שיטת הומוגניזציה מהירה, פשוטה וסטנדרטית להכנת אמולסיות אנטיגן/אדג'ובנטיות לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

Summary

כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, מודל חייתי של טרשת נפוצה, עכברים מחוסנים בתחליב מים בשמן המכיל אוטואנטיגן ואדג'ובנט שלם של פרוינד. בעוד שקיימים מספר פרוטוקולים להכנת אמולסיות אלה, מוצג כאן פרוטוקול הומוגניזציה מהיר, פשוט וסטנדרטי להכנת אמולסיה.

Abstract

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) חולקת מאפיינים אימונולוגיים וקליניים דומים עם טרשת נפוצה (MS), ולכן נעשה בה שימוש נרחב כמודל לזיהוי מטרות תרופות חדשות לטיפול טוב יותר בחולים. טרשת נפוצה מאופיינת במספר מסלולי מחלה שונים: טרשת נפוצה חוזרת (RRMS), טרשת נפוצה פרוגרסיבית ראשונית (PPMS), טרשת נפוצה פרוגרסיבית משנית (SPMS), וצורה נדירה של טרשת נפוצה מתקדמת (PRMS). למרות שמודלים של בעלי חיים אינם מחקים במדויק את כל הפנוטיפים המנוגדים הללו של מחלות אנושיות, ישנם מודלים של EAE המשקפים חלק מהביטויים הקליניים השונים של טרשת נפוצה. לדוגמה, EAE המושרה על-ידי מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (MOG) בעכברי C57BL/6J מחקה PPMS אנושי, בעוד ש-EAE המושרה על-ידי חלבון פרוטאוליפיד מיאלין (PLP) בעכברי SJL/J דומה ל-RRMS. נוגדי חמצון עצמיים אחרים, כגון חלבון בסיסי מיאלין (MBP), ומספר זנים שונים של עכברים משמשים גם הם לחקר EAE. כדי לגרום למחלה במודלים אלה של חיסון נגד אנטיגנים עצמיים, מכינים ומזריקים תחליב מים בשמן באופן תת-עורי. רוב המודלים של EAE דורשים גם הזרקה של רעלן שעלת כדי שהמחלה תתפתח. להשראת EAE עקבית וניתנת לשחזור, יש צורך בפרוטוקול מפורט להכנת הריאגנטים לייצור תחליבי אנטיגן/אדג'ובנטיים. השיטה המתוארת כאן מנצלת שיטה סטנדרטית ליצירת תחליבי מים בשמן. הוא פשוט ומהיר ומשתמש בהומוגנייזר מטלטל במקום במזרקים להכנת תחליבים מבוקרי איכות.

Introduction

התמוטטות של סובלנות חיסונית יכולה לגרום ליצירת הפרעות אוטואימוניות, כגון טרשת נפוצה (MS). ההערכה היא כי 2.8 מיליון אנשים חיים עם טרשת נפוצה ברחבי העולם¹. למרות שהסיבה המדויקת לטרשת נפוצה עדיין אינה ידועה במידה רבה, חוסר ויסות של תאי T ו- B תגובתיים אוטומטיים, כמו גם פגמים בתפקוד Treg, ממלאים תפקידים חשובים בפתוגנזה של המחלה ^2,3.

מודלים חייתיים של מחלות אוטואימוניות הם כלים חיוניים לחקר שיטות טיפוליות פוטנציאליות. המודל הניסיוני של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית (EAE) נמצא בשימוש כבר כמעט מאה שנה על ידי חוקרים המתעניינים בטרשת נפוצה⁴. בניסויים מוקדמים, שכיחות המחלה הייתה נמוכה יחסית. הכנסת האדג'ובנט השלם של פרוינד (CFA), המכיל מיקובקטריום ורעלן שעלת, אפשרה השראה עקבית של EAE בעכברים⁴. והכי חשוב, יש צורך לערבב CFA עם אנטיגן ספציפי למערכת העצבים המרכזית (CNS) כדי ליצור תחליב מים הומוגני בשמן לגרימת EAE. המודלים הנפוצים ביותר של EAE הזמינים כיום מבוססים על חיסון פעיל של עכברים עם פפטידים אנצפליטוגניים. הרקע הגנטי של העכברים ממלא תפקיד חשוב ברגישות למחלות, כאשר גליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים (MOG_35-55) וחלבון פרוטאוליפיד מיאלין (PLP_139-151) משמשים להשראת EAE בעכברי C57BL/6J ו-SJL, בהתאמה⁵. עם זאת, ניתן להשתמש גם בזני עכברים אחרים ובפפטידים שמקורם במערכת העצבים המרכזית.

