Procédé d’homogénéisation rapide, simple et normalisé pour préparer des émulsions antigènes/adjuvants pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Résumé

Pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal de sclérose en plaques, les souris sont immunisées avec une émulsion eau dans huile contenant un autoantigène et un adjuvant de Freund complet. Bien qu’il existe plusieurs protocoles pour la préparation de ces émulsions, un protocole d’homogénéisation rapide, simple et standardisé pour la préparation de l’émulsion est présenté ici.

Résumé

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) partage des caractéristiques immunologiques et cliniques similaires à celles de la sclérose en plaques (SEP) et est donc largement utilisée comme modèle pour identifier de nouvelles cibles médicamenteuses pour un meilleur traitement des patients. La SEP se caractérise par plusieurs évolutions différentes de la maladie : la SEP cyclique (SEP-RR), la SEP progressive primaire (SPPP), la SEP progressive secondaire (SEP-SP) et une forme rare de SEP progressive-récurrente (SEP-PR). Bien que les modèles animaux n’imitent pas avec précision tous ces phénotypes de maladies humaines contrastées, il existe des modèles EAE qui reflètent certaines des différentes manifestations cliniques de la SEP. Par exemple, l’EAE induite par la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) chez les souris C57BL/6J imite la SPPP humaine, tandis que l’EAE induite par la protéine protéolipide de myéline (PLP) chez les souris SJL/J ressemble à la SEP-RR. D’autres autoantigènes, tels que la protéine basique de myéline (MBP), et un certain nombre de souches de souris différentes sont également utilisés pour étudier EAE. Pour induire la maladie dans ces modèles EAE d’auto-immunisation antigène, une émulsion eau dans huile est préparée et injectée par voie sous-cutanée. La majorité des modèles EAE nécessitent également une injection de toxine de la coqueluche pour que la maladie se développe. Pour une induction EAE cohérente et reproductible, un protocole détaillé pour préparer les réactifs à produire des émulsions antigènes/adjuvants est nécessaire. La méthode décrite ici tire parti d’une méthode standardisée pour générer des émulsions eau dans huile. Il est simple et rapide et utilise un homogénéisateur à agitation au lieu de seringues pour préparer des émulsions de qualité contrôlée.

Introduction

Une rupture de la tolérance immunologique peut entraîner la génération de maladies auto-immunes, telles que la sclérose en plaques (SEP). On estime que 2,8 millions de personnes vivent avec la SEP dans le monde¹. Bien que la cause exacte de la SEP soit encore largement inconnue, la dérégulation des cellules T et B autoréactives, ainsi que les défauts de la fonction Treg, jouent un rôle important dans la pathogenèse de la maladie ^2,3.

Les modèles animaux de maladies auto-immunes sont des outils essentiels pour étudier les modalités thérapeutiques potentielles. Le modèle expérimental d’encéphalomyélite auto-immune (EAE) est utilisé depuis près d’un siècle par les chercheurs qui s’intéressent à la SEP⁴. Dans les premières expériences, l’incidence de la maladie était relativement faible. L’introduction de l’adjuvant de Freund complet (CFA), contenant Mycobacterium et la toxine de la coqueluche, a permis l’induction constante de l’EAE chez la souris⁴. Plus important encore, il est nécessaire de mélanger le CFA avec un antigène spécifique du système nerveux central (SNC) pour générer une émulsion homogène eau dans huile pour induire EAE. Les modèles EAE les plus courants actuellement disponibles sont basés sur l’immunisation active de souris avec des peptides encéphalitogènes. Le fond génétique des souris joue un rôle important dans la susceptibilité à la maladie, avec les peptides de la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG_35-55) et de la protéine protéolipide de myéline (PLP_139-151) utilisés pour induire EAE chez les souris C57BL / 6J et SJL, respectivement⁵. Cependant, d’autres souches de souris et des peptides dérivés du SNC peuvent également être utilisés.

La qualité de l’émulsion CFA/peptide est un facteur critique qui détermine la pénétrance de la maladie dans l’immunisation active EAE modèle⁶. Une émulsion homogène eau dans huile doit être préparée en mélangeant les peptides encéphalitogènes dissous dans un tampon aqueux avec du CFA, sinon les animaux ne développeront pas la maladie. De nombreux protocoles ont été publiés sur la préparation des émulsions CFA/peptides. Les exemples incluent l’utilisation d’un vortex⁷, de la sonication⁸, de seringues et d’un connecteur T à trois voies⁹, ou d’une seringue seulement⁵. Cependant, toutes ces méthodes sont difficiles à normaliser et sont souvent associées à des protocoles longs et compliqués.

