Um método de homogeneização rápido, simples e padronizado para preparar emulsões de antígenos/adjuvantes para induzir encefalomielite autoimune experimental

Resumo

Para induzir encefalomielite autoimune experimental, um modelo animal de esclerose múltipla, os ratos são imunizados com uma emulsão de água em óleo contendo um autoantígeno e adjuvante completo de Freund. Embora existam vários protocolos para a preparação dessas emulsões, um protocolo de homogeneização rápido, simples e padronizado para a preparação de emulsões é apresentado aqui.

Resumo

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) compartilha características imunológicas e clínicas semelhantes com a esclerose múltipla (EM) e, portanto, é amplamente utilizada como modelo para identificar novos alvos de medicamentos para um melhor tratamento do paciente. A EM é caracterizada por vários cursos diferentes da doença: EM remitente-recorrente (EMRR), EM progressiva primária (EMPP), EM progressiva secundária (EMSP) e uma forma rara de EM progressiva-recidivante (EMPR). Embora os modelos animais não imitem com precisão todos esses fenótipos contrastantes de doenças humanas, existem modelos EAE que refletem algumas das diferentes manifestações clínicas da EM. Por exemplo, o EAE induzido por glicoproteína oligodendrócitos de mielina (MOG) em camundongos C57BL/6J imita PPMS humanos, enquanto o EAE induzido por proteína proteolipídica (PLP) de mielina em camundongos SJL/J se assemelha ao RRMS. Outros autoantígenos, como a proteína básica de mielina (MBP) e várias cepas diferentes de camundongos também são usados para estudar EAE. Para induzir a doença nesses modelos EAE de imunização de autoantígenos, uma emulsão de água em óleo é preparada e injetada por via subcutânea. A maioria dos modelos EAE também requer uma injeção de toxina pertussis para que a doença se desenvolva. Para uma indução consistente e reprodutível de EAE, é necessário um protocolo detalhado para preparar os reagentes para produzir emulsões de antígeno/adjuvante. O método descrito aqui aproveita um método padronizado para gerar emulsões de água em óleo. É simples e rápido e usa um homogeneizador de agitação em vez de seringas para preparar emulsões de qualidade controlada.

Introdução

Uma quebra da tolerância imunológica pode resultar na geração de distúrbios autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). Estima-se que 2,8 milhões de pessoas vivam com EM em todo o mundo¹. Embora a causa exata da SM ainda seja amplamente desconhecida, a desregulação das células T e B auto-reativas, bem como defeitos na função Treg, desempenham papéis importantes na patogênese da doença ^2,3.

Modelos animais de doenças autoimunes são ferramentas essenciais para investigar possíveis modalidades terapêuticas. O modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE) tem sido usado por quase um século por pesquisadores interessados na EM⁴. Nos primeiros experimentos, a incidência da doença era relativamente baixa. A introdução do adjuvante de Freund completo (CFA), contendo Mycobacterium e toxina pertussis, possibilitou a indução consistente de EAE em camundongos⁴. Mais importante ainda, é necessário misturar CFA com um antígeno específico do sistema nervoso central (SNC) para gerar uma emulsão homogênea de água em óleo para induzir EAE. Os modelos de EAE mais comuns atualmente disponíveis são baseados na imunização ativa de camundongos com peptídeos encefalitogênicos. O fundo genético dos camundongos desempenha um papel importante na suscetibilidade à doença, com peptídeos glicoproteína oligodendrócitos de mielina (MOG_35-55) e proteína proteolipídica de mielina (PLP_139-151) usados para induzir EAE em camundongos C57BL/6J e SJL, respectivamente⁵. No entanto, outras cepas de camundongos e peptídeos derivados do SNC também podem ser usados.

A qualidade da emulsão CFA/peptídeo é um fator crítico que determina a penetrância da doença no modelo 6 de imunização ativa^EAE. Uma emulsão homogênea de água em óleo deve ser preparada misturando os peptídeos encefalitogênicos dissolvidos em tampão aquoso com CFA, caso contrário, os animais não desenvolverão a doença. Numerosos protocolos foram publicados sobre a preparação de emulsões CFA/peptídicas. Exemplos incluem o uso de um vórtice⁷, sonicação⁸, seringas e um conector T de três vias⁹, ou uma seringa apenas⁵. No entanto, todos esses métodos são difíceis de padronizar e são frequentemente associados a protocolos longos e complicados.

