실험적 자가면역 뇌척수염 유도를 위한 항원/보조 에멀젼을 제조하기 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 방법

요약

다발성 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하기 위해, 마우스를 자가항원 및 완전한 프로인트 보조제를 함유하는 유중수 에멀젼으로 면역화시킨다. 이러한 에멀젼의 제조를 위한 여러 프로토콜이 존재하지만, 에멀젼 제조를 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 프로토콜이 여기에 제시된다.

초록

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)과 유사한 면역학적 및 임상적 특징을 공유하므로 더 나은 환자 치료를 위한 신약 표적을 식별하는 모델로 널리 사용됩니다. MS는 재발성 완화 MS (RRMS), 원발성 진행성 MS (PPMS), 이차성 진행성 MS (SPMS) 및 희귀 진행성 재발 형태의 MS (PRMS)와 같은 여러 가지 질병 과정을 특징으로합니다. 동물 모델이 이러한 대조적인 인간 질병 표현형을 모두 정확하게 모방하지는 않지만, MS의 상이한 임상 증상 중 일부를 반영하는 EAE 모델이 있다. 예를 들어, C57BL/6J 마우스에서 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG) 유도 EAE는 인간 PPMS를 모방하는 반면, SJL/J 마우스에서 미엘린 프로테오리피드 단백질(PLP) 유도 EAE는 RRMS와 유사합니다. 다른 자가항원, 예컨대 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 및 다수의 상이한 마우스 균주도 EAE를 연구하는데 사용된다. 이들 자가항원-면역화 EAE 모델에서 질환을 유도하기 위해, 유중수 에멀젼을 제조하고 피하 주사한다. EAE 모델의 대부분은 또한 질병이 발병하기 위해 백일해 독소의 주사를 필요로합니다. 일관되고 재현 가능한 EAE 유도를 위해서는 항원/보조 에멀젼을 생성하기 위한 시약을 준비하기 위한 상세한 프로토콜이 필요합니다. 여기에 설명된 방법은 표준화된 방법을 활용하여 유중수 에멀젼을 생성합니다. 간단하고 빠르며 주사기 대신 흔들리는 균질화기를 사용하여 품질 관리 에멀젼을 준비합니다.

서문

면역 학적 내성의 붕괴는 다발성 경화증 (MS)과 같은자가 면역 질환의 생성을 초래할 수 있습니다. ^{전 세계적으로} 280만 명이 MS를 앓고 있는 것으로 추정됩니다1. MS의 정확한 원인은 아직 잘 알려져 있지 않지만자가 반응성 T 및 B 세포의 조절 장애와 Treg 기능의 결함은 질병의 발병 기전에 중요한 역할을합니다 ^2,3.

자가면역 질환의 동물 모델은 잠재적인 치료 양식을 조사하는 데 필수적인 도구입니다. 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델은 MS⁴에 관심이 있는 연구자들에 의해 거의 한 세기 동안 사용되어 왔다. 초기 실험에서이 질병의 발병률은 상대적으로 낮았습니다. 마이코박테리움 및 백일해 독소를 함유하는 완전한 프로인트 보조제(CFA)의 도입은 마우스⁴에서 EAE의 일관된 유도를 가능하게 하였다. 가장 중요한 것은 EAE를 유도하기 위한 균일한 유중수 에멀젼을 생성하기 위해 CFA를 중추신경계(CNS) 특이적 항원과 혼합하는 것이 필요하다는 것입니다. 현재 이용 가능한 가장 일반적인 EAE 모델은 뇌염 펩티드를 사용한 마우스의 활성 면역화에 기초한다. 마우스의 유전 적 배경은 각각 C57BL / 6J 및 SJL 마우스에서 EAE를 유도하기 위해 사용되는 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (MOG_35-55) 및 미엘린 프로테오리피드 단백질 (PLP_139-151) 펩타이드와 함께 질병 감수성에 중요한 역할을합니다⁵. 그러나, 다른 마우스 균주 및 CNS-유래된 펩티드가 또한 사용될 수 있다.

CFA/펩타이드 에멀젼의 품질은 활성 면역화 EAE 모델⁶에서 질병 침투를 결정하는 중요한 요소입니다. 균질 한 유중수 에멀젼은 수성 완충액에 용해 된 뇌염 생성 펩타이드를 CFA와 혼합하여 준비해야하며, 그렇지 않으면 동물이 질병을 발병하지 않습니다. CFA/펩타이드 에멀젼의 제조에 대한 수많은 프로토콜이 발표되었습니다. 예로는 와류⁷, 초음파 처리⁸, 주사기 및 3 방향 T 커넥터⁹, 또는 하나의 주사기^{만 5}의 사용이 포함됩니다. 그러나 이러한 모든 방법은 표준화하기 어렵고 종종 길고 복잡한 프로토콜과 관련이 있습니다.

