Deneysel Otoimmün Ensefalomiyeliti İndüklemek için Antijen/Adjuvan Emülsiyonlar Hazırlamak için Hızlı, Basit ve Standartlaştırılmış Bir Homojenizasyon Yöntemi

Özet

Multipl sklerozun bir hayvan modeli olan deneysel otoimmün ensefalomiyeliti indüklemek için, fareler bir otoantijen ve Freund'un adjuvanını tamamlayan bir yağda su emülsiyonu ile bağışıklanır. Bu emülsiyonların hazırlanması için çeşitli protokoller mevcut olsa da, emülsiyon hazırlığı için hızlı, basit ve standartlaştırılmış bir homojenizasyon protokolü burada sunulmaktadır.

Özet

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), multipl skleroz (MS) ile benzer immünolojik ve klinik özellikleri paylaşır ve bu nedenle daha iyi hasta tedavisi için yeni ilaç hedeflerini belirlemek için bir model olarak yaygın olarak kullanılır. MS birkaç farklı hastalık seyri ile karakterizedir: relapsing-remitting MS (RRMS), primer progresif MS (PPMS), sekonder progresif MS (SPMS) ve nadir görülen progresif relaps MS formu (PRMS). Hayvan modelleri, bu zıt insan hastalığı fenotiplerinin tümünü doğru bir şekilde taklit etmese de, MS'in farklı klinik belirtilerinden bazılarını yansıtan EAE modelleri vardır. Örneğin, C57BL / 6J farelerinde miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) ile indüklenen EAE, insan PPMS'sini taklit ederken, SJL / J farelerde miyelin proteolipid proteini (PLP) ile indüklenen EAE, RRMS'ye benzer. Miyelin bazik proteini (MBP) ve bir dizi farklı fare suşu gibi diğer otoantijenler de EAE'yi incelemek için kullanılır. Bu otoantijen immünizasyonu EAE modellerinde hastalığı indüklemek için, bir yağda su emülsiyonu hazırlanır ve deri altından enjekte edilir. EAE modellerinin çoğu, hastalığın gelişmesi için boğmaca toksini enjeksiyonu gerektirir. Tutarlı ve tekrarlanabilir EAE indüksiyonu için, reaktifleri antijen / adjuvan emülsiyonları üretmeye hazırlamak için ayrıntılı bir protokol gereklidir. Burada açıklanan yöntem, yağda su emülsiyonları üretmek için standartlaştırılmış bir yöntemden yararlanır. Basit ve hızlıdır ve kalite kontrollü emülsiyonlar hazırlamak için şırıngalar yerine sallanan bir homojenizatör kullanır.

Giriş

İmmünolojik toleransın bozulması, multipl skleroz (MS) gibi otoimmün bozuklukların oluşmasına neden olabilir. Dünya çapında 2,8 milyon kişinin MS ile yaşadığı tahmin edilmektedir¹. MS'in kesin nedeni hala büyük ölçüde bilinmemekle birlikte, otoreaktif T ve B hücrelerinin düzensizliği ve Treg fonksiyonundaki defektler hastalığın patogenezinde önemli rol oynamaktadır ^2,3.

Otoimmün hastalıkların hayvan modelleri, potansiyel terapötik modaliteleri araştırmak için gerekli araçlardır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) modeli, MS⁴ ile ilgilenen araştırmacılar tarafından neredeyse bir asırdır kullanılmaktadır. İlk deneylerde, hastalığın insidansı nispeten düşüktü. Mycobacterium ve boğmaca toksini içeren tam Freund adjuvanının (CFA) tanıtılması, farelerde EAE'nin tutarlı bir şekilde indüklenmesini sağladı⁴. En önemlisi, EAE'yi indüklemek için homojen bir yağda su emülsiyonu oluşturmak için CFA'yı merkezi sinir sistemine (CNS) özgü bir antijenle karıştırmak gerekir. Şu anda mevcut olan en yaygın EAE modelleri, farelerin ensefalitojenik peptitlerle aktif bağışıklanmasına dayanmaktadır. Farelerin genetik arka planı, sırasıyla C57BL / 6J ve SJL farelerde EAE'yi indüklemek için kullanılan miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG_35-55) ve miyelin proteolipid proteini (PLP_139-151) peptidleri ile hastalık duyarlılığında önemli bir rol oynamaktadır⁵. Bununla birlikte, diğer fare suşları ve CNS türevi peptitler de kullanılabilir.