Em comparação com todos os métodos acima, o método simples descrito aqui para a preparação da emulsão oferece as vantagens de não ter diferenças de pessoa para pessoa e ser relativamente rápido. A emulsão é gerada por um homogeneizador agitando os reagentes com uma velocidade, tempo e temperatura definidos, garantindo resultados rápidos e consistentes. Além de induzir a doença no modelo EAE, esse método também pode ser utilizado para estudar outros modelos de doenças autoimunes, como a artrite induzida por colágeno (CIA) e a artrite induzida por antígeno (AIA)⁶. Portanto, espera-se que esse método possa ser utilizado para induzir consistentemente a doença em outros modelos animais que dependem de emulsões de água em óleo com autoantígenos, como neurite autoimune experimental (EAN)¹⁰, tireoidite autoimune experimental (EAT)11, uveíte autoimune (EAU)12 e miastenia gravis (MG)¹³. Esse método também induz respostas imunes gerais, como hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) de forma consistente⁶ e, portanto, poderia ser usado para administrar vacinas contra câncer e malária (ver discussão).

Assim, um método rápido (tempo total de preparação ~ 30 min), simples (todos os reagentes podem ser preparados com antecedência e armazenados) e padronizado (a emulsão é realizada usando um homogeneizador de agitação) foi desenvolvido e é apresentado aqui. As emulsões CFA/antígeno preparadas usando este protocolo induzem consistentemente a doença em modelos animais autoimunes.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as práticas do Conselho Sueco de Pesquisa Animal e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal de Lund-Malmö, Suécia (número de permissão: M126-16).

Observação : um fluxo esquemático do método é descrito na Figura 1.

1. Preparação do material

NOTA: Preparar todos os reagentes assepticamente num exaustor estéril, alíquota e conservar à temperatura indicada. Os reagentes podem ser armazenados até 2 anos sem perder o seu efeito.

1. Prepare CFA contendo 20 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis conforme descrito abaixo.
   1. Adicionar 100 mg de M. tuberculosis H37RA liofilizado (ver Tabela de Materiais) e cinco esferas de aço de 3,2 mm a um tubo de 7 ml (ver Tabela de Materiais). Agite o tubo em um homogeneizador (consulte Tabela de materiais) por 60 s na configuração de velocidade mais alta (5.000 rpm).
   2. Adicione 5 mL de adjuvante de Freund (IFA) incompleto ao tubo e agite novamente por 60 s na velocidade mais alta. Transfira a pasta de M. tuberculosis homogeneizada em IFA (agora denominada CFA) para um tubo fresco com uma pipeta, deixando as contas para trás, e armazene a 4 °C até o uso.
2. Adicionar água ultrapura ao pó liofilizado do péptido MOG_35-55 (ver Tabela de Materiais) para obter uma concentração final de péptido de 10 mg/ml. Esterilizar a solução passando-a através de um filtro de 0,2 μm. Preparar alíquotas de 60 μL e conservar a -20 °C até à utilização.
   NOTA: O peptídeo MOG_35-55 utilizado para este experimento é de pureza ImmunoGrade (~70%), é clivado em TFA, dissolve-se facilmente em água e contém uma amida C-terminal (-NH₂) para aumentar a estabilidade in vivo ¹⁴. As alíquotas peptídicas nunca foram descongeladas e recongeladas mais de duas vezes, sendo armazenadas a -20 °C até o uso.
3. Preparar 100 mL de tampão toxina pertussis: Dissolva 2,9 g de NaCl em 80 mL de PBS livre de 1x Ca 2+^/Mg²⁺ e adicione 100 μL de Triton X-100 a 10%. Ajustar o volume para 100 ml com PBS e esterilizar a solução passando-a através de um filtro de 0,2 μm. Preparar alíquotas de 10 ml e conservar a 4 °C até à utilização.

