一种快速、简单、标准化的均质化制备抗原/辅助乳剂以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎的方法

摘要

为了诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，一种多发性硬化症的动物模型，用含有自身抗原的油包水乳剂对小鼠进行免疫并完成弗氏佐剂。虽然存在用于制备这些乳液的几种方案，但本文介绍了一种用于乳液制备的快速、简单和标准化的均质化方案。

摘要

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）与多发性硬化症（MS）具有相似的免疫学和临床特征，因此被广泛用作识别新药物靶点以更好地治疗患者的模型。MS 的特征是几种不同的病程：复发缓解型 MS （RRMS）、原发性进行性 MS （PPMS）、继发性进行性 MS （SPMS） 和罕见的进行性复发型 MS （PRMS）。虽然动物模型不能准确地模仿所有这些对比鲜明的人类疾病表型，但有一些EAE模型反映了MS的一些不同临床表现。例如，C57BL / 6J小鼠中髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白（MOG）诱导的EAE模仿人PPMS，而SJL / J小鼠中髓磷脂蛋白（PLP）诱导的EAE类似于RRMS。其他自身抗原，如髓鞘碱性蛋白（MBP）和许多不同的小鼠品系也用于研究EAE。为了在这些自身抗原免疫EAE模型中诱导疾病，制备油包水乳剂并皮下注射。大多数EAE模型还需要注射百日咳毒素才能发展疾病。为了获得一致且可重现的EAE诱导，需要详细的方案来制备试剂以产生抗原/佐剂乳剂。这里描述的方法利用标准化方法来生成油包水乳液。它简单快速，使用振荡均质机代替注射器来制备质量控制乳液。

引言

免疫耐受性的破坏可导致自身免疫性疾病的产生，例如多发性硬化症（MS）。据估计，全世界有280万人患有^MS1。尽管MS的确切原因在很大程度上仍未知，但自身反应性T细胞和B细胞的失调以及Treg功能的缺陷在该疾病的发病机制中起着重要作用^2，3。

自身免疫性疾病的动物模型是研究潜在治疗方式的重要工具。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型已被对MS⁴感兴趣的研究人员使用了近一个世纪。在早期的实验中，该疾病的发病率相对较低。引入含有 分枝杆菌 和百日咳毒素的完全弗氏佐剂（CFA）^{能够在小鼠中}一致地诱导EAE4。最重要的是，有必要将CFA与中枢神经系统（CNS）特异性抗原混合，以产生均匀的油包水乳液以诱导EAE。目前最常见的EAE模型是基于用致脑肽对小鼠进行主动免疫。小鼠的遗传背景在疾病易感性中起重要作用，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG_35-55）和髓鞘蛋白脂蛋白（PLP_139-151）肽分别用于诱导C57BL / 6J和SJL小鼠的EAE^，5。然而，也可以使用其他小鼠品系和CNS衍生的肽。

CFA/肽乳剂的质量是决定主动免疫EAE模型⁶中疾病外显率的关键因素。必须通过将溶解在水性缓冲液中的致脑肽与CFA混合来制备均匀的油包水乳液，否则动物不会患上这种疾病。关于CFA/肽乳液的制备已经发表了许多方案。实例包括使用涡旋⁷、超声^处理8、注射器和三通T连接器⁹、或仅使用一个注射器⁵。然而，所有这些方法都难以标准化，并且通常与冗长而复杂的协议相关联。

与上述所有方法相比，此处描述的用于乳液制备的简单方法具有人与人之间没有差异且相对较快的优点。乳液由均质机以设定的速度、时间和温度摇动试剂产生，确保快速一致的结果。除了在EAE模型中诱导疾病外，该方法还可用于研究其他自身免疫性疾病模型，例如胶原蛋白诱导的关节炎（CIA）和抗原诱导的关节炎（AIA）⁶。因此，预计该方法可用于在依赖于含有自身抗原的油包水乳剂的其他动物模型中持续诱导疾病，例如实验性自身免疫性神经炎（EAN）¹⁰，实验性自身免疫性甲状腺炎（EAT）11，自身免疫性葡萄膜炎（EAU）¹²和重症肌无力（MG）¹³。该方法还持续诱导一般免疫反应，例如延迟型超敏反应（DTH）⁶，因此可用于提供癌症和疟疾疫苗（见讨论）。

因此，已经开发了一种快速（总制备时间~30分钟），简单（所有试剂都可以提前制备并储存）和标准化（使用振荡均质器完成乳液）的方法，并在此介绍。使用该协议制备的CFA /抗原乳剂在自身免疫动物模型中始终诱导疾病。