האיכות של תחליב CFA/פפטיד היא גורם קריטי שקובע את חדירות המחלה בחיסון הפעיל EAE מודל⁶. יש להכין תחליב מים הומוגני בשמן על ידי ערבוב הפפטידים האנצפליטוגניים המומסים בחיץ מימי עם CFA, אחרת בעלי חיים לא יפתחו את המחלה. פרוטוקולים רבים פורסמו על הכנת תחליבי CFA/פפטידים. דוגמאות כוללות שימוש במערבולת⁷, סוניקציה⁸, מזרקים ומחבר T תלת-כיווני⁹, או מזרק אחד בלבד⁵. עם זאת, כל השיטות הללו קשות לסטנדרטיזציה ולעתים קרובות קשורות לפרוטוקולים ארוכים ומסובכים.

בהשוואה לכל השיטות הנ"ל, השיטה הפשוטה המתוארת כאן להכנת תחליב מציעה את היתרונות של היעדר הבדלים בין אדם לאדם והיותה מהירה יחסית. האמולסיה נוצרת על ידי הומוגנייזר שמטלטל את הריאגנטים במהירות, זמן וטמפרטורה מוגדרים, מה שמבטיח תוצאות מהירות ועקביות. בנוסף לגרימת מחלות במודל EAE, שיטה זו יכולה לשמש גם לחקר מודלים אחרים של מחלות אוטואימוניות כגון דלקת מפרקים הנגרמת על ידי קולגן (CIA) ודלקת מפרקים הנגרמת על ידי אנטיגן (AIA)⁶. לכן, צפוי כי שיטה זו יכולה לשמש כדי לגרום באופן עקבי למחלות במודלים אחרים של בעלי חיים התלויים בתחליבי מים בשמן עם אנטיגנים עצמיים, כגון דלקת עצבים אוטואימונית ניסיונית (EAN)10, דלקת אוטואימונית ניסיונית של בלוטת התריס (EAT)^11, אובאיטיס אוטואימונית (EAU)¹², ומיאסטניה גרביס (MG)¹³. שיטה זו גם גורמת לתגובות חיסוניות כלליות כגון רגישות יתר מסוג מושהה (DTH) באופן עקבי⁶, ולכן יכולה לשמש להעברת חיסונים נגד סרטן ומלריה (ראו דיון).

לפיכך, פותחה שיטה מהירה (זמן הכנה כולל ~ 30 דקות), פשוטה (ניתן להכין את כל הריאגנטים מראש ולאחסן אותה), וסטנדרטית (התחליב מתבצע באמצעות הומוגנייזר מטלטל) ומוצגת כאן. תחליבי CFA/אנטיגן שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה גורמים באופן עקבי למחלות במודלים אוטואימוניים של בעלי חיים.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי נוהלי המועצה השוודית למחקר בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים, לונד-מאלמו, שבדיה (מספר היתר: M126-16).

הערה: זרימה סכמטית של השיטה מתוארת באיור 1.

1. הכנת חומרים

הערה: מכינים את כל הריאגנטים באופן אספטי במכסה מנוע סטרילי, ומכניסים ומאחסנים בטמפרטורה שצוינה. ניתן לאחסן את הריאגנטים עד שנתיים מבלי לאבד את השפעתם.

