Un metodo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per preparare emulsioni antigene/adiuvanti per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Riepilogo

Per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale, un modello animale di sclerosi multipla, i topi vengono immunizzati con un'emulsione acqua-in-olio contenente un autoantigene e un adiuvante completo di Freund. Mentre esistono diversi protocolli per la preparazione di queste emulsioni, qui viene presentato un protocollo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per la preparazione dell'emulsione.

Abstract

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) condivide caratteristiche immunologiche e cliniche simili alla sclerosi multipla (SM) ed è quindi ampiamente utilizzata come modello per identificare nuovi bersagli farmacologici per un migliore trattamento del paziente. La SM è caratterizzata da diversi decorsi di malattia: SM recidivante-remittente (SMRR), SM primaria progressiva (SMPP), SM secondaria progressiva (SPMS) e una rara forma progressiva-recidivante di SM (PRMS). Sebbene i modelli animali non imitino accuratamente tutti questi fenotipi contrastanti di malattia umana, ci sono modelli EAE che riflettono alcune delle diverse manifestazioni cliniche della SM. Ad esempio, l'EAE indotto dalla glicoproteina oligodendrocitaria mielina (MOG) nei topi C57BL / 6J imita la SMPP umana, mentre l'EAE indotto dalla proteina proteolipidica della mielina (PLP) nei topi SJL / J assomiglia alla SMRR. Altri autoantigeni, come la proteina basica della mielina (MBP), e un certo numero di diversi ceppi di topo sono anche usati per studiare EAE. Per indurre la malattia in questi modelli EAE di immunizzazione autoantigene, viene preparata e iniettata per via sottocutanea un'emulsione acqua-in-olio. La maggior parte dei modelli EAE richiede anche un'iniezione di tossina della pertosse per lo sviluppo della malattia. Per un'induzione EAE coerente e riproducibile, è necessario un protocollo dettagliato per preparare i reagenti a produrre emulsioni antigene/adiuvante. Il metodo qui descritto si avvale di un metodo standardizzato per generare emulsioni acqua-in-olio. È semplice e veloce e utilizza un omogeneizzatore agitatore al posto delle siringhe per preparare emulsioni di qualità controllata.

Introduzione

Una rottura della tolleranza immunologica può provocare la generazione di malattie autoimmuni, come la sclerosi multipla (SM). Si stima che 2,8 milioni di persone convivono con SM in tutto il mondo¹. Sebbene la causa esatta della SM sia ancora in gran parte sconosciuta, la disregolazione delle cellule T e B autoreattive, così come i difetti nella funzione Treg, svolgono un ruolo importante nella patogenesi della malattia ^2,3.

I modelli animali di malattie autoimmuni sono strumenti essenziali per studiare potenziali modalità terapeutiche. Il modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE) è stato utilizzato per quasi un secolo dai ricercatori interessati alla SM⁴. Nei primi esperimenti, l'incidenza della malattia era relativamente bassa. L'introduzione dell'adiuvante completo di Freund (CFA), contenente Mycobacterium e tossina della pertosse, ha permesso l'induzione coerente di EAE nei topi⁴. Ancora più importante, è necessario mescolare CFA con un antigene specifico del sistema nervoso centrale (SNC) per generare un'emulsione acqua-in-olio omogenea per indurre EAE. I modelli EAE attualmente disponibili più comuni si basano sull'immunizzazione attiva di topi con peptidi encefalitogeni. Il background genetico dei topi gioca un ruolo importante nella suscettibilità alla malattia, con la glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG_35-55) e la proteina proteolipidica mielinica (PLP_139-151) peptidi utilizzati per indurre EAE nei topi C57BL / 6J e SJL, rispettivamente⁵. Tuttavia, possono essere utilizzati anche altri ceppi di topo e peptidi derivati dal SNC.

La qualità dell'emulsione CFA/peptide è un fattore critico che determina la penetranza della malattia nell'immunizzazione attiva EAE modello⁶. Un'emulsione omogenea acqua-in-olio deve essere preparata mescolando i peptidi encefalitogeni disciolti in tampone acquoso con CFA, altrimenti gli animali non svilupperanno la malattia. Sono stati pubblicati numerosi protocolli sulla preparazione di emulsioni CFA/peptidiche. Gli esempi includono l'uso di un vortice⁷, sonicazione⁸, siringhe e un connettore T a tre vie⁹, o una siringa solo⁵. Tuttavia, tutti questi metodi sono difficili da standardizzare e sono spesso associati a protocolli lunghi e complicati.

