طريقة تجانس سريعة وبسيطة وموحدة لإعداد مستحلبات المستضد / المستحلبات المساعدة لإحداث التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي

Summary

للحث على التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي ، وهو نموذج حيواني للتصلب المتعدد ، يتم تحصين الفئران بمستحلب ماء في زيت يحتوي على مستضد ذاتي ومساعد فرويند كامل. في حين توجد عدة بروتوكولات لإعداد هذه المستحلبات ، يتم تقديم بروتوكول تجانس سريع وبسيط وموحد لإعداد المستحلب هنا.

Abstract

يشترك التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) في ميزات مناعية وسريرية مماثلة مع التصلب المتعدد (MS) ، وبالتالي يستخدم على نطاق واسع كنموذج لتحديد أهداف دوائية جديدة لعلاج أفضل للمرضى. يتميز مرض التصلب العصبي المتعدد بعدة دورات مرضية مختلفة: التصلب العصبي المتعدد الانتكاسي (RRMS) ، والتصلب المتعدد التقدمي الأولي (PPMS) ، والتصلب المتعدد التدريجي الثانوي (SPMS) ، وشكل نادر من الانتكاس التدريجي (PRMS). على الرغم من أن النماذج الحيوانية لا تحاكي بدقة كل هذه الأنماط الظاهرية المتناقضة للأمراض البشرية ، إلا أن هناك نماذج EAE تعكس بعض المظاهر السريرية المختلفة لمرض التصلب العصبي المتعدد. على سبيل المثال ، يحاكي البروتين السكري قليل التغصن الميالين (MOG) الذي يسببه EAE في الفئران C57BL / 6J PPMS البشري ، بينما يشبه بروتين المايلين البروتيني (PLP) الذي يسببه EAE في الفئران SJL / J RRMS. كما تستخدم المستضدات الذاتية الأخرى ، مثل بروتين المايلين الأساسي (MBP) ، وعدد من سلالات الفئران المختلفة لدراسة EAE. للحث على المرض في نماذج EAE للتحصين الذاتي ، يتم تحضير مستحلب الماء في الزيت وحقنه تحت الجلد. تتطلب غالبية نماذج EAE أيضا حقن سم السعال الديكي حتى يتطور المرض. من أجل تحريض EAE المتسق والقابل للتكرار ، من الضروري وجود بروتوكول مفصل لإعداد الكواشف لإنتاج مستحلب مستضد / مساعد. تستفيد الطريقة الموضحة هنا من طريقة موحدة لتوليد مستحلبات الماء في الزيت. إنه بسيط وسريع ويستخدم مجانس اهتزاز بدلا من المحاقن لإعداد مستحلبات يتم التحكم في جودتها.

Introduction

يمكن أن يؤدي انهيار التسامح المناعي إلى توليد اضطرابات المناعة الذاتية ، مثل التصلب المتعدد (MS). تشير التقديرات إلى أن 2.8 مليون شخص يعيشون مع مرض التصلب العصبي المتعدد في جميع أنحاء العالم¹. على الرغم من أن السبب الدقيق لمرض التصلب العصبي المتعدد لا يزال غير معروف إلى حد كبير ، إلا أن عدم تنظيم الخلايا التائية والبائية ذاتية التفاعل ، بالإضافة إلى العيوب في وظيفة Treg ، تلعب أدوارا مهمة في التسبب في المرض ^2,3.

النماذج الحيوانية لأمراض المناعة الذاتية هي أدوات أساسية للتحقيق في الطرائق العلاجية المحتملة. تم استخدام نموذج التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) منذ ما يقرب من قرن من قبل الباحثين المهتمين ب MS⁴. في التجارب المبكرة ، كان معدل الإصابة بالمرض منخفضا نسبيا. مكن إدخال مساعد فرويند الكامل (CFA) ، الذي يحتوي على المتفطرة وسم السعال الديكي ، من الحث المستمر ل EAE في الفئران⁴. الأهم من ذلك ، من الضروري خلط CFA مع مستضد خاص بالجهاز العصبي المركزي (CNS) لتوليد مستحلب متجانس من الماء في الزيت لتحفيز EAE. تعتمد نماذج EAE الأكثر شيوعا المتاحة حاليا على التحصين النشط للفئران بالببتيدات الدماغية. تلعب الخلفية الوراثية للفئران دورا مهما في القابلية للإصابة بالأمراض ، مع بروتين سكري المايلين قليل التغصن (MOG_35-55) وبروتين المايلين البروتيني (PLP_139-151) الببتيدات المستخدمة للحث على EAE في الفئران C57BL / 6J و SJL ، على التوالي⁵. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام سلالات الفئران الأخرى والببتيدات المشتقة من الجهاز العصبي المركزي.