1. יש להכין CFA המכיל 20 מ"ג/מ"ל מיקובקטריום שחפת כמתואר להלן.
   1. הוסיפו 100 מ"ג של שחפת M. מיובשת בהקפאה H37RA (ראו טבלת חומרים) וחמישה חרוזי פלדה בקוטר 3.2 מ"מ לצינור של 7 מ"ל (ראו טבלת חומרים). נערו את הצינור בהומוגנייזר (ראו טבלת חומרים) במשך 60 שניות במהירות הגבוהה ביותר (5,000 סל"ד).
   2. הוסיפו 5 מ"ל של אדג'ובנט (IFA) לא שלם של פרוינד לצינור ונערו שוב במשך 60 שניות במהירות הגבוהה ביותר. מעבירים את ה-slurry של שחפת M . הומוגנית ב-IFA (כיום נקראת CFA) לצינור טרי עם פיפטה, משאירים את החרוזים מאחור, ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
2. הוסיפו מים אולטרה-פוריים לאבקה המיובשת בהקפאה של פפטיד MOG_35-55 (ראו טבלת חומרים) כדי לקבל ריכוז פפטידי סופי של 10 מ"ג/מ"ל. לעקר את התמיסה על ידי העברתה דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. יש להכין 60 μL aliquots ולאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
   הערה: הפפטיד MOG_35-55 המשמש לניסוי זה הוא של טוהר ImmunoGrade (~ 70%), הוא מפוצל TFA, מתמוסס בקלות במים, ומכיל אמיד מסוף C (-NH₂) כדי להגביר את יציבות in vivo ¹⁴. אליקוטים פפטידיים מעולם לא הופשרו והוקפאו מחדש יותר מפעמיים, ואוחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
3. הכינו 100 מ"ל של מאגר רעלני שעלת: המסו 2.9 גרם של NaCl ב-80 מ"ל של 1x Ca 2+^{/Mg 2+} PBS חופשי והוסיפו 100 μL של 10% טריטון X-100. התאם את עוצמת הקול ל-100 מ"ל באמצעות PBS ועקר את התמיסה על-ידי העברתה דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר. מכינים 10 מ"ל ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

2. הכנת תחליבי CFA/פפטידים

1. חישוב כמות התחליב הדרושה לחיסון. בפרוטוקול סטנדרטי זה, כל עכבר מקבל 50 מיקרוגרם של MOG_35-55 פפטיד ו-300 מיקרוגרם של שחפת M. המפוזרת באדג'ובנט של פרוינד (CFA). ניתן לחשב את הכמות של כל מגיב (פפטיד MOG_35-55 , PBS, CFA ו- IFA) הנדרשת להכנת התחליבים באמצעות קובץ משלים 1. 20% נוספים מכלל הריאגנטים, כדי לפצות על אובדן קטן של תחליב, נכלל בחישוב.
   הערה: ערכת האמולסיה המסחרית (ראה טבלת חומרים) ששימשה במחקר זה כוללת צינור, מכסה בורג ובוכנה בשקית מעוקרת. כל צינור של ערכת האמולסיה מכיל מקסימום של 9.6 מ"ל, מה שמאפשר להכין 8 x 1 מ"ל מזרקים המספיקים לחיסון 40 עכברים (או 80 עכברים אם משתמשים בתחליב 100 μL לכל חיה).
2. הניחו את הצינור המכוסה בבורג (מתוך ערכת האמולסיה המסחרית) ואת הריאגנטים לשימוש על קרח.
3. הוסף את רכיבי האמולסיה בסדר הבא בנפחים המחושבים בשלב 2.1: PBS, לאחר מכן את הפפטיד, לאחר מכן את M. שחפת ב- CFA, ולבסוף IFA.
4. סגור את הצינור עם המכסה בחוזקה על ידי הידוק ושחרור אותו מספר פעמים. יש לנער את השפופרת במרץ במשך 5-10 שניות ביד כדי לערבב מראש את הריאגנטים.
5. מניחים את הצינור בהומוגנייזר הרועד ומהדקים אותו באמצעות המוט. הגדר את המהירות להגדרה הגבוהה ביותר ואת הזמן ל-60 שניות. לאחר סיום הריצה, הניחו את הצינור על הקרח למשך 3 דקות. חזור על ההפעלה פעם או פעמיים נוספות עם אותן הגדרות.
6. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 1 דקה כדי להסיר אוויר לכוד לדחוס את האמולסיה.
7. הסר את המכסה מהצינור, הכנס את הבוכנה לתוך הצינור, ודחף אותו למטה לאט עד שהוא מגיע לחלק העליון של האמולסיה. הסר את סגירת ההצמדה בתחתית הצינור על ידי סיבובו.
8. הסר את הבוכנה ממזרק הזרקה (1 מ"ל; ראה טבלת חומרים). מוסיפים מחט (רצוי 25-27 גרם) למזרק ההזרקה.
9. חברו את הקצה האחורי של מזרק ההזרקה למנעול הייעודי בתחתית הצינור ונעלו אותו עם טוויסט קצר.
10. העבר את האמולסיה מהצינור למזרק ההזרקה על ידי דחיפת הבוכנה בעדינות. עצור כאשר האמולסיה מגיעה לסיום 0.15 מ"ל של מזרק ההזרקה.
11. הפרד את מזרק ההזרקה מהצינור והכנס את הבוכנה בזהירות, תוך הקפדה על כך ששום אוויר לא ייכנס למזרק. דוחפים את הבוכנה עד שהתחליב יוצא מהמחט.
    הערה: בשלב זה, חלק מהתחליב יכול לשמש לבקרת איכות (ראה שלב 3).
12. חזור על שלבים 2.8-2.11 עבור שאר האמולסיה הקיימת בצינור.
    הערה: כדי למזער את הבזבוז של תחליבי CFA/אנטיגן יקרים, יש להשתמש במזרקים של 1 מ"ל. ניתן להשתמש במזרקים אחרים המתאימים למנעול הייעודי בתחתית הצינור; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להכין נפח גדול יותר של תחליב. ניתן לאחסן את תחליב הפפטיד CFA/MOG_35-55 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 15 שבועות מבלי לאבד את יכולת גרימת ה-EAE שלו.

