Eine schnelle, einfache und standardisierte Homogenisierungsmethode zur Herstellung von Antigen/Adjuvans-Emulsionen zur Induktion experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Zusammenfassung

Um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis, ein Tiermodell für Multiple Sklerose, zu induzieren, werden Mäuse mit einer Wasser-in-Öl-Emulsion immunisiert, die ein Autoantigen und ein komplettes Freund-Adjuvans enthält. Während für die Herstellung dieser Emulsionen mehrere Protokolle existieren, wird hier ein schnelles, einfaches und standardisiertes Homogenisierungsprotokoll für die Emulsionsherstellung vorgestellt.

Zusammenfassung

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) weist ähnliche immunologische und klinische Merkmale wie Multiple Sklerose (MS) auf und wird daher häufig als Modell verwendet, um neue Wirkstoffziele für eine bessere Patientenbehandlung zu identifizieren. MS ist durch verschiedene Krankheitsverläufe gekennzeichnet: schubförmig-remittierende MS (RRMS), primär progrediente MS (PPMS), sekundär progrediente MS (SPMS) und eine seltene progressiv-schubförmige Form der MS (PRMS). Obwohl Tiermodelle nicht alle diese kontrastierenden Phänotypen menschlicher Krankheiten genau nachahmen, gibt es EAE-Modelle, die einige der verschiedenen klinischen Manifestationen von MS widerspiegeln. Zum Beispiel ahmt Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)-induzierte EAE in C57BL / 6J-Mäusen menschliches PPMS nach, während Myelin-Proteolipidprotein (PLP)-induzierte EAE in SJL / J-Mäusen RRMS ähnelt. Andere Autoantigene, wie Myelin Basic Protein (MBP), und eine Reihe verschiedener Mausstämme werden ebenfalls verwendet, um EAE zu untersuchen. Um eine Erkrankung in diesen Autoantigen-Immunisierungs-EAE-Modellen zu induzieren, wird eine Wasser-in-Öl-Emulsion hergestellt und subkutan injiziert. Die meisten EAE-Modelle erfordern auch eine Injektion von Pertussis-Toxin, damit sich die Krankheit entwickeln kann. Für eine konsistente und reproduzierbare EAE-Induktion ist ein detailliertes Protokoll zur Herstellung der Reagenzien zur Herstellung von Antigen-/Adjuvansemulsionen erforderlich. Das hier beschriebene Verfahren nutzt ein standardisiertes Verfahren zur Erzeugung von Wasser-in-Öl-Emulsionen. Es ist einfach und schnell und verwendet einen Schüttelhomogenisator anstelle von Spritzen, um qualitätskontrollierte Emulsionen herzustellen.

Einleitung

Ein Zusammenbruch der immunologischen Toleranz kann zur Entstehung von Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose (MS) führen. Es wird geschätzt, dass weltweit 2,8 Millionen Menschen mit MS leben¹. Obwohl die genaue Ursache der MS noch weitgehend unbekannt ist, spielen Dysregulation autoreaktiver T- und B-Zellen sowie Defekte in der Treg-Funktion eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der Erkrankung ^2,3.

Tiermodelle von Autoimmunerkrankungen sind wesentliche Werkzeuge, um mögliche therapeutische Modalitäten zu untersuchen. Das experimentelle Modell der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) wird seit fast einem Jahrhundert von Forschern verwendet, die sich für MS⁴ interessieren. In frühen Experimenten war die Inzidenz der Krankheit relativ gering. Die Einführung eines vollständigen Freund-Adjuvans (CFA), das Mycobacterium und Pertussis-Toxin enthält, ermöglichte die konsistente Induktion von EAE bei Mäusen⁴. Am wichtigsten ist, dass CFA mit einem ZNS-spezifischen Antigen gemischt werden muss, um eine homogene Wasser-in-Öl-Emulsion zur Induktion von EAE zu erzeugen. Die derzeit gebräuchlichsten EAE-Modelle basieren auf der aktiven Immunisierung von Mäusen mit enzephalitogenen Peptiden. Der genetische Hintergrund der Mäuse spielt eine wichtige Rolle bei der Krankheitsanfälligkeit, wobei Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG_35-55) und Myelin-Proteolipidprotein (PLP_139-151) Peptide verwendet werden, um EAE in C57BL / 6J- bzw. SJL-Mäusen zu induzieren⁵. Es können jedoch auch andere Mausstämme und ZNS-abgeleitete Peptide verwendet werden.

