植物組織における シュードモナス・シリンガエ 遺伝子発現の単一細胞解析

要約

本プロトコルは、植物アポプラスト内で増殖した シュードモナス・シリンガエ 集団の単一細胞遺伝子発現解析を可能にする方法を記載する。

要約

多数の病原性微生物が絶えず植物を攻撃しています。 シュードモナス・シリンガエ 種複合体は、多数の宿主に特に関連するグラム陰性植物病原性細菌を包含する。 P. syringae は葉の表面から植物に入り、アポプラスト内で急速に増殖し、細胞間空間を占める微小コロニーを形成します。細菌による蛍光タンパク質の構成的発現は、微小コロニーの可視化および顕微鏡レベルでの感染の発生のモニタリングを可能にする。シングルセル解析の最近の進歩により、クローン同質遺伝子細菌集団が到達する大きな複雑さが明らかになりました。表現型の不均一性と呼ばれるこの複雑さは、細菌群集間の遺伝子発現の細胞間の違い(遺伝的差異とは関連していない)の結果です。個々の遺伝子座の発現を単一細胞レベルで解析するために、蛍光タンパク質への転写融合が広く用いられている。植物アポプラストのコロニー形成中に発生するようなストレス条件下では、 P. syringae は、主要な病原性遺伝子(すなわち、HrpタイプIII分泌系)の不均一な発現に基づいて、異なる亜集団に分化します。しかし、植物組織から回収された P. syringae 集団の単一細胞分析は、接種および細菌抽出プロセスに固有の機械的破壊中に放出される細胞破片のために困難です。本報告では、シロイヌナズナとマメのコロニー形成中に関心のある P. syringae 遺伝子の発現を単一細胞レベルでモニタリングするために開発された方法について詳述する。真空チャンバーを用いた接種に使用される植物および細菌懸濁液の調製について説明する。アポプラスチック流体抽出による感染葉からの内生細菌の回収についてもここで説明します。細菌接種法と細菌抽出法の両方が、植物および細菌細胞の損傷を最小限に抑えるように経験的に最適化されているため、顕微鏡検査およびフローサイトメトリー分析に最適な細菌調製物が得られます。

概要

病原性細菌は多様な表現型に違いを示し、遺伝的に同一の集団内に亜集団の形成を引き起こします。この現象は表現型不均一性として知られており、細菌と宿主の相互作用における適応戦略として提案されています¹。共焦点顕微鏡、フローサイトメトリー、マイクロフルイディクスの光学分解能の最近の進歩は、蛍光タンパク質と組み合わせて、細菌集団の単一細胞分析を促進しました²。

グラム陰性 シュードモナス・シリンガエ は、その学術的および経済的重要性の両方のために、典型的な植物病原菌です³。 P. syringae の生活環は水循環⁴と関連している。 P. syringae は、葉肉細胞間の細胞間空間に入り、植物の葉アポプラスト、気孔または創傷などの自然の開口部を通って^入る5。アポプラスト内に入ると、 P. syringae はIII型分泌系(T3SS)とIII型転座エフェクター(T3E)に依存して植物の免疫を抑制し、病原体の利益のために植物の細胞機能を操作します⁶。T3SSおよびT3Eの発現は、標的遺伝子のプロモーター領域における hrp-box モチーフに結合する代替シグマ因子であるマスターレギュレーターHrpLに依存する⁷。

染色体に位置する転写融合を目的の遺伝子の下流にある蛍光タンパク質遺伝子に生成することにより、単一細胞レベルで放出される蛍光レベルに基づいて遺伝子発現をモニターすることができます⁸。この方法を使用すると、hrpLの発現は、実験室で増殖した細菌培養物内および植物アポプラストから回収された細菌集団内の両方で不均一であることが確立されました^8,9。単一細胞レベルでの遺伝子発現解析は、通常、実験室培地で増殖した細菌培養物で行われますが、このような解析は、植物内で増殖する細菌集団に対しても実施できるため、自然界での亜集団の形成に関する貴重な情報が得られます。植物から抽出された細菌集団の分析の潜在的な制限は、アポプラストへの注射器圧浸潤による古典的な接種方法、それに続く葉組織の浸軟による細菌抽出が、典型的には、下流の分析を妨げる大量の細胞植物残渣を生成する^{ことである10}。ほとんどの細胞破片は、GFP蛍光と重なる葉緑体の自己蛍光断片で構成されており、誤解を招く結果をもたらします。

本プロトコルは、2つのモデル病理系における単一細胞遺伝子発現不均一性を分析するプロセスを記載している: P. syringae pvによって形成されるもの。トマト株DC3000と シロイヌナズ ナ(Col-0)、その他は P. syringae pvによる。ファセオリコラ株1448Aおよび豆植物(フェイセオラス・ブルガリス 品種カナディアンワンダー)。真空チャンバーとポンプを用いた真空浸透に基づく接種方法を提案し、葉全体を迅速かつダメージフリーに浸透させる方法を提供します。さらに、従来のプロトコルの改善として、注射器内の少量の容量を使用して正負の圧力のサイクルを適用することによるアポプラストの抽出に基づいて、組織破壊を大幅に減少させるより穏やかな方法を使用して、組織破壊を大幅に減少させます。

