Un método de homogeneización rápido, simple y estandarizado para preparar emulsiones de antígeno/adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune experimental

Resumen

Para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo animal de esclerosis múltiple, los ratones son inmunizados con una emulsión de agua en aceite que contiene un autoantígeno y un adyuvante completo de Freund. Si bien existen varios protocolos para la preparación de estas emulsiones, aquí se presenta un protocolo de homogeneización rápido, simple y estandarizado para la preparación de emulsiones.

Resumen

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) comparte características inmunológicas y clínicas similares con la esclerosis múltiple (EM) y, por lo tanto, se usa ampliamente como modelo para identificar nuevos objetivos farmacológicos para un mejor tratamiento del paciente. La EM se caracteriza por varios cursos diferentes de la enfermedad: EM recurrente-remitente (EMRR), EM progresiva primaria (EMPP), EM progresiva secundaria (EMSP) y una forma rara de EM progresiva-recurrente (EMPR). Aunque los modelos animales no imitan con precisión todos estos fenotipos contrastantes de enfermedades humanas, existen modelos EAE que reflejan algunas de las diferentes manifestaciones clínicas de la EM. Por ejemplo, la EAE inducida por la glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG) en ratones C57BL / 6J imita la EMPP humana, mientras que la EAE inducida por la proteína proteolípida de mielina (PLP) en ratones SJL / J se asemeja a RRMS. Otros autoantígenos, como la proteína básica de mielina (MBP), y una serie de cepas de ratón diferentes también se utilizan para estudiar la EAE. Para inducir la enfermedad en estos modelos EAE de autoinmunización con antígenos, se prepara una emulsión de agua en aceite y se inyecta por vía subcutánea. La mayoría de los modelos de EAE también requieren una inyección de toxina pertussis para que la enfermedad se desarrolle. Para una inducción EAE consistente y reproducible, es necesario un protocolo detallado para preparar los reactivos para producir emulsiones antígeno/adyuvantes. El método descrito aquí aprovecha un método estandarizado para generar emulsiones de agua en aceite. Es simple y rápido y utiliza un homogeneizador agitador en lugar de jeringas para preparar emulsiones de calidad controlada.

Introducción

Una ruptura de la tolerancia inmunológica puede resultar en la generación de trastornos autoinmunes, como la esclerosis múltiple (EM). Se estima que 2,8 millones de personas viven con EM en todo el mundo¹. Aunque la causa exacta de la EM es todavía en gran parte desconocida, la desregulación de las células T y B autorreactivas, así como los defectos en la función Treg, juegan un papel importante en la patogénesis de la enfermedad ^2,3.

Los modelos animales de enfermedades autoinmunes son herramientas esenciales para investigar posibles modalidades terapéuticas. El modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE) ha sido utilizado durante casi un siglo por investigadores interesados en la EM⁴. En los primeros experimentos, la incidencia de la enfermedad era relativamente baja. La introducción del adyuvante completo de Freund (CFA), que contiene Mycobacterium y toxina pertussis, permitió la inducción consistente de EAE en ratones⁴. Lo más importante es que es necesario mezclar CFA con un antígeno específico del sistema nervioso central (SNC) para generar una emulsión homogénea de agua en aceite para inducir EAE. Los modelos EAE más comunes actualmente disponibles se basan en la inmunización activa de ratones con péptidos encefalitogénicos. Los antecedentes genéticos de los ratones juegan un papel importante en la susceptibilidad a la enfermedad, con péptidos de glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG_35-55) y proteína proteolípida de mielina (PLP_139-151) utilizados para inducir EAE en ratones C57BL / 6J y SJL, respectivamente⁵. Sin embargo, también se pueden usar otras cepas de ratón y péptidos derivados del SNC.

La calidad de la emulsión CFA/péptido es un factor crítico que determina la penetrancia de la enfermedad en el modelo⁶ de inmunización activa EAE. Se debe preparar una emulsión homogénea de agua en aceite mezclando los péptidos encefalitogénicos disueltos en tampón acuoso con CFA, de lo contrario los animales no desarrollarán la enfermedad. Se han publicado numerosos protocolos sobre la preparación de emulsiones CFA/péptidos. Los ejemplos incluyen el uso de un vórtice⁷, sonicación⁸, jeringas y un conector T de tres vías⁹, o una jeringa solo⁵. Sin embargo, todos estos métodos son difíciles de estandarizar y a menudo se asocian con protocolos largos y complicados.