Par rapport à toutes les méthodes ci-dessus, la méthode simple décrite ici pour la préparation de l’émulsion offre les avantages de ne pas avoir de différences de personne à personne et d’être relativement rapide. L’émulsion est générée par un homogénéisateur secouant les réactifs avec une vitesse, un temps et une température définis, assurant des résultats rapides et cohérents. En plus d’induire la maladie dans le modèle EAE, cette méthode peut également être utilisée pour étudier d’autres modèles de maladies auto-immunes telles que l’arthrite induite par le collagène (ICA) et l’arthrite induite par l’antigène (AIA)⁶. Par conséquent, on s’attend à ce que cette méthode puisse être utilisée pour induire systématiquement la maladie dans d’autres modèles animaux qui dépendent d’émulsions eau-dans-huile avec des autoantigènes, tels que la névrite auto-immune expérimentale (EAN)¹⁰, la thyroïdite auto-immune expérimentale (EAT)11, l’uvéite auto-immune (EAU)12 et la myasthénie grave (MG)¹³. Cette méthode induit également des réponses immunitaires générales telles que l’hypersensibilité de type retardé (DTH) de manière constante⁶, et pourrait donc être utilisée pour administrer des vaccins anticancéreux et antipaludiques (voir discussion).

Ainsi, une méthode rapide (temps de préparation total ~30 min), simple (tous les réactifs peuvent être préparés à l’avance et stockés) et standardisée (l’émulsion est réalisée à l’aide d’un homogénéisateur agité) a été développée et est présentée ici. Les émulsions CFA/antigène préparées à l’aide de ce protocole induisent systématiquement la maladie dans des modèles animaux auto-immuns.

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux pratiques du Conseil suédois de la recherche animale et ont été approuvées par le Comité d’éthique animale, Lund-Malmö, Suède (numéro de permis: M126-16).

Remarque : Un flux schématique de la méthode est décrit à la figure 1.

1. Préparation du matériel

NOTE: Préparer tous les réactifs de manière aseptique dans une hotte stérile, et aliquote et conserver à la température indiquée. Les réactifs peuvent être conservés jusqu’à 2 ans sans perdre leur effet.

1. Préparer le CFA contenant 20 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis comme décrit ci-dessous.
   1. Ajouter 100 mg de M. tuberculosis H37RA lyophilisé (voir le tableau des matières) et cinq billes d’acier de 3,2 mm dans un tube de 7 ml (voir le tableau des matières). Agiter le tube dans un homogénéisateur (voir le tableau des matériaux) pendant 60 s à la vitesse la plus élevée (5 000 tr/min).
   2. Ajouter 5 mL d’adjuvant de Freund incomplet (IFA) dans le tube et agiter à nouveau pendant 60 s à la vitesse la plus élevée. Transférer la suspension de M. tuberculosis homogénéisée dans l’IFA (maintenant appelé CFA) dans un tube frais à l’aide d’une pipette, en laissant les billes derrière soi, et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
2. Ajouter de l’eau ultrapure à la poudre lyophilisée de peptide MOG_35-55 (voir le tableau des matières) pour obtenir une concentration finale de peptide de 10 mg/mL. Stérilisez la solution en la faisant passer à travers un filtre de 0,2 μm. Préparer des aliquotes de 60 μL et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
   REMARQUE: Le peptide MOG_35-55 utilisé pour cette expérience est d’une pureté immunograde (~ 70%), est clivé par TFA, se dissout facilement dans l’eau et contient un amide C-terminal (-NH₂) pour augmenter la stabilité in vivo ¹⁴. Les aliquotes peptidiques n’ont jamais été décongelées et recongelées plus de deux fois, et ont été conservées à -20 °C jusqu’à utilisation.
3. Préparer 100 mL de tampon de toxine anticoquelucheuse : Dissoudre 2,9 g de NaCl dans 80 mL de 1x PBS libre de Ca 2+^/Mg²⁺ et ajouter 100 μL de Triton X-100 à 10 %. Régler le volume à 100 mL avec du PBS et stériliser la solution en la faisant passer à travers un filtre de 0,2 μm. Préparer des aliquotes de 10 mL et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.