Rispetto a tutti i metodi di cui sopra, il semplice metodo qui descritto per la preparazione dell'emulsione offre il vantaggio di non avere differenze da persona a persona e di essere relativamente veloce. L'emulsione viene generata da un omogeneizzatore che agita i reagenti con una velocità, un tempo e una temperatura impostati, garantendo risultati rapidi e coerenti. Oltre a indurre la malattia nel modello EAE, questo metodo può anche essere utilizzato per studiare altri modelli di malattia autoimmune come l'artrite indotta dal collagene (CIA) e l'artrite indotta dall'antigene (AIA)⁶. Pertanto, si prevede che questo metodo possa essere utilizzato per indurre costantemente la malattia in altri modelli animali che dipendono da emulsioni acqua-in-olio con autoantigeni, come la neurite autoimmune sperimentale (EAN)10, la tiroidite autoimmune sperimentale (EAT)¹¹, l'uveite autoimmune (EAU)12 e la miastenia grave (MG)¹³. Questo metodo induce anche risposte immunitarie generali come l'ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) in modo coerente⁶, e potrebbe quindi essere utilizzato per la somministrazione di vaccini contro il cancro e la malaria (vedi discussione).

Pertanto, è stato sviluppato un metodo rapido (tempo di preparazione totale ~ 30 min), semplice (tutti i reagenti possono essere preparati in anticipo e conservati) e standardizzato (l'emulsione viene eseguita utilizzando un omogeneizzatore di agitazione) ed è presentato qui. Le emulsioni CFA/antigene preparate utilizzando questo protocollo inducono costantemente la malattia nei modelli animali autoimmuni.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo le pratiche del Consiglio svedese per la ricerca sugli animali e sono state approvate dal Comitato etico degli animali, Lund-Malmö, Svezia (numero di permesso: M126-16).

NOTA: un flusso schematico del metodo è descritto nella Figura 1.

1. Preparazione del materiale

NOTA: Preparare tutti i reagenti in modo asettico in una cappa sterile, aliquote e conservare alla temperatura indicata. I reagenti possono essere conservati fino a 2 anni senza perdere il loro effetto.

1. Preparare CFA contenente 20 mg/ml di Mycobacterium tuberculosis come descritto di seguito.
   1. Aggiungere 100 mg di M. tuberculosis H37RA liofilizzato (vedi Tabella dei materiali) e cinque sfere di acciaio da 3,2 mm in un tubo da 7 mL (vedi Tabella dei materiali). Agitare il tubo in un omogeneizzatore (vedere Tabella dei materiali) per 60 s alla massima velocità impostata (5.000 giri/min).
   2. Aggiungere 5 mL di adiuvante di Freund incompleto (IFA) al tubo e agitare nuovamente per 60 s alla massima velocità. Trasferire il liquame di M. tuberculosis omogeneizzato in IFA (ora chiamato CFA) in un tubo fresco con una pipetta, lasciando le perle dietro, e conservare a 4 °C fino all'uso.
2. Aggiungere acqua ultrapura alla polvere liofilizzata del peptide MOG_35-55 (vedere Tabella dei materiali) per ottenere una concentrazione finale di peptide di 10 mg/ml. Sterilizzare la soluzione facendola passare attraverso un filtro da 0,2 μm. Preparare 60 μL di aliquote e conservare a -20 °C fino all'uso.
   NOTA: Il peptide MOG_35-55 utilizzato per questo esperimento è di purezza ImmunoGrade (~ 70%), è TFA-scisso, si dissolve facilmente in acqua e contiene un'ammide C-terminale (-NH₂) per aumentare la stabilità in vivo ¹⁴. Le aliquote peptidiche non sono mai state scongelate e ricongelate più di due volte e sono state conservate a -20 °C fino all'uso.
3. Preparare 100 ml di tampone per tossine pertosse: sciogliere 2,9 g di NaCl in 80 ml di PBS libero 1x Ca 2+^{/Mg 2+} e aggiungere 100 μL di Triton X-100 al 10%. Regolare il volume a 100 ml con PBS e sterilizzare la soluzione facendola passare attraverso un filtro da 0,2 μm. Preparare 10 mL di aliquote e conservare a 4 °C fino all'uso.