위의 모든 방법과 비교하여 에멀젼 제조를 위해 여기에 설명된 간단한 방법은 사람 대 사람 차이가 없고 상대적으로 빠르다는 이점을 제공합니다. 에멀젼은 설정된 속도, 시간 및 온도로 시약을 흔드는 균질화기에 의해 생성되어 빠르고 일관된 결과를 보장합니다. EAE 모델에서 질병을 유도하는 것 외에도이 방법은 콜라겐 유도 관절염 (CIA) 및 항원 유발 관절염 (AIA^)과 같은 다른자가 면역 질환 모델을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다6. 따라서, 이 방법은 실험적 자가면역 신경염(EAN)10, 실험적 자가면역 갑상선염(EAT)¹¹, 자가면역 포도막염(EAU)12 및 중증 근무력증(MG)¹³과 같은 자가항원이 있는 유중수 에멀젼에 의존하는 다른 동물 모델에서 질병을 일관되게 유도하는 데 사용될 수 있을 것으로 예상된다. 이 방법은 또한 지연형 과민증(DTH)과 같은 일반적인 면역 반응을 일관되게 유도합니다.⁶, 따라서 암 및 말라리아 백신을 전달하는 데 사용할 수 있습니다(토론 참조).

따라서, 신속한(총 준비 시간 ~30분), 단순(모든 시약은 미리 제조 및 저장될 수 있음) 및 표준화된(에멀젼은 진탕 균질기를 사용하여 달성됨) 방법이 개발되어 여기에 제시된다. 이 프로토콜을 사용하여 제조된 CFA/항원 에멀젼은 자가면역 동물 모델에서 일관되게 질병을 유도합니다.

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프로토콜

모든 동물 절차는 스웨덴 동물 연구위원회의 관행에 따라 수행되었으며 스웨덴 룬드 말뫼의 동물 윤리위원회의 승인을 받았습니다(허가 번호: M126-16).

참고: 방법의 개략적인 흐름은 그림 1에 설명되어 있습니다.

1. 재료 준비

참고: 모든 시약을 멸균 후드에 무균 상태로 준비하고 부분 표본을 취하여 표시된 온도에서 보관하십시오. 시약은 효과를 잃지 않고 최대 2 년까지 보관할 수 있습니다.

1. 아래 설명된 대로 결핵 균 20mg/mL를 함유한 CFA를 준비합니다.
   1. 동결 건조 M. tuberculosis H37RA 100mg(재료 표 참조)과 3.2mm 스틸 비드 5개를 7mL 튜브에 추가합니다(재료 표 참조). 균질화기(재료 표 참조)에서 튜브를 최고 속도 설정(5,000rpm)에서 60초 동안 흔듭니다.
   2. 불완전한 프로인트 보조제(IFA) 5mL를 튜브에 넣고 최고 속도로 60초 동안 다시 흔듭니다. IFA(현재 CFA로 명명됨)에서 균질화된 M. tuberculosis 의 슬러리를 피펫이 있는 새로운 튜브로 옮기고 비드를 남겨두고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
2. MOG_35-55 펩타이드의 동결건조 분말에 초순수를 첨가하여( 재료 표 참조) 10mg/mL의 최종 펩타이드 농도를 얻습니다. 용액을 0.2μm 필터에 통과시켜 멸균합니다. 60 μL 분취량을 준비하고 사용할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.
   참고: 이 실험에 사용된 MOG_35-55 펩타이드는 ImmunoGrade 순도(~70%)이고 TFA 절단되며 물에 쉽게 용해되며 생체 내 안정성을 높이기 위해 C-말단 아미드(-NH2)를 포함합니다¹⁴. 펩티드 분취량은 결코 해동되지 않았고, 2회 이상 재냉동되었고, 사용시까지 -20°C에서 저장되었다.
3. 백일해 독소 완충액 100mL 준비: 1x Ca 2+/Mg²⁺ 유리 PBS 80mL에 NaCl 2.9g을 녹이고 10% 트리톤 X-100 100μL를 추가합니다. PBS로 부피를 100mL로 조정하고 0.2μm 필터를 통과시켜 용액을 멸균합니다. 10mL 분취량을 준비하고 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.