2. Préparation des émulsions CFA/peptides

1. Calculer la quantité d’émulsion nécessaire à l’immunisation. Dans ce protocole standard, chaque souris reçoit 50 μg de peptide MOG_{35-55 et 300} μg de M. tuberculosis dispersés dans l’adjuvant de Freund (CFA). La quantité de chaque réactif (peptide MOG_35-55 , PBS, CFA et IFA) nécessaire à la préparation des émulsions peut être calculée à l’aide du fichier supplémentaire 1. Un supplément de 20% de tous les réactifs, pour compenser la faible perte d’émulsion, est inclus dans le calcul.
   REMARQUE : La trousse d’émulsion commerciale (voir le tableau des matériaux) utilisée dans cette étude comprend un tube, un bouchon à vis et un piston dans une poche stérilisée. Chaque tube de la trousse d’émulsion contient un maximum de 9,6 mL, ce qui permet de préparer 8 seringues de 1 mL suffisantes pour immuniser 40 souris (ou 80 souris si l’on utilise 100 μL d’émulsion par animal).
2. Placez le tube à vis (du kit d’émulsion commerciale) et les réactifs à utiliser sur la glace.
3. Ajouter les composants de l’émulsion dans l’ordre suivant dans les volumes calculés à l’étape 2.1 : PBS, puis le peptide, puis M. tuberculosis dans le CFA, et enfin l’IFA.
4. Fermez fermement le tube avec le capuchon en le serrant et en le desserrant plusieurs fois. Agiter vigoureusement le tube pendant 5-10 s à la main pour prémélanger les réactifs.
5. Placez le tube dans l’homogénéisateur secouant et fixez-le avec la tige. Réglez la vitesse sur le réglage le plus élevé et le temps sur 60 s. Une fois la course terminée, placez le tube sur la glace pendant 3 min. Répétez l’exécution une ou deux fois de plus avec les mêmes paramètres.
6. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 1 min pour éliminer l’air emprisonné et compacter l’émulsion.
7. Retirez le capuchon du tube, insérez le piston dans le tube et poussez-le lentement jusqu’à ce qu’il atteigne le sommet de l’émulsion. Retirez la fermeture à pression au fond du tube en la tordant.
8. Retirer le piston d’une seringue d’injection (1 mL; voir le tableau des matières). Ajouter une aiguille (de préférence 25-27 G) à la seringue d’injection.
9. Fixez l’extrémité arrière de la seringue d’injection à la serrure dédiée au bas du tube et verrouillez-la avec une courte torsion.
10. Transférer l’émulsion du tube à la seringue d’injection en poussant doucement le piston. Arrêtez-vous lorsque l’émulsion atteint la graduation de 0,15 mL de la seringue d’injection.
11. Séparez la seringue d’injection du tube et insérez le piston avec précaution, en veillant à ce qu’aucun air ne pénètre dans la seringue. Poussez le piston jusqu’à ce que l’émulsion sorte de l’aiguille.
    Remarque : À ce stade, une partie de l’émulsion peut être utilisée pour le contrôle qualité (voir étape 3).
12. Répétez les étapes 2.8-2.11 pour le reste de l’émulsion présente dans le tube.
    REMARQUE: Pour minimiser le gaspillage d’émulsions CFA/antigène coûteuses, des seringues de 1 mL doivent être utilisées. D’autres seringues qui s’adaptent à la serrure dédiée au fond du tube peuvent être utilisées; Cependant, un plus grand volume d’émulsion peut devoir être préparé. L’émulsion peptidique CFA/MOG_35-55 peut être conservée à 4 °C jusqu’à 15 semaines sans perdre sa capacité induisant l’EAE.

3. Contrôle de la qualité de l’émulsion

1. Drop-test : Ajouter une petite goutte de l’émulsion dans un tube conique stérile de 50 mL rempli de 20 mL d’eau froide. Fermez le tube et secouez-le à la main pendant quelques secondes. L’apparition de minuscules gouttelettes distinctes confirme la formation d’une émulsion eau dans huile.
2. Examiner l’émulsion à l’aide de la microscopie à contraste de phase.
   1. Pour analyser la taille des particules eau dans huile, ajoutez une minuscule goutte (2-3 μL) de l’émulsion à une lame de microscope, enduisez-la avec un couvercle, puis poussez fort dans un mouvement circulaire pour aplatir l’émulsion.
   2. Examinez l’émulsion étalée au microscope à contraste de phase (voir Tableau des matériaux) avec un grossissement de 400x et concentrez-vous sur un champ avec une monocouche de l’émulsion. S’assurer que les petites particules grises/blanches uniformes sont visibles (figure 2A).
3. Analyser la taille des particules de l’émulsion à l’aide de la diffraction laser.
   REMARQUE: La diffraction laser mesure les distributions granulométriques à l’aide d’un faisceau laser. Il s’agit du test de contrôle de qualité ultime pour les émulsions. Un résultat représentatif des distributions granulométriques utilisant la méthode décrite ici est présenté à la figure 2B (pour une description détaillée, voir Topping et ^al.6). Néanmoins, l’essai de chute et l’examen au microscope sont suffisants pour valider si une émulsion satisfaisante a été formée.
   1. Réglez les indices de réfraction pour les lasers rouge et bleu pour le dispersant (voir le tableau des matériaux) à 1,456 et pour l’échantillon à 1,33 sur l’analyseur granulométrique (voir le tableau des matériaux). Réglez l’absorbance de l’indice de réfraction sur 0,02.
   2. Ajouter une goutte de la seringue contenant l’émulsion peptidique à l’unité de dispersion contenant de l’huile minérale légère. Démarrez l’acquisition des données instantanément après la dispersion de l’émulsion.
      REMARQUE : Un modèle à usage général a été appliqué, et des particules sphériques ont été supposées, pour l’estimation de la distribution granulométrique.

