Analyse unicellulaire de l’expression des gènes de Pseudomonas syringae dans le tissu végétal

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode qui permet l’analyse de l’expression génique unicellulaire sur des populations de Pseudomonas syringae cultivées dans l’apoplaste végétal.

Résumé

Une pléthore de micro-organismes pathogènes attaquent constamment les plantes. Le complexe d’espèces Pseudomonas syringae englobe des bactéries phytopathogènes à Gram négatif d’une importance particulière pour un grand nombre d’hôtes. P. syringae pénètre dans la plante par la surface des feuilles et se multiplie rapidement dans l’apoplaste, formant des microcolonies qui occupent l’espace intercellulaire. L’expression constitutive des protéines fluorescentes par les bactéries permet de visualiser les microcolonies et de suivre le développement de l’infection au niveau microscopique. Les progrès récents dans l’analyse unicellulaire ont révélé la grande complexité atteinte par les populations bactériennes isogéniques clonales. Cette complexité, appelée hétérogénéité phénotypique, est la conséquence de différences intercellulaires dans l’expression des gènes (non liées aux différences génétiques) au sein de la communauté bactérienne. Pour analyser l’expression des loci individuels au niveau unicellulaire, les fusions transcriptionnelles avec des protéines fluorescentes ont été largement utilisées. Dans des conditions de stress, comme celles qui se produisent lors de la colonisation de l’apoplaste végétal, P. syringae se différencie en sous-populations distinctes en fonction de l’expression hétérogène de gènes clés de virulence (c.-à-d. le système de sécrétion Hrp de type III). Cependant, l’analyse unicellulaire d’une population donnée de P. syringae récupérée à partir de tissus végétaux est difficile en raison des débris cellulaires libérés lors de la perturbation mécanique intrinsèque aux processus d’inoculation et d’extraction bactérienne. Le présent rapport décrit en détail une méthode mise au point pour surveiller l’expression des gènes d’intérêt de P. syringae au niveau unicellulaire pendant la colonisation d’Arabidopsis et de haricots. La préparation des plantes et les suspensions bactériennes utilisées pour l’inoculation à l’aide d’une chambre à vide sont décrites. La récupération des bactéries endophytes à partir de feuilles infectées par extraction de liquide apoplastique est également expliquée ici. Les méthodes d’inoculation bactérienne et d’extraction bactérienne sont optimisées empiriquement pour minimiser les dommages aux cellules végétales et bactériennes, ce qui donne des préparations bactériennes optimales pour la microscopie et l’analyse par cytométrie en flux.

Introduction

Les bactéries pathogènes présentent des différences dans divers phénotypes, ce qui donne lieu à la formation de sous-populations au sein de populations génétiquement identiques. Ce phénomène est connu sous le nom d’hétérogénéité phénotypique et a été proposé comme stratégie d’adaptation lors des interactions bactérien-hôte¹. Les progrès récents dans la résolution optique des microscopes confocaux, la cytométrie en flux et la microfluidique, combinés aux protéines fluorescentes, ont favorisé les analyses unicellulaires des populations bactériennes².

La Pseudomonas syringae à Gram négatif est une bactérie phytopathogène archétypale en raison de son importance académique et économique³. Le cycle de vie de P. syringae est lié au cycle de l’eau⁴. P. syringae pénètre dans les espaces intercellulaires entre les cellules mésophylles, l’apoplaste foliaire de la plante, par des ouvertures naturelles telles que les stomates ou les plaies⁵. Une fois dans l’apoplaste, P. syringae s’appuie sur le système de sécrétion de type III (T3SS) et les effecteurs transloqués de type III (T3E) pour supprimer l’immunité des plantes et manipuler les fonctions cellulaires des plantes au profit de l’agent pathogène⁶. L’expression de T3SS et T3E dépend du régulateur maître HrpL, un facteur sigma alternatif qui se lie aux motifs hrp-box dans la région promotrice des gènes cibles⁷.