CFA / peptid emülsiyonunun kalitesi, aktif immünizasyon EAE model^6'da hastalık penetransını belirleyen kritik bir faktördür. Sulu tamponda çözünmüş ensefalojenik peptitlerin CFA ile karıştırılmasıyla homojen bir yağda su emülsiyonu hazırlanmalıdır, aksi takdirde hayvanlar hastalığı geliştirmez. CFA / peptid emülsiyonlarının hazırlanması konusunda çok sayıda protokol yayınlanmıştır. Örnekler arasında vorteks⁷, sonication⁸, şırıngalar ve üç yönlü bir T konektörü⁹ veya sadece bir şırınga⁵ kullanımı bulunur. Bununla birlikte, tüm bu yöntemlerin standartlaştırılması zordur ve genellikle uzun ve karmaşık protokollerle ilişkilidir.

Yukarıdaki tüm yöntemlerle karşılaştırıldığında, emülsiyon hazırlığı için burada açıklanan basit yöntem, kişiden kişiye farklılık göstermemenin ve nispeten hızlı olmanın avantajlarını sunar. Emülsiyon, reaktifleri belirli bir hız, zaman ve sıcaklıkla çalkalayan ve hızlı ve tutarlı sonuçlar sağlayan bir homojenizatör tarafından üretilir. EAE modelinde hastalığı indüklemenin yanı sıra, bu yöntem kollajen kaynaklı artrit (CIA) ve antijen kaynaklı artrit (AIA) gibi diğer otoimmün hastalık modellerini incelemek için de ^{kullanılabilir6}. Bu nedenle, bu yöntemin, deneysel otoimmün nörit (EAN)10, deneysel otoimmün tiroidit (EAT)¹¹, otoimmün üveit (EAU)¹² ve myastenia gravis (MG)¹³ gibi otoantijenlerle yağda su emülsiyonlarına bağlı diğer hayvan modellerinde sürekli olarak hastalığı indüklemek için kullanılabileceği tahmin edilmektedir. Bu yöntem aynı zamanda gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH) gibi genel bağışıklık tepkilerini sürekli olarak⁶ indükler ve bu nedenle kanser ve sıtma aşıları sunmak için kullanılabilir (tartışmaya bakınız).

Böylece, hızlı (toplam hazırlama süresi ~ 30 dakika), basit (tüm reaktifler önceden hazırlanabilir ve saklanabilir) ve standartlaştırılmış (emülsiyon bir sallama homojenizatörü kullanılarak gerçekleştirilir) bir yöntem geliştirilmiş ve burada sunulmuştur. Bu protokol kullanılarak hazırlanan CFA / antijen emülsiyonları, otoimmün hayvan modellerinde sürekli olarak hastalığı indüklemektedir.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, İsveç Hayvan Araştırmaları Kurulu'nun uygulamalarına göre gerçekleştirilmiş ve İsveç Lund-Malmö, Hayvan Etiği Komitesi tarafından onaylanmıştır (İzin numarası: M126-16).

Not: yöntemin şematik akışı Şekil 1'de açıklanmıştır.

1. Malzeme hazırlama

NOT: Tüm reaktifleri steril bir davlumbazda aseptik olarak hazırlayın ve belirtilen sıcaklıkta saklayın. Reaktifler etkilerini kaybetmeden 2 yıla kadar saklanabilir.