2. Preparazione di emulsioni CFA/peptidiche

1. Calcolare la quantità di emulsione necessaria per l'immunizzazione. In questo protocollo standard, ogni topo riceve 50 μg di peptide MOG_{35-55 e 300} μg di M. tuberculosis dispersi nell'adiuvante di Freund (CFA). La quantità di ciascun reagente (peptide MOG_35-55 , PBS, CFA e IFA) necessaria per la preparazione delle emulsioni può essere calcolata utilizzando il file supplementare 1. Un ulteriore 20% di tutti i reagenti, per compensare la piccola perdita di emulsione, è incluso nel calcolo.
   NOTA: Il kit di emulsione commerciale (vedi Tabella dei materiali) utilizzato in questo studio comprende un tubo, un tappo a vite e uno stantuffo in una busta sterilizzata. Ogni tubo del kit di emulsione contiene un massimo di 9,6 ml, rendendo possibile la preparazione di 8 siringhe da 1 ml sufficienti per immunizzare 40 topi (o 80 topi se si utilizzano 100 μL di emulsione per animale).
2. Posizionare il tubo con tappo a vite (dal kit di emulsione commerciale) e i reagenti da utilizzare sul ghiaccio.
3. Aggiungere i componenti dell'emulsione nel seguente ordine nei volumi calcolati al punto 2.1: PBS, poi il peptide, quindi M. tuberculosis in CFA e infine IFA.
4. Chiudere saldamente il tubo con il tappo stringendolo e allentandolo più volte. Agitare vigorosamente il tubo per 5-10 s a mano per premiscelare i reagenti.
5. Posizionare il tubo nell'omogeneizzatore agitatore e fissarlo con l'asta. Impostare la velocità sull'impostazione massima e il tempo su 60 s. Una volta terminata la corsa, posizionare il tubo sul ghiaccio per 3 minuti. Ripetere l'esecuzione una o due volte con le stesse impostazioni.
6. Centrifugare il tubo a 300 x g per 1 minuto per rimuovere l'aria intrappolata e compattare l'emulsione.
7. Rimuovere il tappo dal tubo, inserire lo stantuffo nel tubo e spingerlo lentamente verso il basso fino a raggiungere la parte superiore dell'emulsione. Rimuovere la chiusura a scatto nella parte inferiore del tubo ruotandola.
8. Rimuovere lo stantuffo da una siringa per iniezione (1 ml; vedere la tabella dei materiali). Aggiungere un ago (preferibilmente 25-27 G) alla siringa per iniezione.
9. Collegare l'estremità posteriore della siringa per iniezione all'apposito blocco nella parte inferiore del tubo e bloccarlo con una breve torsione.
10. Trasferire l'emulsione dal tubo alla siringa per iniezione spingendo delicatamente lo stantuffo. Interrompere quando l'emulsione raggiunge la graduazione di 0,15 mL della siringa per iniezione.
11. Separare la siringa per iniezione dal tubo e inserire lo stantuffo con attenzione, avendo cura che l'aria non entri nella siringa. Spinga lo stantuffo fino a quando l'emulsione esce dall'ago.
    NOTA: A questo punto, parte dell'emulsione può essere utilizzata per il controllo qualità (vedere il punto 3).
12. Ripetere i passaggi 2.8-2.11 per il resto dell'emulsione presente nel tubo.
    NOTA: Per ridurre al minimo lo spreco di costose emulsioni CFA/antigene, utilizzare siringhe da 1 ml. Possono essere utilizzate altre siringhe che si adattano alla serratura dedicata nella parte inferiore del tubo; tuttavia, potrebbe essere necessario preparare un volume maggiore di emulsione. L'emulsione peptidica CFA/MOG_35-55 può essere conservata a 4 °C per un massimo di 15 settimane senza perdere la sua capacità di indurre EAE.

3. Controllo di qualità dell'emulsione

1. Test di caduta: aggiungere una piccola goccia di emulsione in un tubo conico sterile da 50 mL riempito con 20 ml di acqua fredda. Chiudere il tubo e agitarlo a mano per un paio di secondi. La comparsa di minuscole goccioline distinte conferma la formazione di un'emulsione acqua-in-olio.
2. Esaminare l'emulsione utilizzando la microscopia a contrasto di fase.
   1. Per analizzare la dimensione delle particelle di acqua in olio, aggiungere una piccola goccia (2-3 μL) dell'emulsione a un vetrino da microscopio, spalmarla con un vetrino di copertura e quindi spingere con forza con un movimento circolare per appiattire l'emulsione.
   2. Esaminare l'emulsione spalmata al microscopio a contrasto di fase (vedi Tabella dei materiali) con ingrandimento 400x e concentrarsi su un campo con un monostrato dell'emulsione. Assicurarsi che siano visibili piccole particelle grigie/bianche uniformi (Figura 2A).
3. Analizzare la dimensione delle particelle dell'emulsione utilizzando la diffrazione laser.
   NOTA: La diffrazione laser misura le distribuzioni granulometriche utilizzando un raggio laser. Questo è l'ultimo test di controllo qualità per le emulsioni. Un risultato rappresentativo delle distribuzioni granulometriche utilizzando il metodo qui descritto è mostrato nella Figura 2B (per una descrizione dettagliata, vedere Topping et ^al.6). Tuttavia, il test di caduta e l'esame al microscopio sono sufficienti per convalidare se si è formata un'emulsione soddisfacente.
   1. Impostare gli indici di rifrazione per entrambi i laser rossi e blu per il disperdente (vedi Tabella dei materiali) a 1,456 e per il campione a 1,33 sull'analizzatore granulometrico (vedi Tabella dei materiali). Impostare l'assorbanza dell'indice di rifrazione su 0,02.
   2. Aggiungere una goccia dalla siringa contenente l'emulsione peptidica all'unità di dispersione contenente olio minerale leggero. Avviare l'acquisizione dei dati immediatamente dopo la dispersione dell'emulsione.
      NOTA: È stato applicato un modello generico e sono state assunte particelle sferiche per la stima della distribuzione granulometrica.

