
Yeast Extract	Merk