Die Qualität der CFA/Peptid-Emulsion ist ein kritischer Faktor, der die Krankheitspenetranz im aktiven Immunisierungsmodell^{EAE 6} bestimmt. Eine homogene Wasser-in-Öl-Emulsion muss hergestellt werden, indem die in wässrigem Puffer gelösten enzephalitogenen Peptide mit CFA gemischt werden, da sonst Tiere die Krankheit nicht entwickeln. Zur Herstellung von CFA/Peptid-Emulsionen wurden zahlreiche Protokolle veröffentlicht. Beispiele umfassen die Verwendung eines Wirbels⁷, Ultraschall⁸, Spritzen und eines Drei-Wege-T-Steckers⁹ oder einer Spritze nur⁵. Alle diese Methoden sind jedoch schwer zu standardisieren und oft mit langwierigen und komplizierten Protokollen verbunden.

Im Vergleich zu allen oben genannten Methoden bietet die hier beschriebene einfache Methode zur Emulsionsherstellung den Vorteil, dass sie keine Unterschiede von Mensch zu Mensch aufweist und relativ schnell ist. Die Emulsion wird durch einen Homogenisator erzeugt, der die Reagenzien mit einer eingestellten Geschwindigkeit, Zeit und Temperatur schüttelt, um schnelle und konsistente Ergebnisse zu gewährleisten. Neben der Induktion von Krankheiten im EAE-Modell kann diese Methode auch verwendet werden, um andere Autoimmunerkrankungsmodelle wie Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) und Antigen-induzierte Arthritis (AIA^{) zu} untersuchen6. Daher wird erwartet, dass diese Methode verwendet werden kann, um Krankheiten in anderen Tiermodellen konsistent zu induzieren, die auf Wasser-in-Öl-Emulsionen mit Autoantigenen angewiesen sind, wie experimentelle Autoimmunneuritis (EAN)10, experimentelle Autoimmunthyreoiditis (EAT)11, autoimmune Uveitis (EAU)¹² und Myasthenia gravis (MG)¹³. Diese Methode induziert auch allgemeine Immunantworten wie verzögerte Typ-Überempfindlichkeit (DTH) konsistent⁶ und könnte daher für die Verabreichung von Krebs- und Malariaimpfstoffen verwendet werden (siehe Diskussion).

So wurde eine schnelle (Gesamtherstellungszeit ~30 min), einfache (alle Reagenzien können im Voraus hergestellt und gelagert werden) und standardisierte (die Emulsion wird mit einem Schüttelhomogenisator erreicht) Methode entwickelt und hier vorgestellt. Die nach diesem Protokoll hergestellten CFA/Antigen-Emulsionen induzieren in Autoimmuntiermodellen durchweg Krankheiten.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden nach den Praktiken des schwedischen Tierversuchsamtes durchgeführt und von der Tierethikkommission, Lund-Malmö, Schweden genehmigt (Genehmigungsnummer: M126-16).

HINWEIS: Ein schematischer Ablauf der Methode ist in Abbildung 1 beschrieben.

1. Materialaufbereitung

HINWEIS: Bereiten Sie alle Reagenzien aseptisch in einer sterilen Haube vor, aliquot und lagern Sie sie bei der angegebenen Temperatur. Die Reagenzien können bis zu 2 Jahre gelagert werden, ohne ihre Wirkung zu verlieren.