2. Preparação de emulsões CFA/peptídicas

1. Calcule a quantidade de emulsão necessária para a imunização. Neste protocolo padrão, cada camundongo recebe 50 μg de peptídeo MOG_{35-55 e 300} μg de M. tuberculosis dispersos no adjuvante de Freund (CFA). A quantidade de cada reagente (peptídeo MOG_35-55 , PBS, CFA e IFA) necessária para a preparação das emulsões pode ser calculada usando o Arquivo Suplementar 1. Um adicional de 20% de todos os reagentes, para compensar a pequena perda de emulsão, é incluído no cálculo.
   NOTA: O kit de emulsão comercial (ver Tabela de Materiais) utilizado neste estudo compreende um tubo, uma tampa de rosca e um êmbolo numa bolsa esterilizada. Cada tubo do kit de emulsão contém um máximo de 9,6 mL, tornando possível preparar seringas de 8 x 1 mL suficientes para imunizar 40 camundongos (ou 80 camundongos se usarem 100 μL de emulsão por animal).
2. Coloque o tubo tampado por parafuso (do kit de emulsão comercial) e os reagentes a serem usados no gelo.
3. Adicione os componentes da emulsão na seguinte ordem nos volumes calculados na etapa 2.1: PBS, depois o peptídeo, depois M. tuberculosis em CFA e, finalmente, IFA.
4. Feche o tubo com a tampa firme, apertando-o e soltando-o várias vezes. Agite o tubo vigorosamente por 5-10 s à mão para pré-misturar os reagentes.
5. Coloque o tubo no homogeneizador de agitação e prenda-o com a haste. Defina a velocidade para a configuração mais alta e o tempo para 60 s. Quando a corrida terminar, coloque o tubo no gelo por 3 min. Repita a execução mais uma ou duas vezes com as mesmas configurações.
6. Centrifugar o tubo a 300 x g durante 1 min para remover o ar preso e compactar a emulsão.
7. Remova a tampa do tubo, insira o êmbolo no tubo e empurre-o lentamente para baixo até atingir o topo da emulsão. Remova o fecho de encaixe na parte inferior do tubo torcendo-o.
8. Remova o êmbolo de uma seringa de injeção (1 ml; ver Tabela de Materiais). Adicione uma agulha (de preferência 25-27 G) à seringa de injeção.
9. Ligue a extremidade traseira da seringa de injeção à fechadura dedicada na parte inferior do tubo e bloqueie-a com uma torção curta.
10. Transfira a emulsão do tubo para a seringa de injeção, empurrando o êmbolo suavemente. Pare quando a emulsão atingir a graduação de 0,15 ml da seringa de injeção.
11. Separe a seringa de injeção do tubo e insira o êmbolo com cuidado, tomando cuidado para que nenhum ar entre na seringa. Empurre o êmbolo até que a emulsão saia da agulha.
    NOTA: Neste ponto, parte da emulsão pode ser usada para controle de qualidade (consulte a etapa 3).
12. Repita os passos 2.8-2.11 para o resto da emulsão presente no tubo.
    NOTA: Para minimizar o desperdício de emulsões caras de CFA/antígeno, seringas de 1 mL devem ser usadas. Podem ser utilizadas outras seringas que se ajustem à fechadura dedicada no fundo do tubo; no entanto, um volume maior de emulsão pode precisar ser preparado. A emulsão peptídica CFA/MOG_35-55 pode ser armazenada a 4 °C por até 15 semanas sem perder sua capacidade indutora de EAE.

3. Controle de qualidade da emulsão

1. Drop-test: Adicione uma pequena gota da emulsão em um tubo cônico estéril de 50 mL preenchido com 20 mL de água fria. Feche o tubo e agite-o com a mão por alguns segundos. O aparecimento de minúsculas gotículas distintas confirma a formação de uma emulsão de água em óleo.
2. Examine a emulsão usando microscopia de contraste de fase.
   1. Para analisar o tamanho das partículas de água em óleo, adicione uma pequena gota (2-3 μL) da emulsão a uma lâmina de microscópio, espalhe-a com um deslizamento de tampa e, em seguida, empurre com força em um movimento circular para achatar a emulsão.
   2. Examine a emulsão manchada sob um microscópio de contraste de fase (consulte Tabela de materiais) com ampliação de 400x e concentre-se em um campo com uma monocamada da emulsão. Certifique-se de que pequenas partículas cinza/brancas uniformes estejam visíveis (Figura 2A).
3. Analise o tamanho da partícula da emulsão usando difração a laser.
   NOTA: A difração a laser mede as distribuições de tamanho de partícula usando um feixe de laser. Este é o melhor teste de controle de qualidade para emulsões. Um resultado representativo das distribuições de tamanho de partícula usando o método descrito aqui é mostrado na Figura 2B (para uma descrição detalhada, ver Topping et ^al.6). No entanto, o teste de gota e o exame microscópio são suficientes para validar se uma emulsão satisfatória foi formada.
   1. Defina os índices de refração para os lasers vermelho e azul para o dispersante (ver Tabela de Materiais) para 1,456 e para a amostra para 1,33 no analisador de tamanho de partícula (ver Tabela de Materiais). Defina a absorvância do índice de refração para 0,02.
   2. Adicionar uma gota da seringa que contém a emulsão peptídica à unidade de dispersão que contém óleo mineral leve. Inicie a aquisição de dados instantaneamente após a dispersão da emulsão.
      NOTA: Um modelo de uso geral foi aplicado, e partículas esféricas foram assumidas, para a estimativa da distribuição do tamanho das partículas.