تعد جودة مستحلب CFA / الببتيد عاملا حاسما يحدد اختراق المرض في نموذج EAE^{للتحصين النشط 6}. يجب تحضير مستحلب متجانس من الماء في الزيت عن طريق خلط الببتيدات الدماغية المذابة في محلول مائي مع CFA ، وإلا فلن تصاب الحيوانات بالمرض. تم نشر العديد من البروتوكولات حول تحضير مستحلبات CFA / الببتيد. ومن الأمثلة على ذلك استخدام دوامة⁷ ، صوتنة⁸ ، محاقن وموصل T^{ثلاثي الاتجاهات 9} ، أو حقنة واحدة فقط⁵. ومع ذلك ، يصعب توحيد كل هذه الطرق وغالبا ما ترتبط ببروتوكولات طويلة ومعقدة.

بالمقارنة مع جميع الطرق المذكورة أعلاه ، فإن الطريقة البسيطة الموضحة هنا لإعداد المستحلب توفر مزايا عدم وجود اختلافات من شخص لآخر وكونها سريعة نسبيا. يتم إنشاء المستحلب بواسطة خالط يهز الكواشف بسرعة ووقت ودرجة حرارة محددة ، مما يضمن نتائج سريعة ومتسقة. بالإضافة إلى تحريض المرض في نموذج EAE ، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لدراسة نماذج أمراض المناعة الذاتية الأخرى مثل التهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين (CIA) والتهاب المفاصل الناجم عن المستضد (AIA)⁶. لذلك ، من المتوقع أن يتم استخدام هذه الطريقة للحث باستمرار على المرض في النماذج الحيوانية الأخرى التي تعتمد على مستحلبات الماء في الزيت مع المستضدات الذاتية ، مثل التهاب العصب المناعي الذاتي التجريبي (EAN)¹⁰ ، والتهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي التجريبي (EAT)11 ، والتهاب القزحية المناعي الذاتي (EAU)12 ، والوهن العضلي الوبيل (MG)¹³. تحفز هذه الطريقة أيضا استجابات مناعية عامة مثل فرط الحساسية من النوع المتأخر (DTH) باستمرار⁶ ، وبالتالي يمكن استخدامها لتوصيل لقاحات السرطان والملاريا (انظر المناقشة).

وبالتالي ، تم تطوير طريقة سريعة (إجمالي وقت التحضير ~ 30 دقيقة) ، بسيطة (يمكن تحضير جميع الكواشف مسبقا وتخزينها) ، وموحدة (يتم إنجاز المستحلب باستخدام خالط الاهتزاز) ويتم تقديمها هنا. مستحلبات CFA / المستضد المحضرة باستخدام هذا البروتوكول تحفز باستمرار المرض في نماذج المناعة الذاتية.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لممارسات المجلس السويدي للبحوث الحيوانية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان ، لوند مالمو ، السويد (رقم التصريح: M126-16).

ملاحظة: يتم وصف التدفق التخطيطي للطريقة في الشكل 1.

1. إعداد المواد

ملاحظة: تحضير جميع الكواشف معقمة في غطاء معقم ، والقسمة وتخزينها في درجة الحرارة المشار إليها. يمكن تخزين الكواشف لمدة تصل إلى 2 سنوات دون أن تفقد تأثيرها.