1. Aşağıda açıklandığı gibi 20 mg / mL Mycobacterium tuberculosis içeren CFA'yı hazırlayın.
   1. 7 mL'lik bir tüpe 100 mg dondurularak kurutulmuş M. tuberculosis H37RA (bakınız Malzeme Tablosu) ve beş adet 3,2 mm çelik boncuk ekleyin (bkz. Boruyu bir homojenizatörde (bakınız Malzeme Tablosu) en yüksek hız ayarında (5.000 rpm) 60 sn çalkalayın.
   2. Tüpe 5 mL eksik Freund adjuvanı (IFA) ekleyin ve en yüksek hızda 60 s boyunca tekrar çalkalayın. IFA'daki homojenize M. tuberculosis bulamacını (şimdi CFA olarak adlandırılmıştır) pipetli taze bir tüpe aktarın, boncukları geride bırakın ve kullanıma kadar 4 ° C'de saklayın.
2. 10 mg / mL'lik bir nihai peptid konsantrasyonu elde etmek için MOG_35-55 peptidinin dondurularak kurutulmuş tozuna ultra saf su ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden geçirerek sterilize edin. 60 μL alikot hazırlayın ve kullanana kadar -20 ° C'de saklayın.
   NOT: Bu deney için kullanılan MOG_35-55 peptidi İmmünoSınıf saflıkta (~% 70), TFA-parçalıdır, suda kolayca çözünür ve in vivo stabiliteyi arttırmak için bir C-terminal amid (-NH₂) içerir¹⁴. Peptit alikotları asla çözülmedi ve iki kereden fazla yeniden dondurulmadı ve kullanıma kadar -20 ° C'de saklandı.
3. 100 mL boğmaca toksin tamponu hazırlayın: 2.9 g NaCl'yi 80 mL 1x Ca^{2+/Mg 2+} serbest PBS'de çözün ve 100 μL% 10 Triton X-100 ekleyin. PBS ile ses seviyesini 100 mL'ye ayarlayın ve çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden geçirerek sterilize edin. 10 mL alikot hazırlayın ve kullanana kadar 4 ° C'de saklayın.

2. CFA / peptid emülsiyonlarının hazırlanması

1. Bağışıklama için gereken emülsiyon miktarını hesaplayın. Bu standart protokolde, her fare Freund'un adjuvanında (CFA) dağılmış 50 μg MOG_35-55 peptid ve 300 μg M. tuberculosis alır. Emülsiyonların hazırlanması için gerekli olan her bir reaktifin (MOG_35-55 peptid, PBS, CFA ve IFA) miktarı Ek Dosya 1 kullanılarak hesaplanabilir. Küçük emülsiyon kaybını telafi etmek için tüm reaktiflerin% 20'si daha fazla hesaplamaya dahil edilir.
   NOT: Bu çalışmada kullanılan ticari emülsiyon kiti (bakınız Malzeme Tablosu) sterilize edilmiş bir kese içinde bir tüp, vidalı kapak ve bir pistondan oluşmaktadır. Emülsiyon kitinin her tüpü maksimum 9.6 mL tutar, bu da 40 fareyi (veya hayvan başına 100 μL emülsiyon kullanılıyorsa 80 fareyi) aşılamak için yeterli 8 x 1 mL şırıngaların hazırlanmasını mümkün kılar.
2. Vidalı kapaklı tüpü (ticari emülsiyon kitinden) ve buz üzerinde kullanılacak reaktifleri yerleştirin.
3. Emülsiyon bileşenlerini adım 2.1'de hesaplanan hacimlerde aşağıdaki sırayla ekleyin: PBS, daha sonra peptid, daha sonra CFA'da M. tuberculosis ve son olarak IFA.
4. Tüpü birkaç kez sıkarak ve gevşeterek kapakla sıkıca kapatın. Reaktifleri önceden karıştırmak için tüpü elle 5-10 s kuvvetlice sallayın.
5. Tüpü sallanan homojenizatöre yerleştirin ve çubukla sabitleyin. Hızı en yüksek ayara ve zamanı 60 sn'ye ayarlayın. Koşu bittiğinde, tüpü 3 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Çalıştırmayı aynı ayarlarla bir veya iki kez daha tekrarlayın.
6. Sıkışmış havayı çıkarmak ve emülsiyonu sıkıştırmak için tüpü 1 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
7. Kapağı tüpten çıkarın, pistonu tüpe yerleştirin ve emülsiyonun tepesine ulaşana kadar yavaşça aşağı doğru itin. Borunun altındaki koparma kapağını bükerek çıkarın.
8. Pistonu bir enjeksiyon şırıngasından çıkarın (1 mL; bakınız Malzeme Tablosu). Enjeksiyon şırıngasına bir iğne (tercihen 25-27 G) ekleyin.
9. Enjeksiyon şırıngasının arka ucunu tüpün altındaki özel kilide takın ve kısa bir bükümle kilitleyin.
10. Emülsiyonu, pistonu yavaşça iterek tüpten enjeksiyon şırıngasına aktarın. Emülsiyon, enjeksiyon şırıngasının 0.15 mL mezuniyetine ulaştığında durun.
11. Enjeksiyon şırıngasını tüpten ayırın ve şırıngaya hava girmemesine dikkat ederek pistonu dikkatlice yerleştirin. Emülsiyon iğneden çıkana kadar pistonu itin.
    NOT: Bu noktada, emülsiyonun bir kısmı kalite kontrol için kullanılabilir (bkz. adım 3).
12. Tüpte bulunan emülsiyonun geri kalanı için 2.8-2.11 arasındaki adımları tekrarlayın.
    NOT: Pahalı CFA / antijen emülsiyonlarının israfını en aza indirmek için 1 mL şırıngalar kullanılmalıdır. Tüpün altındaki özel kilide uyan diğer şırıngalar kullanılabilir; Bununla birlikte, daha büyük bir emülsiyon hacminin hazırlanması gerekebilir. CFA / MOG_35-55 peptid emülsiyonu, EAE indükleme kapasitesini kaybetmeden 15 haftaya kadar 4 ° C'de saklanabilir.