En générant des fusions transcriptionnelles situées sur les chromosomes vers des gènes de protéines fluorescentes en aval du gène d’intérêt, on peut surveiller l’expression des gènes en fonction des niveaux de fluorescence émis au niveau^{unicellulaire 8}. En utilisant cette méthode, il a été établi que l’expression de hrpL est hétérogène tant au sein des cultures bactériennes cultivées en laboratoire qu’au sein des populations bactériennes récupérées de la plante apoplast ^8,9. Bien que l’analyse de l’expression génique au niveau d’une seule cellule soit généralement effectuée dans des cultures bactériennes cultivées dans des milieux de laboratoire, de telles analyses peuvent également être effectuées sur des populations bactériennes qui se développent dans la plante, fournissant ainsi des informations précieuses sur la formation de sous-populations dans le contexte naturel. Une limitation potentielle pour l’analyse des populations bactériennes extraites de la plante est que les méthodes classiques d’inoculation par infiltration sous pression de seringue dans l’apapoplaste, suivie d’une extraction bactérienne par macération du tissu foliaire, génèrent généralement une grande quantité de débris cellulaires végétaux qui interfèrent avec l’analyse en aval¹⁰. La plupart des débris cellulaires sont constitués de fragments autofluorescents de chloroplastes qui chevauchent la fluorescence GFP, ce qui entraîne des résultats trompeurs.

Le présent protocole décrit le processus d’analyse de l’hétérogénéité de l’expression génique unicellulaire dans deux pathosystèmes modèles: celui formé par le P. syringae pv. souche de tomate DC3000 et Arabidopsis thaliana (Col-0), et l’autre par P. syringae pv. phaseolicola souche 1448A et plants de haricots (cultivar Phaseolus vulgaris Canadian Wonder). Une méthode d’inoculation est proposée basée sur l’infiltration sous vide à l’aide d’une chambre à vide et d’une pompe, ce qui permet d’obtenir une méthode rapide et sans dommage pour infiltrer les feuilles entières. En outre, comme amélioration par rapport aux protocoles conventionnels, une méthode plus douce est utilisée pour extraire la population bactérienne de l’apoplaste qui réduit considérablement la perturbation tissulaire, basée sur l’extraction du liquide apoplastique en appliquant des cycles de pression positive et négative en utilisant une petite quantité de volume dans une seringue.

Protocole

1. Préparation des plantes

1. Préparez les plantes d’Arabidopsis Col-0 en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Remplissez un pot de 10 cm de diamètre avec un mélange de substrat vermiculite-plante de 1:3 (voir le tableau des matières), préalablement arrosé, et couvrez le pot d’un treillis métallique de 15 cm x 15 cm avec des trous de 1,6 mm x 1,6 mm. Ajustez le treillis métallique au sol humide à l’aide d’un élastique (figure 1A).
   2. Avec un cure-dent humide, semez les graines d’Arabidopsis dans les trous du treillis métallique. Placez trois à quatre graines à distance dans le pot (Figure 1B, C).
   3. Couvrir les pots d’un dôme en plastique pour maintenir une humidité relative élevée et les incuber pendant 72 h à 4 °C pour la stratification.
      NOTE: La stratification (incubation à haute humidité et basse température, comme décrit) améliore le taux de germination et la synchronie des graines.
   4. Transférer les pots dans une chambre de croissance des plantes dans des conditions de journées courtes (8 h de lumière/16 h d’obscurité à 21 °C, intensité lumineuse : 100 μmol·m−²·s⁻¹, humidité relative : 70%).
   5. Après la germination des graines (8-10 jours), utilisez la pince à épiler pour enlever la plupart des plants, en gardant un plant dans chacune des positions du pot (six plants/pot) (Figure 1D). Retirez le dôme en plastique pour découvrir les pots.
      REMARQUE: Les plantes seront prêtes à être utilisées 4-5 semaines après la germination.
2. Préparer des plants de haricots Phaseolus vulgaris (cultivar Canadian Wonder).
   1. Couvrez le fond d’une boîte de Petri avec un morceau de papier serviette humide et placez les graines de haricots dessus. Sceller la boîte de Petri avec du ruban chirurgical et incuber à 28 °C pendant 3-4 jours (Figure 2A).
   2. Transférer les graines germées dans un pot de 10 cm de diamètre rempli d’un mélange humide de substrat vermiculite 1:3.
   3. Incuber dans une chambre de croissance des plantes pendant de longues journées (16 h de lumière/8 h d’obscurité à 23 °C, intensité lumineuse : 100 μmol·m−²·s⁻¹, humidité relative : 70 %).
      REMARQUE : Les plantes seront prêtes à l’emploi 10 jours après la germination (figure 2B).