1. تحضير CFA يحتوي على 20 ملغ / مل المتفطرة السلية كما هو موضح أدناه.
   1. أضف 100 ملغ من M. tuberculosis H37RA المجفف بالتجميد (انظر جدول المواد) وخمس خرزات فولاذية 3.2 مم إلى أنبوب سعة 7 مل (انظر جدول المواد). رج الأنبوب في الخالط (انظر جدول المواد) لمدة 60 ثانية بأعلى إعداد للسرعة (5000 دورة في الدقيقة).
   2. أضف 5 مل من مساعد فرويند غير المكتمل (IFA) إلى الأنبوب ورجه مرة أخرى لمدة 60 ثانية بأعلى سرعة. انقل ملاط المتفطرة السلية المتجانسة في IFA (المسمى الآن CFA) إلى أنبوب جديد به ماصة ، تاركا الخرز خلفه ، واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
2. أضف الماء عالي النقاء إلى المسحوق المجفف بالتجميد من ببتيد MOG_35-55 (انظر جدول المواد) للحصول على تركيز ببتيد نهائي يبلغ 10 مجم / مل. تعقيم الحل عن طريق تمريره من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. تحضير 60 ميكرولتر من القسمة وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
   ملاحظة: الببتيد MOG_35-55 المستخدم في هذه التجربة هو من نقاء ImmunoGrade (~ 70٪) ، وهو مشقوق TFA ، ويذوب بسهولة في الماء ، ويحتوي على أميد C-terminal (-NH₂) لزيادة استقرار الجسم الحي ¹⁴. لم يتم إذابة حصص الببتيد وإعادة تجميدها أكثر من مرتين ، وتم تخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3. تحضير 100 مل من المخزن المؤقت لسموم السعال الديكي: قم بإذابة 2.9 جم من كلوريد الصوديوم في 80 مل من 1x Ca^{2 + /} Mg²⁺ PBS المجاني وأضف 100 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100. اضبط مستوى الصوت على 100 مل باستخدام PBS وقم بتعقيم المحلول عن طريق تمريره عبر مرشح 0.2 ميكرومتر. تحضير 10 مل من القسمة وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

2. إعداد مستحلبات CFA / الببتيد

1. حساب كمية المستحلب اللازمة للتحصين. في هذا البروتوكول القياسي ، يتلقى كل فأر 50 ميكروغرام من الببتيد MOG_{35-55 و 300} ميكروغرام من M. السل المنتشر في مساعد فرويند (CFA). يمكن حساب كمية كل كاشف (MOG_35-55 الببتيد ، PBS ، CFA ، و IFA) المطلوبة لإعداد المستحلبات باستخدام الملف التكميلي 1. يتم تضمين 20 ٪ إضافية من جميع الكواشف ، للتعويض عن فقدان صغير من المستحلب ، في الحساب.
   ملاحظة: تتكون مجموعة المستحلب التجاري (انظر جدول المواد) المستخدمة في هذه الدراسة من أنبوب وغطاء لولبي ومكبس في كيس معقم. يحتوي كل أنبوب من مجموعة المستحلب على 9.6 مل كحد أقصى ، مما يجعل من الممكن تحضير محاقن 8 × 1 مل كافية لتحصين 40 فأرا (أو 80 فأرا في حالة استخدام 100 ميكرولتر من المستحلب لكل).
2. ضع الأنبوب اللولبي المغطى (من مجموعة المستحلب التجاري) والكواشف لاستخدامها على الجليد.
3. أضف مكونات المستحلب بالترتيب التالي في وحدات التخزين المحسوبة في الخطوة 2.1: PBS ، ثم الببتيد ، ثم M. السل في CFA ، وأخيرا IFA.
4. أغلق الأنبوب بالغطاء بإحكام عن طريق شده وتخفيفه عدة مرات. هز الأنبوب بقوة لمدة 5-10 ثوان باليد لخلط الكواشف مسبقا.
5. ضع الأنبوب في الخالط المهتز وقم بتثبيته بالقضيب. اضبط السرعة على أعلى إعداد والوقت على 60 ثانية. بمجرد الانتهاء من الجري ، ضع الأنبوب على الثلج لمدة 3 دقائق. كرر التشغيل مرة أو مرتين بنفس الإعدادات.
6. الطرد المركزي الأنبوب في 300 × ز لمدة 1 دقيقة لإزالة الهواء المحبوس وضغط المستحلب.
7. قم بإزالة الغطاء من الأنبوب ، وأدخل المكبس في الأنبوب ، وادفعه لأسفل ببطء حتى يصل إلى قمة المستحلب. قم بإزالة الإغلاق المفاجئ في الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق لفه.
8. قم بإزالة المكبس من حقنة الحقن (1 مل ؛ انظر جدول المواد). أضف إبرة (يفضل 25-27 جم) إلى حقنة الحقن.
9. قم بتوصيل الطرف الخلفي لحقنة الحقن بالقفل المخصص في الجزء السفلي من الأنبوب وقفله بلف قصير.
10. انقل المستحلب من الأنبوب إلى حقنة الحقن عن طريق دفع المكبس برفق. توقف عندما يصل المستحلب إلى تخريج 0.15 مل من حقنة الحقن.
11. افصل حقنة الحقن عن الأنبوب وأدخل المكبس بعناية ، مع الحرص على عدم دخول الهواء إلى المحقنة. ادفع المكبس حتى يخرج المستحلب من الإبرة.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن استخدام بعض المستحلب لمراقبة الجودة (انظر الخطوة 3).
12. كرر الخطوات 2.8-2.11 لبقية المستحلب الموجود في الأنبوب.
    ملاحظة: لتقليل إهدار مستحلبات CFA / المستضد باهظة الثمن ، يجب استخدام محاقن سعة 1 مل. يمكن استخدام محاقن أخرى تناسب القفل المخصص في أسفل الأنبوب ؛ ومع ذلك ، قد يلزم تحضير كمية أكبر من المستحلب. يمكن تخزين مستحلب الببتيد CFA / MOG_35-55 في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 15 أسبوعا دون أن يفقد قدرته على تحفيز EAE.