2. CFA/펩타이드 에멀젼의 제조

1. 예방 접종에 필요한 에멀젼의 양을 계산하십시오. 이 표준 프로토콜에서 각 마우스는 프로인트 보조제(CFA)에 분산된 50μg의 MOG_35-55 펩타이드와 300μg의 M. tuberculosis 를 받습니다. 에멀젼을 제조하는데 필요한 각 시약 (MOG_35-55 펩티드, PBS, CFA, 및 IFA)의 양은 보충 파일 1을 사용하여 계산할 수 있다. 에멀젼의 작은 손실을 보상하기 위해 모든 시약의 추가 20 %가 계산에 포함됩니다.
   참고: 이 연구에 사용된 상업용 에멀젼 키트( 재료 표 참조)는 멸균된 파우치에 튜브, 스크류 캡 및 플런저로 구성됩니다. 에멀젼 키트의 각 튜브에는 최대 9.6mL가 들어 있어 40마리의 마우스(동물당 100μL의 에멀젼을 사용하는 경우 80마리의 마우스)를 면역화하기에 충분한 8 x 1mL 주사기를 준비할 수 있습니다.
2. 스크류 캡이 있는 튜브(상업용 에멀젼 키트에서)와 사용할 시약을 얼음 위에 놓습니다.
3. 단계 2.1에서 계산된 부피에 다음 순서로 에멀젼 성분을 추가합니다: PBS, 펩타이드, CFA의 M. tuberculosis , 마지막으로 IFA.
4. 튜브를 여러 번 조이고 풀어 캡으로 단단히 닫습니다. 시약을 미리 혼합하기 위해 손으로 튜브를 5-10초 동안 세게 흔듭니다.
5. 튜브를 흔들리는 균질화기에 넣고 막대로 고정합니다. 속도를 최고 설정으로 설정하고 시간을 60초로 설정합니다. 달리기가 끝나면 튜브를 얼음 위에 3분 동안 놓습니다. 동일한 설정으로 실행을 한두 번 더 반복합니다.
6. 튜브를 300 x g 로 1분 동안 원심분리하여 갇힌 공기를 제거하고 에멀젼을 압축합니다.
7. 튜브에서 캡을 제거하고 플런저를 튜브에 삽입한 다음 에멀젼 상단에 도달할 때까지 천천히 아래로 누릅니다. 튜브 바닥의 스냅 오프 클로저를 비틀어 제거합니다.
8. 주입 주사기(1mL, 재료 표 참조)에서 플런저를 제거합니다. 주사기에 바늘 (바람직하게는 25-27G)을 추가하십시오.
9. 주사기의 뒤쪽 끝을 튜브 하단의 전용 잠금 장치에 부착하고 짧게 비틀어 잠급니다.
10. 플런저를 부드럽게 밀어 튜브에서 주입 주사기로 에멀젼을 옮깁니다. 에멀젼이 주사기의 0.15mL 눈금에 도달하면 중지합니다.
11. 주입 주사기를 튜브에서 분리하고 주사기에 공기가 들어 가지 않도록주의하면서 플런저를 조심스럽게 삽입하십시오. 에멀젼이 바늘에서 나올 때까지 플런저를 밉니다.
    참고: 이 시점에서 일부 에멀젼을 품질 관리에 사용할 수 있습니다(3단계 참조).
12. 튜브에 존재하는 나머지 에멀젼에 대해 2.8-2.11단계를 반복합니다.
    알림: 값비싼 CFA/항원 에멀젼의 낭비를 최소화하려면 1mL 주사기를 사용해야 합니다. 튜브 바닥의 전용 잠금 장치에 맞는 다른 주사기를 사용할 수 있습니다. 그러나 더 많은 양의 에멀젼을 준비해야 할 수도 있습니다. CFA/MOG_35-55 펩타이드 에멀젼은 EAE 유도 능력을 잃지 않고 최대 15주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.

3. 에멀젼의 품질 관리

1. 낙하 테스트: 20mL의 찬물로 채워진 멸균 50mL 원추형 튜브에 에멀젼의 작은 방울을 추가합니다. 튜브를 닫고 몇 초 동안 손으로 흔 듭니다. 작고 뚜렷한 물방울의 출현은 유중수 에멀젼의 형성을 확인합니다.
2. 위상차 현미경을 사용하여 에멀젼을 검사합니다.
   1. 유중수 입자의 크기를 분석하려면 에멀젼의 작은 방울(2-3μL)을 현미경 슬라이드에 추가하고 커버 슬립으로 번진 다음 원을 그리며 세게 밀어 에멀젼을 평평하게 만듭니다.
   2. 400x 배율로 위상차 현미경( 재료 표 참조)으로 번진 에멀젼을 검사하고 에멀젼의 단층이 있는 필드에 초점을 맞춥니다. 작고 균일한 회색/흰색 입자가 보이는지 확인합니다(그림 2A).
3. 레이저 회절을 사용하여 에멀젼 입자 크기를 분석합니다.
   참고: 레이저 회절은 레이저 빔을 사용하여 입자 크기 분포를 측정합니다. 이것은 에멀젼에 대한 궁극적 인 품질 관리 테스트입니다. 여기에 기술된 방법을 사용한 입자 크기 분포의 대표적인 결과가 도 2B 에 도시되어 있다(자세한 설명은 Topping et ^al.6 참조). 그럼에도 불구하고 낙하 시험과 현미경 검사는 만족스러운 에멀젼이 형성되었는지 여부를 검증하기에 충분합니다.
   1. 분산제(재료 표 참조)에 대한 적색 및 청색 레이저의 굴절률을 1.456으로 설정하고 샘플의 굴절률을 입자 크기 분석기에서 1.33으로 설정합니다(재료 표 참조). 굴절률의 흡광도를 0.02로 설정합니다.
   2. 펩티드 에멀젼을 함유하는 주사기로부터 한 방울을 경광유를 함유하는 분산부에 첨가한다. 에멀젼 분산 후 즉시 데이터 수집을 시작하십시오.
      참고: 범용 모델이 적용되었으며 입자 크기 분포를 추정하기 위해 구형 입자가 가정되었습니다.