1. Bereiten Sie CFA mit 20 mg/ml Mycobacterium tuberculosis wie unten beschrieben vor.
   1. 100 mg gefriergetrocknete M. tuberculosis H37RA (siehe Materialtabelle) und fünf 3,2 mm Stahlperlen in ein 7-ml-Röhrchen geben (siehe Materialtabelle). Schütteln Sie das Röhrchen in einem Homogenisator (siehe Materialtabelle) 60 s bei höchster Drehzahleinstellung (5.000 U/min).
   2. 5 mL unvollständiges Freund-Adjuvans (IFA) in die Tube geben und erneut 60 s bei höchster Geschwindigkeit schütteln. Die Aufschlämmung der homogenisierten M. tuberculosis in IFA (jetzt CFA) in ein frisches Röhrchen mit einer Pipette geben, die Perlen zurücklassen und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
2. Fügen Sie dem gefriergetrockneten Pulver des MOG_{35-55-Peptids} Reinstwasser hinzu (siehe Materialtabelle), um eine endgültige Peptidkonzentration von 10 mg / ml zu erhalten. Sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie durch einen 0,2-μm-Filter leiten. 60 μL Aliquots vorbereiten und bis zum Gebrauch bei -20 °C lagern.
   HINWEIS: Das für dieses Experiment verwendete MOG_35-55-Peptid ist von ImmunoGrade-Reinheit (~ 70%), ist TFA-gespalten, löst sich leicht in Wasser auf und enthält ein C-terminales Amid (-NH₂), um die In-vivo-Stabilität zu erhöhen¹⁴. Peptidaliquots wurden nie mehr als zweimal aufgetaut und wieder eingefroren und wurden bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.
3. Bereiten Sie 100 ml Keuchhustentoxinpuffer vor: Lösen Sie 2,9 g NaCl in 80 ml 1x Ca 2+^{/Mg 2+} freies PBS und fügen Sie 100 μL 10% Triton X-100 hinzu. Stellen Sie das Volumen mit PBS auf 100 ml ein und sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie durch einen 0,2-μm-Filter leiten. 10 ml Aliquots vorbereiten und bis zum Gebrauch bei 4 °C lagern.

2. Herstellung von CFA/Peptid-Emulsionen

1. Berechnen Sie die Menge an Emulsion, die für die Immunisierung benötigt wird. In diesem Standardprotokoll erhält jede Maus 50 μg MOG_35-55 Peptid und 300 μg M. tuberculosis dispergiert in Freunds Adjuvans (CFA). Die Menge jedes Reagenzes (MOG_35-55-Peptid , PBS, CFA und IFA), die für die Herstellung der Emulsionen benötigt wird, kann mit Hilfe der Zusatzdatei 1 berechnet werden. Weitere 20% aller Reagenzien, um den geringen Emulsionsverlust auszugleichen, werden in die Berechnung einbezogen.
   HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete handelsübliche Emulsionskit (siehe Materialtabelle) besteht aus einem Schlauch, einem Schraubverschluss und einem Kolben in einem sterilisierten Beutel. Jedes Röhrchen des Emulsions-Kits fasst maximal 9,6 ml, wodurch 8 x 1 ml Spritzen hergestellt werden können, die für die Immunisierung von 40 Mäusen ausreichen (oder 80 Mäuse bei Verwendung von 100 μL Emulsion pro Tier).
2. Legen Sie das verschraubte Röhrchen (aus dem handelsüblichen Emulsionskit) und die Reagenzien auf Eis.
3. Fügen Sie die Emulsionskomponenten in der folgenden Reihenfolge in den in Schritt 2.1 berechneten Volumina hinzu: PBS, dann das Peptid, dann M. tuberculosis in CFA und schließlich IFA.
4. Verschließen Sie den Schlauch mit der Kappe fest, indem Sie ihn mehrmals festziehen und lösen. Schütteln Sie das Röhrchen kräftig für 5-10 s von Hand, um die Reagenzien vorzumischen.
5. Legen Sie das Röhrchen in den Schüttelhomogenisator und sichern Sie es mit dem Stab. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf die höchste Einstellung und die Zeit auf 60 s ein. Sobald der Lauf beendet ist, legen Sie die Röhre für 3 min auf Eis. Wiederholen Sie die Ausführung noch ein oder zwei Mal mit den gleichen Einstellungen.
6. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 1 Minute, um eingeschlossene Luft zu entfernen und die Emulsion zu verdichten.
7. Entfernen Sie die Kappe aus dem Röhrchen, führen Sie den Kolben in das Röhrchen ein und drücken Sie ihn langsam nach unten, bis er die Oberseite der Emulsion erreicht. Entfernen Sie den Schnappverschluss an der Unterseite des Röhrchens, indem Sie ihn drehen.
8. Entfernen Sie den Kolben aus einer Injektionsspritze (1 ml; siehe Materialtabelle). Fügen Sie der Injektionsspritze eine Nadel (vorzugsweise 25-27 G) hinzu.
9. Befestigen Sie das hintere Ende der Injektionsspritze am speziellen Schloss am Boden des Röhrchens und verriegeln Sie es mit einer kurzen Drehung.
10. Übertragen Sie die Emulsion aus dem Röhrchen in die Injektionsspritze, indem Sie den Kolben vorsichtig drücken. Stoppen Sie, wenn die Emulsion die 0,15-ml-Graduierung der Injektionsspritze erreicht hat.
11. Trennen Sie die Injektionsspritze vom Röhrchen und führen Sie den Kolben vorsichtig ein, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luft in die Spritze gelangt. Drücken Sie den Kolben, bis die Emulsion aus der Nadel kommt.
    HINWEIS: An dieser Stelle kann ein Teil der Emulsion zur Qualitätskontrolle verwendet werden (siehe Schritt 3).
12. Wiederholen Sie die Schritte 2.8-2.11 für den Rest der im Röhrchen vorhandenen Emulsion.
    HINWEIS: Um die Verschwendung teurer CFA / Antigen-Emulsionen zu minimieren, sollten 1-ml-Spritzen verwendet werden. Andere Spritzen, die in den speziellen Verschluss am Boden des Röhrchens passen, können verwendet werden; Möglicherweise muss jedoch ein größeres Emulsionsvolumen hergestellt werden. Die Peptidemulsion CFA/MOG_35-55 kann bis zu 15 Wochen bei 4 °C gelagert werden, ohne ihre EAE-induzierende Kapazität zu verlieren.