En comparación con todos los métodos anteriores, el método simple descrito aquí para la preparación de emulsiones ofrece las ventajas de no tener diferencias de persona a persona y ser relativamente rápido. La emulsión es generada por un homogeneizador que agita los reactivos con una velocidad, tiempo y temperatura establecidos, asegurando resultados rápidos y consistentes. Además de inducir enfermedad en el modelo EAE, este método también puede ser utilizado para estudiar otros modelos de enfermedades autoinmunes como la artritis inducida por colágeno (CIA) y la artritis inducida por antígenos (AIA)⁶. Por lo tanto, se anticipa que este método puede ser utilizado para inducir consistentemente la enfermedad en otros modelos animales que dependen de emulsiones de agua en aceite con autoantígenos, como la neuritis autoinmune experimental (EAN)¹⁰, la tiroiditis autoinmune experimental (EAT)11, la uveítis autoinmune (EAU)12 y la miastenia gravis (MG)¹³. Este método también induce respuestas inmunes generales, como la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) de manera consistente⁶, y por lo tanto podría usarse para administrar vacunas contra el cáncer y la malaria (ver discusión).

Por lo tanto, se ha desarrollado un método rápido (tiempo total de preparación ~ 30 min), simple (todos los reactivos se pueden preparar y almacenar) y estandarizado (la emulsión se logra utilizando un homogeneizador de agitación) y se presenta aquí. Las emulsiones CFA/antígeno preparadas utilizando este protocolo inducen consistentemente la enfermedad en modelos animales autoinmunes.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las prácticas de la Junta Sueca de Investigación Animal y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal, Lund-Malmö, Suecia (Número de permiso: M126-16).

NOTA: En la figura 1 se describe un flujo esquemático del método.

1. Preparación del material

NOTA: Preparar todos los reactivos asépticamente en una campana estéril, y alícuota y almacenar a la temperatura indicada. Los reactivos se pueden almacenar hasta 2 años sin perder su efecto.

1. Prepare CFA que contenga 20 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis como se describe a continuación.
   1. Agregue 100 mg de M. tuberculosis H37RA liofilizada (consulte la Tabla de materiales) y cinco perlas de acero de 3,2 mm a un tubo de 7 ml (consulte la Tabla de materiales). Agite el tubo en un homogeneizador (consulte la Tabla de materiales) durante 60 s a la velocidad máxima (5.000 rpm).
   2. Añadir 5 ml de adyuvante de Freund incompleto (IFA) al tubo y agitar de nuevo durante 60 s a la velocidad más alta. Transfiera la suspensión de M. tuberculosis homogeneizada en IFA (ahora llamada CFA) a un tubo nuevo con una pipeta, dejando atrás las perlas, y guárdela a 4 °C hasta su uso.
2. Agregue agua ultrapura al polvo liofilizado del péptido MOG_35-55 (consulte la Tabla de materiales) para obtener una concentración final de péptidos de 10 mg / ml. Esterilizar la solución pasándola a través de un filtro de 0,2 μm. Preparar 60 μL de alícuotas y conservar a -20 °C hasta su uso.
   NOTA: El péptido MOG_35-55 utilizado para este experimento es de pureza ImmunoGrade (~70%), está escindido con TFA, se disuelve fácilmente en agua y contiene una amida C-terminal (-NH₂) para aumentar la estabilidad in vivo ¹⁴. Las alícuotas peptídicas nunca se descongelaron y volvieron a congelar más de dos veces, y se almacenaron a -20 °C hasta su uso.
3. Preparar 100 ml de tampón de toxina pertussis: Disolver 2,9 g de NaCl en 80 ml de 1x Ca 2+^{/Mg 2+} PBS libre y añadir 100 μL de Triton X-100 al 10%. Ajuste el volumen a 100 ml con PBS y esterilice la solución pasándola a través de un filtro de 0,2 μm. Preparar 10 ml de alícuotas y conservar a 4 °C hasta su uso.