4. Indução de EAE usando a emulsão peptídica MOG _35-55 em camundongos C57BL6/J

NOTA: Em todos os experimentos, cinco camundongos C57BL6/J fêmeas de 8-12 semanas de idade foram utilizados.

1. Antes da imunização, anestesiar os ratos usando isoflurano vaporizado a 2,5% e confirmar usando uma pitada firme do dedo do pé.
2. Injetar cada rato por via subcutânea utilizando seringas de 1 ml em dois locais diferentes, nos lados direito e esquerdo do flanco posterior com 200 μL de emulsão contendo 50 μg de péptido MOG_35-55 numa proporção de 1:1 (v/v) de péptido/CFA.
3. Pelo menos 1,5 h após a imunização com a emulsão, e depois novamente após 24 h, administrar um total de 80 ng de toxina Bordetella pertussis em 200 μL de tampão de toxina pertussis a cada rato, através de injeções intraperitoneais (100 μL à esquerda e 100 μL no local direito da barriga).
   NOTA: A localização precisa da injeção intraperitoneal com toxina pertussis tem se mostrado essencial para a ativação de células T no linfonodo drenante¹⁵.
4. Opcional: Injete o peptídeo MOG_35-55 novamente no dia 7 (como usado em alguns protocolos¹⁶) repetindo a etapa 4.2.
   NOTA: Mais importante ainda, certifique-se de que as seringas e agulhas usadas para imunização contendo MOG / CFA ou toxina pertussis sejam adequadamente descartadas em sacos/recipientes de risco biológico.
5. Avaliar o escore clínico diariamente, utilizando uma escala de 0 a 6 conforme descrito anteriormente⁶.

Resultados

O protocolo rápido, simples e padronizado para a preparação de emulsões CFA/MOG está representado na Figura 1. Este método foi recentemente descrito em outro lugar⁶. As emulsões CFA/MOG também podem ser preparadas com outros métodos, como o método tradicional da seringa ou por vórtice. Esses métodos foram comparados aqui avaliando a qualidade das emulsões. Todos os métodos produziram emulsões de água em óleo; a homogeneidade e a qualidade dessas emuls...

Discussão

Emulsões de água em óleo, como o antígeno/adjuvante de Freund, têm sido usadas por mais de meio século para induzir EAE¹⁷. Atualmente, não existe um método padronizado para preparar emulsões de antígenos que seja independente da influência humana. A mistura manual usando seringas é padrão para a maioria dos laboratórios, no entanto, este método é demorado, muitas vezes resulta em uma perda excessiva de material, e a qualidade difere dependendo do cientista que o prepara.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Injection syringe	B. Braun	9166017V
1 mL Injection syringe	Sigma-Aldrich	Z683531
7 ml empty tubes with caps	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	7 mL tube
50 mL sterile centrifuge tube	Fisher Scientific	10788561	50 mL tube
Bordetella pertussis toxin	Sigma-Aldrich	P2980	Store at -20 °C
Dispersant, light mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Store at RT
Emulsion kit	Bertin-Instruments	D34200.10 ea	Containing a tube, cap, and plunger
Incomplete Freund's Adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Store at +4 °C
Mastersizer 2000	Malvern Panalytical	N/A	Particle size analyzer
Minilys-Personal homogenizer	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	Shaking homogenizer
MOG 35-55 Peptide	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	FDA-approved oil adjuvant
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm	Fisher Scientific	17124381	Sterlie filter
PBS, Ca2+/Mg2+ free	Thermo Fisher Scientific	14190144	PBS
Phase-Constrast Microscope	Olympus	BX40-B
Steel Beads 3.2 mm	Fisher Scientific	NC0445832	Autoclave and store at RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648463	Store at RT