3. Qualitätskontrolle der Emulsion

1. Falltest: Geben Sie einen kleinen Tropfen der Emulsion in ein steriles 50 ml konisches Röhrchen, das mit 20 mL kaltem Wasser gefüllt ist. Schließen Sie die Tube und schütteln Sie sie einige Sekunden lang von Hand. Das Auftreten winziger Tröpfchen bestätigt die Bildung einer Wasser-in-Öl-Emulsion.
2. Untersuchen Sie die Emulsion mittels Phasenkontrastmikroskopie.
   1. Um die Größe der Wasser-in-Öl-Partikel zu analysieren, fügen Sie einen winzigen Tropfen (2-3 μL) der Emulsion zu einem Objektträger hinzu, schmieren Sie ihn mit einem Abdeckstreifen aus und drücken Sie dann in kreisenden Bewegungen fest, um die Emulsion abzuflachen.
   2. Untersuchen Sie die verschmierte Emulsion unter einem Phasenkontrastmikroskop (siehe Materialtabelle) mit 400-facher Vergrößerung und fokussieren Sie auf ein Feld mit einer Monoschicht der Emulsion. Stellen Sie sicher, dass kleine, gleichmäßige graue/weiße Partikel sichtbar sind (Abbildung 2A).
3. Analysieren Sie die Partikelgröße der Emulsion mit Laserbeugung.
   HINWEIS: Die Laserbeugung misst Partikelgrößenverteilungen mit einem Laserstrahl. Dies ist der ultimative Qualitätskontrolltest für Emulsionen. Ein repräsentatives Ergebnis der Partikelgrößenverteilungen nach der hier beschriebenen Methode ist in Abbildung 2B dargestellt (für eine detaillierte Beschreibung siehe Topping et ^al.6). Dennoch reichen Falltest und mikroskopische Untersuchung aus, um zu validieren, ob eine zufriedenstellende Emulsion gebildet wurde.
   1. Stellen Sie die Brechungsindizes für rote und blaue Laser für das Dispergiermittel (siehe Materialtabelle) auf 1,456 und für die Probe auf 1,33 auf dem Partikelgrößenanalysator ein (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Absorption des Brechungsindex auf 0,02 ein.
   2. Geben Sie einen Tropfen aus der Spritze mit der Peptidemulsion in die Dispersionseinheit mit leichtem Mineralöl. Starten Sie die Datenerfassung sofort nach der Dispergierung der Emulsion.
      HINWEIS: Für die Abschätzung der Partikelgrößenverteilung wurde ein Allzweckmodell angewendet und sphärische Partikel wurden angenommen.