3. مراقبة جودة المستحلب

1. اختبار السقوط: أضف قطرة صغيرة من المستحلب إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل مملوء ب 20 مل من الماء البارد. أغلق الأنبوب ورجه باليد لبضع ثوان. يؤكد ظهور قطرات صغيرة مميزة تكوين مستحلب الماء في الزيت.
2. افحص المستحلب باستخدام مجهر تباين الطور.
   1. لتحليل حجم جزيئات الماء في الزيت ، أضف قطرة صغيرة (2-3 ميكرولتر) من المستحلب إلى شريحة مجهرية ، وقم بتلطيخها بزلة غطاء ، ثم ادفع بقوة في حركة دائرية لتسطيح المستحلب.
   2. افحص المستحلب الملطخ تحت مجهر تباين الطور (انظر جدول المواد) بتكبير 400x وركز على حقل به طبقة أحادية من المستحلب. تأكد من ظهور جزيئات رمادية / بيضاء موحدة صغيرة (الشكل 2 أ).
3. تحليل حجم جسيمات المستحلب باستخدام حيود الليزر.
   ملاحظة: يقيس حيود الليزر توزيعات حجم الجسيمات باستخدام شعاع الليزر. هذا هو اختبار مراقبة الجودة النهائي للمستحلبات. تظهر في الشكل 2B نتيجة تمثيلية لتوزيعات حجم الجسيمات باستخدام الطريقة الموضحة هنا (للحصول على وصف مفصل ، انظر Topping et ^al.6). ومع ذلك ، فإن اختبار السقوط وفحص المجهر كافيان للتحقق مما إذا كان قد تم تشكيل مستحلب مرض.
   1. اضبط مؤشرات الانكسار لكل من الليزر الأحمر والأزرق للمشتت (انظر جدول المواد) على 1.456 وللعينة على 1.33 على محلل حجم الجسيمات (انظر جدول المواد). اضبط امتصاص معامل الانكسار على 0.02.
   2. أضف قطرة واحدة من المحقنة التي تحتوي على مستحلب الببتيد إلى وحدة التشتت التي تحتوي على زيت معدني خفيف. ابدأ الحصول على البيانات على الفور بعد تشتت المستحلب.
      ملاحظة: تم تطبيق نموذج للأغراض العامة، وافترضت جسيمات كروية، لتقدير توزيع حجم الجسيمات.