3. בקרת איכות של אמולסיה

1. בדיקת טיפה: הוסף טיפה קטנה של התחליב לתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל מלא 20 מ"ל של מים קרים. סגור את הצינור ולחץ אותו ביד במשך כמה שניות. המראה של טיפות זעירות ומובהקות מאשר את היווצרותו של תחליב מים בשמן.
2. בחן את האמולסיה באמצעות מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה.
   1. כדי לנתח את הגודל של חלקיקי המים בשמן, הוסיפו טיפה זעירה (2-3 μL) של האמולסיה למגלשה במיקרוסקופ, מרחו אותה עם כיסוי מחליק, ואז דחפו חזק בתנועה מעגלית כדי לשטח את התחליב.
   2. בחנו את התחליב המרוח תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (ראו טבלת חומרים) בהגדלה של פי 400 והתמקדו בשדה עם חד-שכבתי של התחליב. ודאו שחלקיקים אפורים/לבנים קטנים ואחידים נראים לעין (איור 2A).
3. נתח את גודל חלקיקי האמולסיה באמצעות עקיפת לייזר.
   הערה: עקיפת לייזר מודדת התפלגויות גודל חלקיקים באמצעות קרן לייזר. זהו מבחן בקרת האיכות האולטימטיבי לתחליבים. תוצאה מייצגת של התפלגות גודל החלקיקים בשיטה המתוארת כאן מוצגת באיור 2B (לתיאור מפורט, ראו Topping et ^al.6). עם זאת, בדיקת הנפילה ובדיקת המיקרוסקופ מספיקות כדי לאמת אם נוצר תחליב משביע רצון.
   1. הגדר את מדדי השבירה עבור לייזרים אדומים וכחולים עבור חומר הפיזור (ראו טבלת חומרים) ל-1.456 ועבור הדגימה ל-1.33 במנתח גודל החלקיקים (ראו טבלת חומרים). הגדר את ספיגת מקדם השבירה ל- 0.02.
   2. מוסיפים טיפה אחת מהמזרק המכיל את תחליב הפפטיד ליחידת הפיזור המכילה שמן מינרלי קל. התחל את רכישת הנתונים מיד לאחר פיזור האמולסיה.
      הערה: מודל למטרות כלליות הופעל, והונחו חלקיקים כדוריים, להערכת התפלגות גודל החלקיקים.