4. EAE-Induktion mit der MOG _{35-55-Peptidemulsion} in C57BL6/J-Mäusen

HINWEIS: In allen Experimenten wurden fünf 8-12 Wochen alte weibliche C57BL6 / J-Mäuse verwendet.

1. Vor der Immunisierung betäuben Sie die Mäuse mit 2,5% verdampftem Isofluran und bestätigen Sie mit einer festen Zehenklemme.
2. Injizieren Sie jede Maus subkutan mit 1-ml-Spritzen in zwei verschiedene Stellen, auf der rechten und linken Seite der Hinterflanke, mit 200 μL Emulsion, die 50 μg MOG_35-55-Peptid in einem Verhältnis von 1: 1 (v / v) von Peptid / CFA enthält.
3. Mindestens 1,5 h nach der Immunisierung mit der Emulsion und dann wieder nach 24 h insgesamt 80 ng Bordetella pertussis-Toxin in 200 μL Keuchhustentoxinpuffer an jede Maus durch intraperitoneale Injektionen (100 μL auf der linken und 100 μL auf der rechten Seite des Bauches) verabreichen.
   HINWEIS: Die genaue Lokalisation der intraperitonealen Injektion mit Keuchhustentoxin hat sich als essentiell für die Aktivierung von T-Zellen im drainierenden Lymphknoten¹⁵ erwiesen.
4. Optional: Injizieren Sie MOG_35-55 Peptid erneut an Tag 7 (wie in einigen Protokollen¹⁶ verwendet), indem Sie Schritt 4.2 wiederholen.
   HINWEIS: Am wichtigsten ist, dass die Spritzen und Nadeln, die für die Immunisierung verwendet werden, die MOG / CFA oder Keuchhustentoxin enthalten, ordnungsgemäß in Biogefahrenbeuteln / -behältern entsorgt werden.
5. Bewerten Sie den klinischen Score täglich auf einer Skala von 0-6, wie zuvor beschrieben⁶.

Ergebnisse

Das schnelle, einfache und standardisierte Protokoll für die Herstellung von CFA/MOG-Emulsionen ist in Abbildung 1 dargestellt. Diese Methode wurde kürzlich an anderer Stelle beschrieben⁶. Die CFA/MOG-Emulsionen können auch mit anderen Methoden hergestellt werden, wie z.B. dem traditionellen Spritzenverfahren oder durch Vortexen. Diese Methoden wurden hier verglichen, indem die Qualität der Emulsionen bewertet wurde. Alle Methoden erzeugten Wasser-in-Öl-Emulsione...

Diskussion

Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie das Antigen/Freund-Adjuvans, werden seit mehr als einem halben Jahrhundert verwendet, um EAE¹⁷ zu induzieren. Derzeit gibt es keine standardisierte Methode zur Herstellung von Antigenemulsionen, die unabhängig vom menschlichen Einfluss ist. Das manuelle Mischen mit Spritzen ist in den meisten Laboratorien Standard, jedoch ist diese Methode zeitaufwendig, führt oft zu einem übermäßigen Materialverlust und die Qualität unterscheidet sich je nach Wissenschaftler, d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Injection syringe	B. Braun	9166017V
1 mL Injection syringe	Sigma-Aldrich	Z683531
7 ml empty tubes with caps	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	7 mL tube
50 mL sterile centrifuge tube	Fisher Scientific	10788561	50 mL tube
Bordetella pertussis toxin	Sigma-Aldrich	P2980	Store at -20 °C
Dispersant, light mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Store at RT
Emulsion kit	Bertin-Instruments	D34200.10 ea	Containing a tube, cap, and plunger
Incomplete Freund's Adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Store at +4 °C
Mastersizer 2000	Malvern Panalytical	N/A	Particle size analyzer
Minilys-Personal homogenizer	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	Shaking homogenizer
MOG 35-55 Peptide	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	FDA-approved oil adjuvant
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm	Fisher Scientific	17124381	Sterlie filter
PBS, Ca2+/Mg2+ free	Thermo Fisher Scientific	14190144	PBS
Phase-Constrast Microscope	Olympus	BX40-B
Steel Beads 3.2 mm	Fisher Scientific	NC0445832	Autoclave and store at RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648463	Store at RT