4. Induction EAE à l’aide de l’émulsion peptidique MOG _35-55 chez des souris C57BL6/J

NOTE: Dans toutes les expériences, cinq souris femelles C57BL6 / J âgées de 8 à 12 semaines ont été utilisées.

1. Avant l’immunisation, anesthésier les souris à l’aide d’isoflurane vaporisé à 2,5 % et confirmer à l’aide d’un pincement ferme des orteils.
2. Injecter chaque souris par voie sous-cutanée à l’aide de seringues de 1 mL dans deux sites différents, sur les côtés droit et gauche du flanc postérieur, avec 200 μL d’émulsion contenant 50 μg de peptide MOG_35-55 dans un rapport 1:1 (v/v) peptide/CFA.
3. Au moins 1,5 h après l’immunisation avec l’émulsion, puis de nouveau après 24 h, administrer un total de 80 ng de toxine Bordetella pertussis dans 200 μL de tampon de toxine coqueluche à chaque souris, par injections intrapéritonéales (100 μL à gauche et 100 μL à droite du ventre).
   NOTE: La localisation précise de l’injection intrapéritonéale avec la toxine de la coqueluche s’est avérée essentielle pour l’activation des lymphocytes T dans le ganglion lymphatique drainant¹⁵.
4. Facultatif : Injectez à nouveau le peptide MOG_35-55 le jour 7 (tel qu’utilisé dans certains protocoles¹⁶) en répétant l’étape 4.2.
   REMARQUE : Plus important encore, assurez-vous que les seringues et les aiguilles utilisées pour l’immunisation contenant du MOG/CFA ou de la toxine de la coqueluche sont éliminées adéquatement dans des sacs/contenants présentant un risque biologique.
5. Évaluer le score clinique quotidiennement, en utilisant une échelle de 0 à 6 comme décrit précédemment⁶.

Résultats

Le protocole rapide, simple et normalisé pour la préparation des émulsions CFA/MOG est illustré à la figure 1. Cette méthode a récemment été décrite ailleurs⁶. Les émulsions CFA/MOG peuvent également être préparées avec d’autres méthodes, telles que la méthode traditionnelle de seringue ou par vortex. Ces méthodes ont été comparées ici en évaluant la qualité des émulsions. Toutes les méthodes ont produit des émulsions eau dans huile; L’ho...

Discussion

Les émulsions eau-dans-huile, telles que l’antigène/adjuvant de Freund, sont utilisées depuis plus d’un demi-siècle pour induire EAE¹⁷. Il n’existe actuellement aucune méthode normalisée pour préparer des émulsions d’antigènes indépendante de l’influence humaine. Le mélange manuel à l’aide de seringues est standard pour la plupart des laboratoires, mais cette méthode prend du temps, entraîne souvent une perte excessive de matériel et la qualité diffère selon le scienti...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Injection syringe	B. Braun	9166017V
1 mL Injection syringe	Sigma-Aldrich	Z683531
7 ml empty tubes with caps	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	7 mL tube
50 mL sterile centrifuge tube	Fisher Scientific	10788561	50 mL tube
Bordetella pertussis toxin	Sigma-Aldrich	P2980	Store at -20 °C
Dispersant, light mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Store at RT
Emulsion kit	Bertin-Instruments	D34200.10 ea	Containing a tube, cap, and plunger
Incomplete Freund's Adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Store at +4 °C
Mastersizer 2000	Malvern Panalytical	N/A	Particle size analyzer
Minilys-Personal homogenizer	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	Shaking homogenizer
MOG 35-55 Peptide	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	FDA-approved oil adjuvant
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm	Fisher Scientific	17124381	Sterlie filter
PBS, Ca2+/Mg2+ free	Thermo Fisher Scientific	14190144	PBS
Phase-Constrast Microscope	Olympus	BX40-B
Steel Beads 3.2 mm	Fisher Scientific	NC0445832	Autoclave and store at RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648463	Store at RT