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研究方案

所有动物程序均按照瑞典动物研究委员会的惯例进行，并得到瑞典隆德-马尔默动物伦理委员会的批准（许可证号：M126-16）。

注意：该方法的示意图如图 1所示。

1. 材料准备

注意：将所有试剂无菌准备在无菌罩中，并等分并储存在指定的温度下。试剂可以储存长达 2 年而不会失去其效果。

1. 如下所述制备含有 20 mg/mL 结核分枝杆菌 的 CFA。
   1. 将100mg冻干结核分枝杆菌H37RA（见材料表）和五个3.2mm钢珠加入7mL管中（见材料表）。在均质器（见材料表）中以最高速度设置（5，000 rpm）摇动管子60秒。
   2. 向管中加入 5 mL 不完全弗氏佐剂 （IFA），并以最高速度再次摇动 60 秒。将IFA（现在称为CFA）中匀浆化的 结核分枝杆菌 的浆液转移到带有移液管的新鲜管中，留下珠子，并在4°C下储存直至使用。
2. 将超纯水加入MOG_35-55 肽的冻干粉末中（参见 材料表），以获得10mg / mL的最终肽浓度。通过0.2μm过滤器对溶液进行灭菌。准备60μL等分试样并储存在-20°C直至使用。
   注意：用于本实验的MOG_35-55 肽具有免疫级纯度（~70%），TFA切割，易溶于水，并含有C端酰胺（-NH₂）以增加 体内 稳定性¹⁴。肽等分试样从未解冻和重新冷冻两次以上，并储存在-20°C直至使用。
3. 准备 100 mL 百日咳毒素缓冲液：将 2.9 g NaCl 溶解在 80 mL 的 1x Ca 2+^{/Mg 2+} 游离 PBS 中，并加入 100 μL 10% Triton X-100。用PBS将体积调节至100 mL，并通过0.2μm过滤器对溶液进行灭菌。准备10mL等分试样并储存在4°C直至使用。

2. CFA/肽乳液的制备

1. 计算免疫所需的乳液量。在该标准方案中，每只小鼠接受50μgMOG_35-55 肽和300μg分散在弗氏佐剂（CFA）中的 结核分枝杆菌 。制备乳液所需的每种试剂（MOG_35-55 肽、PBS、CFA 和 IFA）的量可以使用 补充文件 1 计算。计算中包括所有试剂的另外20%，以补偿乳液的少量损失。
   注意：本研究中使用的商业乳液套件（见 材料表）包括灭菌袋中的管子、螺旋盖和柱塞。乳液试剂盒的每个管最多可容纳9.6 mL，因此可以制备8 x 1 mL注射器，足以免疫40只小鼠（如果每只动物使用100μL乳液，则为80只小鼠）。
2. 将螺旋盖管（来自商业乳液套件）和要在冰上使用的试剂放在冰上。
3. 在步骤2.1中计算的体积中按以下顺序添加乳液组分：PBS，然后是肽，然后是CFA中的 结核分枝杆菌 ，最后是IFA。
4. 用盖子牢固地关闭管子，将其拧紧并松开几次。用手剧烈摇动试管5-10秒以预混合试剂。
5. 将管子放入振荡均质器中，并用杆固定。将速度设置为最高设置，将时间设置为 60 秒。运行完成后，将管子放在冰上3分钟。使用相同的设置再重复运行一两次。
6. 将管以300× g 离心1分钟以除去滞留的空气并压实乳液。
7. 从管中取下盖子，将柱塞插入管中，然后缓慢向下推，直到到达乳液的顶部。通过扭转管子底部的卡扣开盖来取下它。
8. 从注射器中取出柱塞（1 mL;参见 材料表）。向注射器中加入针头（优选25-27G）。
9. 将注射器的后端连接到管底部的专用锁上，并以短促的扭转将其锁定。
10. 通过轻轻推动柱塞将乳液从管转移到注射器中。当乳液达到注射器的0.15mL刻度时停止。
11. 将注射器与管分开并小心插入柱塞，注意没有空气进入注射器。推动柱塞，直到乳液从针头中出来。
    注意：此时，一些乳液可用于质量控制（见步骤3）。
12. 对管中存在的其余乳液重复步骤2.8-2.11。
    注意：为了尽量减少昂贵的CFA /抗原乳剂的浪费，应使用1 mL注射器。可以使用安装在管底部专用锁的其他注射器;然而，可能需要制备更大体积的乳液。CFA / MOG_35-55 肽乳液可在4°C下储存长达15周，而不会失去其EAE诱导能力。