2. Inoculation d’Arabidopsis et de plants de haricots

NOTE: Dans cette étude, les souches P. syringae pv. tomate DC3000 et P. syringae pv. phaseolicola 1448A ont été utilisés.

1. Préparer l’inoculum de P. syringae.
   1. Étaler la souche d’intérêt de P. syringae à partir d’un stock de glycérol de -80 °C sur une plaque de LB (10 g/L de tryptone, 5 g/L de NaCl, 5 g/L d’extrait de levure et 16 g/L de gélose bactériologique, voir le tableau des matières) complétée par les antibiotiques appropriés. Incuber à 28 °C pendant 40-48 h.
      REMARQUE : L’utilisation d’antibiotiques est recommandée si la souche d’intérêt porte un plasmide ou un gène de résistance génomique. Les concentrations d’antibiotiques recommandées pour P. syringae sont les suivantes : kanamycine (15 μg/mL), gentamycine (10 μg/mL), ampicilline (300 μg/mL) (voir le tableau des matières).
   2. Gratter la biomasse bactérienne et remettre en suspension dans 5 mL de 10 mM de MgCl₂. Mesurer le DO₆₀₀ et ajuster à 0,1 en ajoutant 10 mM MgCl₂.
      NOTE: Une DO₆₀₀ de 0,1 d’une culture de P. syringae correspond à 5 x 10⁷ UFC·mL⁻¹.
   3. Effectuer des dilutions en série dans 10 mM de MgCl₂ pour atteindre une concentration finale d’inoculum de 5 x 10^{5 UFC-1}. Préparer 200 mL d’inoculum pour les plants d’Arabidopsis et 50 mL pour les plants de haricots.
   4. Juste avant l’inoculation, ajouter le surfactant Silwett L-77 (voir le tableau des matières) à une concentration finale de 0,02 % pour l’inoculation des haricots et de 0,01 % pour Arabidopsis. Notez que Silwett est quelque peu préjudiciable au tissu d’Arabidopsis.
2. Effectuer une infiltration de vide.
   1. Pour l’infiltration d’Arabidopsis, placer deux bâtons de bois formant un X sur le pot (figure 1E) et placer le pot face vers le bas sur une boîte de Petri de 14 cm de diamètre contenant l’inoculum de 200 ml (figure 1F).
   2. Pour l’inoculation des feuilles de haricot, introduire la feuille dans un tube à centrifuger conique de 50 ml contenant l’inoculum (figure 2C).
   3. Insérez les plantes immergées dans la solution d’inoculum dans une chambre à vide (Figure 1G et Figure 2D) et donnez une impulsion de 500 mbar pendant 30 s pour infiltrer les feuilles. Répétez l’impulsion de vide 2-3 fois jusqu’à ce que la feuille soit complètement infiltrée (Figure 1H et Figure 2E).
   4. Égoutter l’excès de solution d’inoculum avec un morceau de papier et remettre les plantes dans leur chambre de croissance correspondante.

3. Extraction des bactéries de l’apoplaste

1. Quatre jours après l’inoculation, couper la partie aérienne de la plante Arabidopsis ou la feuille inoculée du haricot et la placer dans une seringue de 20 ml sans aiguille (figure 2G). Pour les feuilles de haricot, rouler la feuille sur elle-même, en laissant la face abaxiale vers l’extérieur, comme illustré à la figure 2F.
2. Ajouter suffisamment d’eau distillée pour couvrir le tissu (habituellement 10-15 mL).
3. Insérez le piston et, avec la seringue en position verticale avec l’embout pointé vers le haut, retirez l’excès d’air et les bulles d’air à l’intérieur de la seringue en tapotant doucement le canon jusqu’à ce que tout l’air soit situé près de l’embout. Faites glisser ensuite le piston pour évacuer l’air. Une fois qu’il y a le moins d’air possible à l’intérieur de la seringue, couvrez l’extrémité du corps de la seringue avec un film de paraffine.
4. Appuyez délicatement sur le piston pour générer une pression positive jusqu’à ce que le tissu devienne plus foncé (Figure 1I et Figure 2H). Ensuite, tirez sur le piston pour générer une pression négative (Figure 1J et Figure 2I). Répétez cette étape 3 à 5 fois.
5. Retirez le film de paraffine et le piston et recueillez le liquide contenant les bactéries extraites de l’apoplaste, comme dans la figure 2J.