2. Preparación de emulsiones CFA/péptidos

1. Calcule la cantidad de emulsión necesaria para la inmunización. En este protocolo estándar, cada ratón recibe 50 μg de péptido MOG_{35-55 y 300} μg de M. tuberculosis dispersos en el adyuvante de Freund (CFA). La cantidad de cada reactivo (péptido MOG_35-55 , PBS, CFA e IFA) requerida para preparar las emulsiones se puede calcular utilizando el Archivo Suplementario 1. Un 20% adicional de todos los reactivos, para compensar la pequeña pérdida de emulsión, se incluye en el cálculo.
   NOTA: El kit de emulsión comercial (ver Tabla de materiales) utilizado en este estudio comprende un tubo, tapón de rosca y un émbolo en una bolsa esterilizada. Cada tubo del kit de emulsión contiene un máximo de 9,6 ml, lo que permite preparar 8 jeringas de 1 ml suficientes para inmunizar a 40 ratones (u 80 ratones si se utilizan 100 μL de emulsión por animal).
2. Coloque el tubo tapado de rosca (del kit de emulsión comercial) y los reactivos que se utilizarán en hielo.
3. Agregue los componentes de la emulsión en el siguiente orden en los volúmenes calculados en el paso 2.1: PBS, luego el péptido, luego M. tuberculosis en CFA y finalmente IFA.
4. Cierre el tubo con la tapa firmemente apretándolo y aflojándolo varias veces. Agite el tubo vigorosamente durante 5-10 s a mano para mezclar previamente los reactivos.
5. Coloque el tubo en el homogeneizador de agitación y asegúrelo con la varilla. Ajuste la velocidad a la configuración más alta y el tiempo a 60 s. Una vez finalizada la carrera, coloque el tubo en hielo durante 3 minutos. Repita la ejecución una o dos veces más con la misma configuración.
6. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 1 min para eliminar el aire atrapado y compactar la emulsión.
7. Retire la tapa del tubo, inserte el émbolo en el tubo y empújelo lentamente hacia abajo hasta que llegue a la parte superior de la emulsión. Retire el cierre a presión en la parte inferior del tubo girándolo.
8. Retire el émbolo de una jeringa inyectable (1 ml; ver Tabla de materiales). Añadir una aguja (preferiblemente 25-27 G) a la jeringa de inyección.
9. Fije el extremo posterior de la jeringa de inyección a la cerradura dedicada en la parte inferior del tubo y bloquéelo con un giro corto.
10. Transfiera la emulsión del tubo a la jeringa de inyección empujando suavemente el émbolo. Deténgase cuando la emulsión alcance la graduación de 0,15 ml de la jeringa de inyección.
11. Separe la jeringa de inyección del tubo e inserte el émbolo cuidadosamente, teniendo cuidado de que no entre aire en la jeringa. Empuje el émbolo hasta que la emulsión salga de la aguja.
    NOTA: En este punto, parte de la emulsión se puede utilizar para el control de calidad (ver paso 3).
12. Repita los pasos 2.8-2.11 para el resto de la emulsión presente en el tubo.
    NOTA: Para minimizar el desperdicio de costosas emulsiones de CFA/antígeno, se deben usar jeringas de 1 ml. Se pueden usar otras jeringas que se ajusten a la cerradura dedicada en la parte inferior del tubo; sin embargo, puede ser necesario preparar un mayor volumen de emulsión. La emulsión peptídica CFA/MOG_35-55 puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 15 semanas sin perder su capacidad de inducción de EAE.

3. Control de calidad de la emulsión

1. Prueba de caída: Agregue una pequeña gota de la emulsión en un tubo cónico estéril de 50 ml lleno de 20 ml de agua fría. Cierre el tubo y agítelo con la mano durante un par de segundos. La aparición de pequeñas gotas distintas confirma la formación de una emulsión de agua en aceite.
2. Examine la emulsión utilizando microscopía de contraste de fase.
   1. Para analizar el tamaño de las partículas de agua en aceite, agregue una pequeña gota (2-3 μL) de la emulsión a un portaobjetos de microscopio, unte con un cubreobjetos y luego empuje con fuerza con un movimiento circular para aplanar la emulsión.
   2. Examine la emulsión manchada bajo un microscopio de contraste de fase (consulte la Tabla de materiales) con un aumento de 400x y concéntrese en un campo con una monocapa de la emulsión. Asegúrese de que las pequeñas partículas grises/blancas uniformes sean visibles (Figura 2A).
3. Analice el tamaño de partícula de la emulsión mediante difracción láser.
   NOTA: La difracción láser mide las distribuciones de tamaño de partícula utilizando un rayo láser. Esta es la prueba de control de calidad definitiva para emulsiones. Un resultado representativo de las distribuciones de tamaño de partícula utilizando el método descrito aquí se muestra en la Figura 2B (para una descripción detallada, ver Topping et ^al.6). Sin embargo, la prueba de gota y el examen con microscopio son suficientes para validar si se ha formado una emulsión satisfactoria.
   1. Establezca los índices de refracción para los láseres rojo y azul para el dispersante (consulte la Tabla de materiales) en 1.456 y para la muestra en 1.33 en el analizador de tamaño de partícula (consulte la Tabla de materiales). Establezca la absorbancia del índice de refracción en 0,02.
   2. Añadir una gota de la jeringa que contiene la emulsión peptídica a la unidad de dispersión que contiene aceite mineral ligero. Inicie la adquisición de datos instantáneamente después de la dispersión de la emulsión.
      NOTA: Se aplicó un modelo de propósito general, y se asumieron partículas esféricas, para la estimación de la distribución del tamaño de partícula.