3. Emülsiyonun kalite kontrolü

1. Düşürme testi: Emülsiyonun küçük bir damlasını, 20 mL soğuk suyla doldurulmuş steril 50 mL konik bir tüpe ekleyin. Tüpü kapatın ve birkaç saniye boyunca elle sallayın. Küçük farklı damlacıkların ortaya çıkması, yağda su emülsiyonunun oluşumunu doğrular.
2. Emülsiyonu faz kontrast mikroskobu kullanarak inceleyin.
   1. Yağdaki su parçacıklarının boyutunu analiz etmek için, bir mikroskop slaytına emülsiyonun küçük bir damlasını (2-3 μL) ekleyin, bir kapak kayması ile sürün ve ardından emülsiyonu düzleştirmek için dairesel bir hareketle sert bir şekilde itin.
   2. Bulaşmış emülsiyonu bir faz kontrast mikroskobu altında (bakınız Malzeme Tablosu) 400x büyütme ile inceleyin ve emülsiyonun tek katmanlı olduğu bir alana odaklanın. Küçük üniform gri/beyaz parçacıkların görünür olduğundan emin olun (Şekil 2A).
3. Emülsiyon parçacık boyutunu lazer kırınım kullanarak analiz edin.
   NOT: Lazer kırınımı, bir lazer ışını kullanarak parçacık boyutu dağılımlarını ölçer. Bu, emülsiyonlar için nihai kalite kontrol testidir. Burada açıklanan yöntemi kullanan parçacık boyutu dağılımlarının temsili bir sonucu Şekil 2B'de gösterilmiştir (ayrıntılı bir açıklama için Topping ve ark.6'ya bakınız). Bununla birlikte, düşme testi ve mikroskop incelemesi, tatmin edici bir emülsiyonun oluşup oluşmadığını doğrulamak için yeterlidir.
   1. Dispersan için hem kırmızı hem de mavi lazerler için kırılma indekslerini (bkz. Malzeme Tablosu) 1,456'ya ve numune için partikül boyutu analizöründe 1,33'e ayarlayın ( bkz. Kırılma indisinin absorbansını 0,02 olarak ayarlayın.
   2. Peptit emülsiyonunu içeren şırıngadan hafif mineral yağ içeren dispersiyon ünitesine bir damla ekleyin. Emülsiyonun dağılmasından hemen sonra veri toplamaya başlayın.
      NOT: Genel amaçlı bir model uygulanmış ve parçacık boyutu dağılımının tahmini için küresel parçacıklar varsayılmıştır.