3. 乳液的质量控制

1. 滴落测试：将一小滴乳液加入装有 20 mL 冷水的无菌 50 mL 锥形管中。关闭管子并用手摇晃几秒钟。微小的独特液滴的出现证实了油包水乳液的形成。
2. 使用相衬显微镜检查乳液。
   1. 要分析油包水颗粒的大小，请将一小滴（2-3μL）乳液添加到显微镜载玻片中，用盖玻片将其涂抹，然后以圆周运动用力推动以压平乳液。
   2. 在相衬显微镜（见 材料表）下以400倍放大倍率检查涂抹的乳液，并聚焦在具有单层乳液的领域。确保可以看到均匀的灰色/白色小颗粒（图2A）。
3. 使用激光衍射分析乳液粒度。
   注意：激光衍射使用激光束测量粒度分布。这是乳液的终极质量控制测试。使用此处描述的方法进行粒度分布的代表性结果如图 2B 所示（有关详细说明，请参阅Topping等^人6）。然而，跌落测试和显微镜检查足以验证是否形成了令人满意的乳液。
   1. 在粒度分析仪上，将分散剂的红色和蓝色激光（参见材料表）的折射率设置为1.456，将样品的折射率设置为1.33（参见材料表）。将折射率的吸光度设置为0.02。
   2. 从含有肽乳液的注射器中加入一滴到含有轻矿物油的分散装置中。乳液分散后立即开始数据采集。
      注意：应用通用模型，并假设球形颗粒，以估计粒度分布。

4. 在C57BL6 / J小鼠中使用MOG _35-55 肽乳液进行EAE诱导

注意：在所有实验中，使用五只8-12周龄的雌性C57BL6 / J小鼠。

1. 在免疫之前，使用2.5%汽化异氟醚麻醉小鼠，并使用坚定的脚趾捏确认。
2. 使用1 mL注射器将每只小鼠皮下注射到后胁右侧和左侧的两个不同部位，用200μL乳液注射，其中含有50μgMOG_35-55 肽，肽/ CFA的比例为1：1（v / v）。
3. 用乳液免疫后至少1.5小时，然后在24小时后再次，通过腹膜内注射（左侧100μL和腹部右侧部位100μL）向每只小鼠施用200μL百日咳毒素缓冲液中的总共80ng百日咳 博德特 氏菌毒素。
   注意：用百日咳毒素腹膜内注射的精确定位已被证明对于引流淋巴结中T细胞的活化至关重要¹⁵。
4. 可选：通过重复步骤4.2，在第7天再次注入MOG_35-55 肽（在某些方案¹⁶中使用）。
   注意：最重要的是，确保用于免疫含有MOG / CFA或百日咳毒素的注射器和针头充分处理在生物危害袋/容器中。
5. 每天评估临床评分，使用前面描述的^0-6 的量表6。

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结果

用于制备CFA/MOG乳液的快速、简单和标准化方案如图 1所示。这种方法最近在别处有描述⁶.CFA / MOG乳液也可以用其他方法制备，例如传统的注射器方法或通过涡旋法制备。这里通过评估乳液的质量来比较这些方法。所有方法都生产油包水乳液;通过在载玻片上加入一小滴，然后在相差显微镜下观察来评估这些乳液的均匀性和质量。通过振荡均质法生产的乳液显?...

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讨论

油包水乳剂，如抗原/弗氏佐剂，已被用于诱导EAE¹⁷超过半个世纪。目前还没有独立于人类影响的抗原乳剂制备标准化方法。使用注射器手动混合是大多数实验室的标准，但是这种方法非常耗时，通常会导致材料过度损失，并且质量因制备它的科学家而异。

本手稿中介绍的方法使用标准振荡均质机制备抗原/CFA 乳剂。此外，这里使用的所有试剂都可以等分并长...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Injection syringe	B. Braun	9166017V
1 mL Injection syringe	Sigma-Aldrich	Z683531
7 ml empty tubes with caps	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	7 mL tube
50 mL sterile centrifuge tube	Fisher Scientific	10788561	50 mL tube
Bordetella pertussis toxin	Sigma-Aldrich	P2980	Store at -20 °C
Dispersant, light mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Store at RT
Emulsion kit	Bertin-Instruments	D34200.10 ea	Containing a tube, cap, and plunger
Incomplete Freund's Adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Store at +4 °C
Mastersizer 2000	Malvern Panalytical	N/A	Particle size analyzer
Minilys-Personal homogenizer	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	Shaking homogenizer
MOG 35-55 Peptide	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	FDA-approved oil adjuvant
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm	Fisher Scientific	17124381	Sterlie filter
PBS, Ca2+/Mg2+ free	Thermo Fisher Scientific	14190144	PBS
Phase-Constrast Microscope	Olympus	BX40-B
Steel Beads 3.2 mm	Fisher Scientific	NC0445832	Autoclave and store at RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648463	Store at RT