4. C57BL6/J 마우스에서 MOG _35-55 펩타이드 에멀젼을 이용한 EAE 유도

참고: 모든 실험에서 5마리의 8-12주령 암컷 C57BL6/J 마우스를 사용했습니다.

1. 면역화 전에 2.5% 기화된 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취시키고 단단한 발가락 핀치를 사용하여 확인합니다.
2. 펩타이드/CFA의 1:1(v/v) 비율로 MOG_35-55 펩타이드 50μg을 함유한 에멀젼 200μL를 사용하여 뒷부분의 오른쪽과 왼쪽에 있는 1mL 주사기를 사용하여 각 마우스를 피하 주사합니다.
3. 에멀젼으로 면역화 후 적어도 1.5 시간, 그리고 다시 24 시간 후에, 복강 내 주사를 통해 각 마우스에 백일해 독소 완충액 200 μL에 총 80 ng의 보르 데텔라 백일해 독소를 투여한다 (배의 왼쪽 부위에서 100 μL 및 오른쪽 부위에 100 μL).
   참고: 백일해 독소를 사용한 복강내 주사의 정확한 국소화는 배액 림프절(¹⁵)에서 T 세포의 활성화에 필수적인 것으로 나타났다.
4. 선택 사항: 4.2단계를 반복하여 7일째(일부 프로토콜¹⁶에서 사용됨)에 MOG_35-55 펩타이드를 다시 주입합니다.
   알림: 가장 중요한 것은 MOG/CFA 또는 백일해 독소가 포함된 예방 접종에 사용되는 주사기와 바늘을 생물학적 위험 백/용기에 적절하게 폐기했는지 확인하는 것입니다.
5. 앞서 설명한 대로 0-6의 척도를 사용하여 매일 임상 점수를 평가합니다⁶.

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결과

CFA/MOG 에멀젼 제조를 위한 빠르고 간단하며 표준화된 프로토콜이 그림 1에 나와 있습니다. 이 방법은 최근에 다른 곳에서 설명되었다⁶. CFA/MOG 에멀젼은 기존의 주사기 방법 또는 와류 방법과 같은 다른 방법으로도 제조할 수 있습니다. 이들 방법은 에멀젼의 품질을 평가함으로써 여기에서 비교되었다. 모든 방법은 유중수 에멀젼을 생산했습니다. 이러한 에?...

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토론

항원/프로인트 보조제와 같은 유중수 에멀젼은 EAE¹⁷을 유도하기 위해 반세기 이상 사용되어 왔습니다. 현재 인간의 영향과 무관한 항원 에멀젼을 제조하는 표준화된 방법은 없습니다. 주사기를 사용한 수동 혼합은 대부분의 실험실에서 표준이지만이 방법은 시간이 많이 걸리고 종종 과도한 재료 손실을 초래하며 품질은 준비하는 과학자에 따라 다릅니다.

?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Injection syringe	B. Braun	9166017V
1 mL Injection syringe	Sigma-Aldrich	Z683531
7 ml empty tubes with caps	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	7 mL tube
50 mL sterile centrifuge tube	Fisher Scientific	10788561	50 mL tube
Bordetella pertussis toxin	Sigma-Aldrich	P2980	Store at -20 °C
Dispersant, light mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Store at RT
Emulsion kit	Bertin-Instruments	D34200.10 ea	Containing a tube, cap, and plunger
Incomplete Freund's Adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Store at +4 °C
Mastersizer 2000	Malvern Panalytical	N/A	Particle size analyzer
Minilys-Personal homogenizer	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	Shaking homogenizer
MOG 35-55 Peptide	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	FDA-approved oil adjuvant
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm	Fisher Scientific	17124381	Sterlie filter
PBS, Ca2+/Mg2+ free	Thermo Fisher Scientific	14190144	PBS
Phase-Constrast Microscope	Olympus	BX40-B
Steel Beads 3.2 mm	Fisher Scientific	NC0445832	Autoclave and store at RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648463	Store at RT