プロトコル

1.植物の準備

1. 以下の手順に従ってシロイヌナズナCol-0植物を準備します。
   1. 直径10 cmのポットに、事前に水をやった1:3のバーミキュライトと植物の基質混合物( 材料の表を参照)を入れ、ポットを1.6 mm x 1.6 mmの穴のある15 cm x 15 cmの金属メッシュで覆います。輪ゴムを使用して、金属メッシュを湿った土に調整します(図1A)。
   2. 濡れたつまようじで、シロイヌナズナの種を金属メッシュの穴にまきます。ポット内の離れた位置に3〜4個の種子を置きます(図1B、C)。
   3. ポットをプラスチックドームで覆い、相対湿度を高く保ち、成層のために4°Cで72時間インキュベートします。
      注:成層化(説明されているように、高湿度および低温でのインキュベーション)は、種子の発芽率と同期を改善します。
   4. 短日条件(21°Cで8時間明/16時間暗、光強度:100μmol・m−²・s⁻¹、相対湿度:70%)で鉢を植物成長室に移します。
   5. 種子の発芽後(8〜10日)、ピンセットを使用してほとんどの苗を取り除き、ポットの各位置に1本の苗(6本の苗/ポット)を保持します(図1D)。プラスチック製のドームを取り外して、ポットのカバーを外します。
      注:植物は発芽後4〜5週間で使用できるようになります。
2. Phaseolus vulgaris bean(品種カナディアンワンダー)植物を準備します。
   1. ペトリ皿の底を濡れたタオル紙で覆い、その上に豆の種を置きます。シャーレをサージカルテープで密封し、28°Cで3〜4日間インキュベートします(図2A)。
   2. 発芽した種子を、湿った1:3バーミキュライト-植物基質混合物で満たされた直径10cmのポットに移します。
   3. 植物成長チャンバーで、長日設定(23°Cで16時間明/ 8時間暗、光強度:100 μmol・m⁻²・s⁻¹、相対湿度:70%)でインキュベートします。
      注:植物は発芽後10日で使用できるようになります(図2B)。

2. シロイヌナズナと豆類の接種

注:この研究では、株 P.シリンガエ pv。トマトDC3000と P.シリンガエ PV。フェイソリコラ1448Aを用いた。

1. P.シリンガエ接種材料を準備します。
   1. 目的の P. syringae 株を-80°CのグリセロールストックからLBプレート(10 g / Lトリプトン、5 g / L NaCl、5 g / L酵母エキス、および16 g / L細菌寒天培地、材料 表を参照)にストリークします。28°Cで40〜48時間インキュベートします。
      注:目的の株がプラスミドまたはゲノム耐性遺伝子を持っている場合は、抗生物質の使用をお勧めします。 P. syringae の推奨抗生物質濃度は次のとおりです:カナマイシン(15 μg / mL)、ゲンタマイシン(10 μg / mL)、アンピシリン(300 μg / mL)( 材料の表を参照)。.
   2. 細菌バイオマスを掻き取り、5 mLの10 mM MgCl₂に再懸濁します。OD_{600を測定し、10} mM MgCl₂を加えて0.1に調整します。
      注:P. syringae培養物のOD₆₀₀ 0.1は、5 x 10⁷ CFU·mL⁻¹に相当します。
   3. 10 mM MgCl₂に段階希釈を行い、最終接種材料濃度5 x 10⁵ CFU·mL⁻¹に到達します。シロイヌナズナ植物用に200 mL、豆植物用に50 mLの接種材料を準備します。
   4. 接種直前に、界面活性剤Silwett L-77( 材料表参照)を、豆接種の場合は0.02%、シロイヌナズナの場合は0.01%の最終濃度に添加します。シルウェットはシロイヌナズナ組織にやや有害であることに注意してください。
2. 真空浸透を行います。
   1. シロイヌナズナの浸潤には、X字を形成する2本の木の棒をポットの上に置き(図1E)、200 mLの接種材料が入った直径14 cmのシャーレの上にポットを下向きに置きます(図1F)。
   2. 豆の葉を接種する場合は、接種材料を含む50 mLの円錐形遠沈管に葉を導入します(図2C)。
   3. 接種材料溶液に浸した植物を真空チャンバーに挿入し(図1G および 図2D)、500 mbarのパルスを30秒間与えて葉に浸透させます。葉が完全に浸透するまで、真空パルスを2〜3回繰り返します(図1H および 図2E)。
   4. 一枚の紙で余分な接種材料を排出し、植物を対応する成長室に戻します。