4. C57BL6 / J farelerde MOG _35-55 peptid emülsiyonu kullanılarak EAE indüksiyonu

NOT: Tüm deneylerde, 8-12 haftalık beş dişi C57BL6 / J faresi kullanılmıştır.

1. Bağışıklamadan önce,% 2.5 buharlaştırılmış izofluran kullanarak fareleri anestezi altına alın ve sağlam bir ayak parmağı sıkışması kullanarak onaylayın.
2. Her fareyi deri altından 1 mL şırınga kullanarak iki farklı bölgeye, arka kanadın sağ ve sol taraflarında, 1:1 (v/v) peptid/CFA oranında 50 μg MOG_35-55 peptid içeren 200 μL emülsiyon enjekte edin.
3. Emülsiyonla bağışıklamadan en az 1.5 saat sonra ve daha sonra 24 saat sonra, intraperitoneal enjeksiyonlar yoluyla (solda 100 μL ve göbeğin sağ bölgesinde 100 μL) her fareye 200 μL boğmaca toksini tamponunda toplam 80 ng Bordetella boğmaca toksini uygulayın.
   NOT: Boğmaca toksini ile intraperitoneal enjeksiyonun hassas lokalizasyonunun, drenaj lenf nodu^15'teki T hücrelerinin aktivasyonu için gerekli olduğu gösterilmiştir.
4. İsteğe bağlı: MOG_35-55 peptidini 7. günde (bazı protokoller^16'da kullanıldığı gibi) adım 4.2'yi tekrarlayarak tekrar enjekte edin.
   NOT: En önemlisi, MOG/CFA veya boğmaca toksini içeren bağışıklama için kullanılan şırıngaların ve iğnelerin biyolojik tehlike torbalarına/kaplarına yeterince atıldığından emin olun.
5. Daha önce tarif edildiği gibi 0-6 arasında bir ölçek kullanarak klinik skoru günlük olarak değerlendirin⁶.

Sonuçlar

CFA / MOG emülsiyonlarının hazırlanması için hızlı, basit ve standartlaştırılmış protokol Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu yöntem yakın zamanda başka bir yerde açıklanmıştır⁶. CFA / MOG emülsiyonları, geleneksel şırınga yöntemi veya vorteks gibi diğer yöntemlerle de hazırlanabilir. Bu yöntemler burada emülsiyonların kalitesi değerlendirilerek karşılaştırılmıştır. Yağda su emülsiyonları üretilen tüm yöntemler; Bu emülsiy...

Tartışmalar

Antijen / Freund adjuvanı gibi yağda su emülsiyonları, EAE^17'yi indüklemek için yarım yüzyıldan fazla bir süredir kullanılmaktadır. Şu anda insan etkisinden bağımsız antijen emülsiyonları hazırlamak için standartlaştırılmış bir yöntem yoktur. Şırıngalar kullanarak manuel karıştırma çoğu laboratuvar için standarttır, ancak bu yöntem zaman alıcıdır, genellikle aşırı malzeme kaybına neden olur ve kalite, onu hazırlayan bilim adamına bağlı olarak değiş...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Injection syringe	B. Braun	9166017V
1 mL Injection syringe	Sigma-Aldrich	Z683531
7 ml empty tubes with caps	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	7 mL tube
50 mL sterile centrifuge tube	Fisher Scientific	10788561	50 mL tube
Bordetella pertussis toxin	Sigma-Aldrich	P2980	Store at -20 °C
Dispersant, light mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Store at RT
Emulsion kit	Bertin-Instruments	D34200.10 ea	Containing a tube, cap, and plunger
Incomplete Freund's Adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Store at +4 °C
Mastersizer 2000	Malvern Panalytical	N/A	Particle size analyzer
Minilys-Personal homogenizer	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	Shaking homogenizer
MOG 35-55 Peptide	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	FDA-approved oil adjuvant
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm	Fisher Scientific	17124381	Sterlie filter
PBS, Ca2+/Mg2+ free	Thermo Fisher Scientific	14190144	PBS
Phase-Constrast Microscope	Olympus	BX40-B
Steel Beads 3.2 mm	Fisher Scientific	NC0445832	Autoclave and store at RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648463	Store at RT