4. Inducción EAE utilizando la emulsión peptídica MOG _35-55 en ratones C57BL6/J

NOTA: En todos los experimentos, se utilizaron cinco ratones hembra C57BL6 / J de 8-12 semanas de edad.

1. Antes de la inmunización, anestesiar a los ratones con isoflurano vaporizado al 2,5% y confirmar con un pellizco firme en el dedo del pie.
2. Inyecte cada ratón por vía subcutánea usando jeringas de 1 ml en dos sitios diferentes, en los lados derecho e izquierdo del flanco posterior con 200 μL de emulsión que contiene 50 μg de péptido MOG_35-55 en una proporción 1: 1 (v / v) de péptido / CFA.
3. Al menos 1,5 h después de la inmunización con la emulsión, y luego de nuevo después de 24 h, administrar un total de 80 ng de toxina Bordetella pertussis en 200 μL de tampón toxina pertussis a cada ratón, a través de inyecciones intraperitoneales (100 μL a la izquierda y 100 μL en el sitio derecho del vientre).
   NOTA: La localización precisa de la inyección intraperitoneal con toxina pertussis ha demostrado ser esencial para la activación de las células T en el ganglio linfático drenante¹⁵.
4. Opcional: Inyecte de nuevo el péptido MOG_35-55 el día 7 (como se utiliza en algunos protocolos¹⁶) repitiendo el paso 4.2.
   NOTA: Lo más importante es asegurarse de que las jeringas y agujas utilizadas para la inmunización que contienen MOG/CFA o toxina pertussis se desechen adecuadamente en bolsas/recipientes de riesgo biológico.
5. Evaluar la puntuación clínica diariamente, utilizando una escala de 0-6 como se describió anteriormente⁶.

Resultados

El protocolo rápido, simple y estandarizado para la preparación de emulsiones CFA/MOG se muestra en la Figura 1. Este método ha sido descrito recientemente en otra parte⁶. Las emulsiones CFA/MOG también se pueden preparar con otros métodos, como el método tradicional de jeringa o por vórtice. Estos métodos se compararon aquí evaluando la calidad de las emulsiones. Todos los métodos produjeron emulsiones de agua en aceite; La homogeneidad y la calidad de esta...

Discusión

Las emulsiones de agua en aceite, como el antígeno/adyuvante de Freund, se han utilizado durante más de medio siglo para inducir EAE¹⁷. Actualmente no existe un método estandarizado para preparar emulsiones de antígenos que sea independiente de la influencia humana. La mezcla manual con jeringas es estándar para la mayoría de los laboratorios, sin embargo, este método lleva mucho tiempo, a menudo resulta en una pérdida excesiva de material y la calidad difiere según el científico que lo ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Injection syringe	B. Braun	9166017V
1 mL Injection syringe	Sigma-Aldrich	Z683531
7 ml empty tubes with caps	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	7 mL tube
50 mL sterile centrifuge tube	Fisher Scientific	10788561	50 mL tube
Bordetella pertussis toxin	Sigma-Aldrich	P2980	Store at -20 °C
Dispersant, light mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Store at RT
Emulsion kit	Bertin-Instruments	D34200.10 ea	Containing a tube, cap, and plunger
Incomplete Freund's Adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Store at +4 °C
Mastersizer 2000	Malvern Panalytical	N/A	Particle size analyzer
Minilys-Personal homogenizer	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	Shaking homogenizer
MOG 35-55 Peptide	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	FDA-approved oil adjuvant
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm	Fisher Scientific	17124381	Sterlie filter
PBS, Ca2+/Mg2+ free	Thermo Fisher Scientific	14190144	PBS
Phase-Constrast Microscope	Olympus	BX40-B
Steel Beads 3.2 mm	Fisher Scientific	NC0445832	Autoclave and store at RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648463	Store at RT