4. تحريض EAE باستخدام مستحلب الببتيد MOG _35-55 في الفئران C57BL6 / J

ملاحظة: في جميع التجارب ، تم استخدام خمس فئران C57BL6 / J تبلغ من العمر 8-12 أسبوعا.

1. قبل التحصين ، قم بتخدير الفئران باستخدام 2.5٪ إيزوفلوران متبخر وتأكد باستخدام قرصة إصبع قدم ثابتة.
2. حقن كل فأر تحت الجلد باستخدام محاقن 1 مل في موقعين مختلفين ، على الجانبين الأيمن والأيسر من الجناح الخلفي مع 200 ميكرولتر من المستحلب الذي يحتوي على 50 ميكروغرام من الببتيد MOG_35-55 بنسبة 1: 1 (v / v) من الببتيد / CFA.
3. بعد 1.5 ساعة على الأقل من التحصين بالمستحلب ، ثم مرة أخرى بعد 24 ساعة ، قم بإدارة ما مجموعه 80 نانوغرام من توكسين السعال الديكي Bordetella في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لسموم السعال الديكي لكل فأر ، من خلال الحقن داخل الصفاق (100 ميكرولتر على اليسار و 100 ميكرولتر على الموقع الأيمن من البطن).
   ملاحظة: ثبت أن التوطين الدقيق للحقن داخل الصفاق مع توكسين السعال الديكي ضروري لتنشيط الخلايا التائية في العقدة الليمفاوية^{المستنزفة 15}.
4. اختياري: حقن الببتيد MOG_35-55 مرة أخرى في اليوم السابع (كما هو مستخدم في بعض البروتوكولات¹⁶) عن طريق تكرار الخطوة 4.2.
   ملاحظة: الأهم من ذلك ، تأكد من أن المحاقن والإبر المستخدمة في التحصين التي تحتوي على MOG / CFA أو سم السعال الديكي يتم التخلص منها بشكل كاف في أكياس / حاويات الخطر البيولوجي.
5. قم بتقييم النتيجة السريرية يوميا ، باستخدام مقياس من 0-6 كما هو موضح سابقا⁶.

النتائج

يوضح الشكل 1 البروتوكول السريع والبسيط والموحد لإعداد مستحلبات CFA / MOG. تم وصف هذه الطريقة مؤخرا في مكان آخر⁶. يمكن أيضا تحضير مستحلبات CFA / MOG بطرق أخرى ، مثل طريقة المحاقن التقليدية أو عن طريق الدوامة. تمت مقارنة هذه الطرق هنا من خلال تقييم جودة المستحلبات. أنتجت ?...

Discussion

تم استخدام مستحلبات الماء في الزيت ، مثل مستضد / مساعد فرويند ، لأكثر من نصف قرن للحث على EAE¹⁷. لا توجد حاليا طريقة موحدة لإعداد مستحلبات المستضد مستقلة عن التأثير البشري. يعد الخلط اليدوي باستخدام المحاقن أمرا قياسيا لمعظم المختبرات ، ولكن هذه الطريقة تستغرق وقتا طويلا ، وغالب?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Injection syringe	B. Braun	9166017V
1 mL Injection syringe	Sigma-Aldrich	Z683531
7 ml empty tubes with caps	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	7 mL tube
50 mL sterile centrifuge tube	Fisher Scientific	10788561	50 mL tube
Bordetella pertussis toxin	Sigma-Aldrich	P2980	Store at -20 °C
Dispersant, light mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Store at RT
Emulsion kit	Bertin-Instruments	D34200.10 ea	Containing a tube, cap, and plunger
Incomplete Freund's Adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Store at +4 °C
Mastersizer 2000	Malvern Panalytical	N/A	Particle size analyzer
Minilys-Personal homogenizer	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	Shaking homogenizer
MOG 35-55 Peptide	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	FDA-approved oil adjuvant
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm	Fisher Scientific	17124381	Sterlie filter
PBS, Ca2+/Mg2+ free	Thermo Fisher Scientific	14190144	PBS
Phase-Constrast Microscope	Olympus	BX40-B
Steel Beads 3.2 mm	Fisher Scientific	NC0445832	Autoclave and store at RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648463	Store at RT