4. אינדוקציה של EAE באמצעות תחליב פפטיד _{MOG 35-55} בעכברי C57BL6/J

הערה: בכל הניסויים נעשה שימוש בחמישה עכברי C57BL6/J בני 8-12 שבועות.

1. לפני החיסון, מרדימים את העכברים באמצעות 2.5% איזופלורן מאודה ומאשרים באמצעות צביטה מוצקה של הבוהן.
2. להזריק לכל עכבר תת עורית באמצעות מזרקים של 1 מ"ל לשני אתרים שונים, בצד ימין ובצד שמאל של האגף האחורי עם 200 μL של תחליב המכיל 50 מיקרוגרם של פפטיד MOG_35-55 ביחס של 1:1 (v/v) של פפטיד/CFA.
3. לפחות 1.5 שעות לאחר החיסון עם תחליב, ולאחר מכן שוב לאחר 24 שעות, לתת סך של 80 ng של שעלת Bordetella רעלן ב 200 μL של חיץ רעלן שעלת לכל עכבר, באמצעות זריקות intraperitoneal (100 μL בצד שמאל ו 100 μL באתר הימני של הבטן).
   הערה: לוקליזציה מדויקת של הזרקה תוך-צפקית עם רעלן שעלת הוכחה כחיונית להפעלת תאי T בבלוטת הלימפה המתנקזת¹⁵.
4. אופציונלי: הזרקת פפטיד MOG_35-55 שוב ביום 7 (כפי שנעשה שימוש בפרוטוקולים^{מסוימים 16}) על ידי חזרה על שלב 4.2.
   הערה: והכי חשוב, יש לוודא שהמזרקים והמחטים המשמשים לחיסון המכילים MOG/CFA או רעלן שעלת מושלכים כראוי לשקיות/מיכלים ביולוגיים.
5. הערך את הציון הקליני מדי יום, תוך שימוש בסולם של 0-6 כפי שתואר קודם^{לכן 6}.

תוצאות

הפרוטוקול המהיר, הפשוט והסטנדרטי להכנת אמולסיות CFA/MOG מתואר באיור 1. שיטה זו תוארה לאחרונה במקום אחר⁶. ניתן להכין תחליבי CFA/MOG גם בשיטות אחרות, כגון שיטת המזרק המסורתית או על ידי מערבולת. שיטות אלה הושוו כאן על ידי הערכת איכות התחליבים. כל השיטות הפיקו תחליבי מים ב?...

Discussion

תחליבי מים בשמן, כגון אדג'ובנט של אנטיגן/פרוינד, שימשו במשך יותר מחצי מאה להשראת EAE¹⁷. אין כיום שיטה סטנדרטית להכנת תחליבי אנטיגן שאינם תלויים בהשפעת האדם. ערבוב ידני באמצעות מזרקים הוא סטנדרטי עבור רוב המעבדות, אולם שיטה זו היא זמן רב, לעתים קרובות גורם לאובדן מוגזם של חומר, ואת ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Injection syringe	B. Braun	9166017V
1 mL Injection syringe	Sigma-Aldrich	Z683531
7 ml empty tubes with caps	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	7 mL tube
50 mL sterile centrifuge tube	Fisher Scientific	10788561	50 mL tube
Bordetella pertussis toxin	Sigma-Aldrich	P2980	Store at -20 °C
Dispersant, light mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Store at RT
Emulsion kit	Bertin-Instruments	D34200.10 ea	Containing a tube, cap, and plunger
Incomplete Freund's Adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Store at +4 °C
Mastersizer 2000	Malvern Panalytical	N/A	Particle size analyzer
Minilys-Personal homogenizer	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	Shaking homogenizer
MOG 35-55 Peptide	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	FDA-approved oil adjuvant
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm	Fisher Scientific	17124381	Sterlie filter
PBS, Ca2+/Mg2+ free	Thermo Fisher Scientific	14190144	PBS
Phase-Constrast Microscope	Olympus	BX40-B
Steel Beads 3.2 mm	Fisher Scientific	NC0445832	Autoclave and store at RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648463	Store at RT