3.アポプラストからの細菌の抽出

1. 接種から4日後、シロイヌナズナの地上部または接種した豆の葉を切り取り、針のない20mLシリンジに入れます(図2G)。豆の葉の場合は、 図2Fに示すように、葉をそれ自体に転がし、軸方向の面を外側に残します。
2. 組織を覆うのに十分な量の蒸留水を追加します(通常10〜15 mL)。
3. プランジャーを挿入し、シリンジを垂直にして先端を上に向けて、すべての空気が先端近くになるまでバレルを軽くたたいて、シリンジ内の余分な空気と気泡を取り除きます。次にプランジャーをスライドさせて空気を取り除きます。シリンジ内の空気ができるだけ少なくなったら、シリンジバレルの先端をパラフィンフィルムで覆います。
4. プランジャーを慎重に押して、組織が暗くなるまで陽圧を発生させます(図1I および 図2H)。次に、プランジャーを引いて負圧を発生させます(図1J および 図2I)。この手順を3〜5回繰り返します。
5. パラフィンフィルムとプランジャーをはがし、 図2Jのようにアポプラスト抽出菌を含む液を採取する。

4. アポプラスト抽出細菌の1細胞解析

1. 以下の手順に従って、共焦点顕微鏡で視覚化します。
   1. 蒸留水中の1.5%アガロース溶液を調製します。溶けたら、並べて置いた2枚の顕微鏡スライドの間のスペースを埋めるのに十分な量を加え、その上に別のスライドを置きます(図3)。それらを15分間乾燥させ、上部に置かれたスライドを慎重に取り外します。刃を使用して、使用直前にアガロースパッドを5 mm x 5 mmにカットします。
   2. 並行して、アポプラスト抽出菌1 mLを室温で12,000 x g で1分間遠心分離し、ピペットで上清を注意深く除去し、ペレットを20 μLの水に再懸濁して細胞を濃縮します。濃縮細胞2 μL滴を0.17 mmのカバーガラスに置き、 図3に示すように、ステップ1で入手した5 mm x 5 mmのアガロースパッドで滴を覆います。
   3. 共焦点顕微鏡で細菌製剤を視覚化します( 材料の表を参照)。緑色蛍光細菌を同定するには、488 nmの励起レーザーと500 nmから550 nmの範囲の発光フィルターを使用します。すべての細菌を識別するには、明視野を使用して両方のフィールドをマージします。
   4. フィジーを使用して共焦点画像を処理します( 材料表を参照)。これを行うには、MicrobeJプラグインを使用して細菌細胞の輪郭を特定し、その中の蛍光強度を測定します。
      注:この分析には、単離された細菌(クラスター化されていない)からの画像取得をお勧めします。
2. フローサイトメトリーによる解析を行います。
   1. アポプラストで抽出した細菌懸濁液のアリコートを取り、フローサイトメーターを使用して分析します。イベント100,000を獲得する。
   2. 細菌と植物の破片を区別するために、接種されていない植物から抽出されたアポプラストを分析し、その前方散乱(FSC)細胞サイズと側方散乱(SSC)細胞サイズを示すドットプロットをアポプラスト抽出細菌懸濁液の細胞サイズと比較します。非蛍光性細菌の同定には、非蛍光同質細菌を接種した植物から抽出したアポプラストを用いて、それらの蛍光発光を比較します。

結果

III型分泌系の発現は、植物内での細菌増殖に不可欠です。T3SS遺伝子のタイムリーな発現は複雑な調節によって達成され、その中心にはT3SS関連遺伝子の発現の重要な活性化因子である細胞質外機能(ECF)シグマ因子HrpLがあります¹¹。hrpLの発現の分析は、染色体に位置する下流のプロモーターレスgfp遺伝子への転写融合を使用して、共焦点顕微鏡およびフローサイ?...

ディスカッション

ここで提示する方法は、植物の葉面組織への細菌の浸潤を可能にし、組織の破壊を最小限に抑えながら大量の迅速な接種を可能にする非侵襲的手順を説明しています。 P. syringae 種複合体の特徴の1つは、着生植物として植物のアポプラストの内部および植物表面で生き残り増殖する能力です¹⁴。したがって、本プロトコルを使用して抽出された細菌が植物のアポプラス...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.17 mm coverslip			No special requirements
1.6 x 1.6 mm metal mesh	Buzifu		Fiberglass screen mesh
10 cm diameter pots			No special requirements
140 mm Petri dishes			No special requirements
20 mL syringe			No special requirements
50 mL conical tubes	Sarstedt
Agarose	Merk
Ampicillin sodium	GoldBio
Bacteriological agar	Roko
Confocal Microscope Stellaris	Leica Microsystems
FACSVerse cell analyzer	BD Biosciences
Fiji software
Gentamycin sulfate	Duchefa	G-0124
Kanamycin monosulfate	Phytotechnology	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging
Plant substrate			No special requirements
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Toothpicks			No special requirements
Tryptone	Merk
Tweezers			No special requirements
Vacuum chamber 25 cm diameter	Kartell	554
Vacuum pump	GAST	DOA-P504-BN
Vermiculite			No special requirements
Yeast Extract	Merk