4. Induzione EAE utilizzando l'emulsione peptidica MOG _35-55 in topi C57BL6/J

NOTA: In tutti gli esperimenti, sono stati utilizzati cinque topi femmina C57BL6 / J di 8-12 settimane.

1. Prima dell'immunizzazione, anestetizzare i topi usando isoflurano vaporizzato al 2,5% e confermare usando un pizzico di punta ferma.
2. Iniettare ogni topo per via sottocutanea usando siringhe da 1 mL in due siti diversi, sui lati destro e sinistro del fianco posteriore con 200 μL di emulsione contenente 50 μg di peptide MOG_35-55 in un rapporto 1:1 (v/v) di peptide/CFA.
3. Almeno 1,5 ore dopo l'immunizzazione con l'emulsione, e poi di nuovo dopo 24 ore, somministrare un totale di 80 ng di tossina Bordetella pertussis in 200 μL di tampone tossina pertosse a ciascun topo, attraverso iniezioni intraperitoneali (100 μL a sinistra e 100 μL sul sito destro della pancia).
   NOTA: La localizzazione precisa dell'iniezione intraperitoneale con tossina della pertosse ha dimostrato di essere essenziale per l'attivazione delle cellule T nel linfonodo drenante¹⁵.
4. Facoltativo: iniettare nuovamente il peptide MOG_35-55 il giorno 7 (come usato in alcuni protocolli¹⁶) ripetendo il passaggio 4.2.
   NOTA: Soprattutto, assicurarsi che le siringhe e gli aghi utilizzati per l'immunizzazione contenenti MOG / CFA o tossina della pertosse siano adeguatamente smaltiti in sacchetti / contenitori a rischio biologico.
5. Valutare il punteggio clinico giornalmente, utilizzando una scala da 0 a 6 come precedentemente descritto⁶.

Risultati

Il protocollo rapido, semplice e standardizzato per la preparazione delle emulsioni CFA/MOG è illustrato nella Figura 1. Questo metodo è stato recentemente descritto altrove⁶. Le emulsioni CFA/MOG possono essere preparate anche con altri metodi, come il tradizionale metodo a siringa o mediante vortice. Questi metodi sono stati confrontati qui valutando la qualità delle emulsioni. Tutti i metodi producevano emulsioni acqua-in-olio; L'omogeneità e la qualità di que...

Discussione

Le emulsioni acqua-in-olio, come l'antigene/adiuvante di Freund, sono state utilizzate per più di mezzo secolo per indurre EAE¹⁷. Attualmente non esiste un metodo standardizzato per preparare emulsioni di antigene che sia indipendente dall'influenza umana. La miscelazione manuale con siringhe è standard per la maggior parte dei laboratori, tuttavia questo metodo richiede tempo, spesso comporta un'eccessiva perdita di materiale e la qualità varia a seconda dello scienziato che lo prepara.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Injection syringe	B. Braun	9166017V
1 mL Injection syringe	Sigma-Aldrich	Z683531
7 ml empty tubes with caps	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	7 mL tube
50 mL sterile centrifuge tube	Fisher Scientific	10788561	50 mL tube
Bordetella pertussis toxin	Sigma-Aldrich	P2980	Store at -20 °C
Dispersant, light mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Store at RT
Emulsion kit	Bertin-Instruments	D34200.10 ea	Containing a tube, cap, and plunger
Incomplete Freund's Adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Store at +4 °C
Mastersizer 2000	Malvern Panalytical	N/A	Particle size analyzer
Minilys-Personal homogenizer	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	Shaking homogenizer
MOG 35-55 Peptide	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	FDA-approved oil adjuvant
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm	Fisher Scientific	17124381	Sterlie filter
PBS, Ca2+/Mg2+ free	Thermo Fisher Scientific	14190144	PBS
Phase-Constrast Microscope	Olympus	BX40-B
Steel Beads 3.2 mm	Fisher Scientific	NC0445832	Autoclave and store at RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648463	Store at RT