4. Analyse unicellulaire de la bactérie extraite de l’apoplaste

1. Visualisez par microscopie confocale en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Préparer une solution d’agarose à 1,5% dans de l’eau distillée. Une fois fondue, ajoutez suffisamment de volume pour remplir l’espace entre deux lames de microscopie placées côte à côte et placez une autre lame sur le dessus (Figure 3). Laissez-les sécher pendant 15 minutes et retirez délicatement la lame placée sur le dessus. À l’aide d’une lame, couper le tampon d’agarose en morceaux de 5 mm x 5 mm juste avant utilisation.
   2. Parallèlement, centrifuger 1 mL de bactéries extraites de l’apoplaste à 12 000 x g pendant 1 min à température ambiante, retirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension la pastille dans 20 μL d’eau pour concentrer les cellules. Déposer une goutte de 2 μL des cellules concentrées sur une lamelle de couverture de 0,17 mm et couvrir la goutte d’un morceau de 5 mm x 5 mm du tampon d’agarose préalablement obtenu à l’étape 1, comme le montre la figure 3.
   3. Visualisez la préparation bactérienne au microscope confocal (voir Tableau des matériaux). Pour identifier les bactéries fluorescentes vertes, utilisez le laser d’excitation à 488 nm et un filtre d’émission allant de 500 nm à 550 nm. Pour identifier toutes les bactéries, utilisez le champ lumineux et fusionnez les deux champs.
   4. Traiter les images confocales à l’aide de Fidji (voir le tableau des matériaux). Pour ce faire, utilisez le plugin MicrobeJ pour identifier le contour de la cellule bactérienne et mesurer l’intensité de fluorescence à l’intérieur.
      REMARQUE : L’acquisition d’images à partir de bactéries isolées (non groupées) est recommandée pour cette analyse.
2. Effectuer l’analyse par cytométrie de flux.
   1. Prenez une partie aliquote des suspensions de bactéries extraites d’apoplastes pour l’analyser à l’aide du cytomètre en flux. Acquérir 100 000 événements.
   2. Pour faire la distinction entre les bactéries et les débris végétaux, analysez l’apoplast extrait d’une plante non inoculée et comparez le diagramme à points montrant la taille de sa cellule de diffusion vers l’avant (FSC) par rapport à la taille de la cellule à diffusion latérale (SSC) avec celle de la suspension bactérienne extraite de l’apoplaste. Pour identifier les bactéries non fluorescentes, utilisez les apoplastes extraits des plantes inoculées avec des bactéries isogéniques non fluorescentes et comparez leurs émissions fluorescentes.

Résultats

L’expression du système de sécrétion de type III est essentielle à la croissance bactérienne au sein de la plante. L’expression opportune des gènes T3SS est obtenue grâce à une régulation complexe, au centre de laquelle se trouve le facteur sigma de la fonction extracytoplasmique (ECF) HrpL, l’activateur clé de l’expression des gènes liés à T3SS¹¹. Une analyse de l’expression de hrpL a été précédemment réalisée en utilisant une fusion transcriptionnelle situé...

Discussion

La méthode présentée ici décrit une procédure non invasive qui permet l’infiltration de bactéries dans le tissu foliaire de la plante, permettant l’inoculation rapide de grands volumes tout en minimisant la perturbation tissulaire. L’une des caractéristiques du complexe d’espèces P. syringae est sa capacité à survivre et à proliférer à l’intérieur de l’apoplaste de la plante et à la surface de la plante en tant qu’épiphyte¹⁴. Ainsi, la possibilité que les ba...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.17 mm coverslip			No special requirements
1.6 x 1.6 mm metal mesh	Buzifu		Fiberglass screen mesh
10 cm diameter pots			No special requirements
140 mm Petri dishes			No special requirements
20 mL syringe			No special requirements
50 mL conical tubes	Sarstedt
Agarose	Merk
Ampicillin sodium	GoldBio
Bacteriological agar	Roko
Confocal Microscope Stellaris	Leica Microsystems
FACSVerse cell analyzer	BD Biosciences
Fiji software
Gentamycin sulfate	Duchefa	G-0124
Kanamycin monosulfate	Phytotechnology	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging
Plant substrate			No special requirements
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Toothpicks			No special requirements
Tryptone	Merk
Tweezers			No special requirements
Vacuum chamber 25 cm diameter	Kartell	554
Vacuum pump	GAST	DOA-P504-BN
Vermiculite			No special requirements
Yeast Extract	Merk