実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するための抗原/アジュバントエマルジョンを調製するための迅速、簡便、標準化されたホモジナイズ法

要約

多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するために、マウスを自己抗原および完全なフロイントアジュバントを含む油中水型エマルジョンで免疫する。これらのエマルジョンの調製にはいくつかのプロトコルがありますが、ここでは、エマルジョン調製のための迅速で単純で標準化された均質化プロトコルを示します。

要約

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症(MS)と同様の免疫学的および臨床的特徴を共有しているため、より良い患者治療のための新しい薬物標的を特定するためのモデルとして広く使用されています。MSは、再発寛解型MS(RRMS)、原発性進行型MS(PPMS)、二次進行型MS(SPMS)、およびまれな進行性再発型のMS(PRMS)など、いくつかの異なる疾患経過を特徴としています。動物モデルは、これらの対照的なヒト疾患表現型のすべてを正確に模倣するわけではありませんが、MSのさまざまな臨床症状のいくつかを反映するEAEモデルがあります。例えば、C57BL/6Jマウスのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)誘導性EAEはヒトPPMSを模倣し、SJL/Jマウスのミエリンプロテオリピドタンパク質(PLP)誘導EAEはRRMSに類似しています。ミエリン塩基性タンパク質(MBP)などの他の自己抗原、および多数の異なるマウス系統もEAEの研究に使用されます。これらの自己抗原免疫EAEモデルにおいて疾患を誘導するために、油中水型エマルジョンを調製し、皮下注射する。EAEモデルの大部分は、百日咳毒素の注射も必要とします 病気が発症するために。一貫性のある再現性のあるEAE誘導のためには、抗原/アジュバントエマルジョンを製造するための試薬を調製するための詳細なプロトコルが必要です。ここで説明する方法は、標準化された方法を利用して油中水型エマルジョンを生成します。シンプルで高速で、シリンジの代わりに振とうホモジナイザーを使用して品質管理されたエマルジョンを調製します。

概要

免疫寛容の崩壊は、多発性硬化症(MS)などの自己免疫疾患の発生につながる可能性があります。世界中で280万人がMSとともに生活していると推定^{されています1}。MSの正確な原因はまだほとんど不明ですが、自己反応性T細胞とB細胞の調節不全、およびTreg機能の欠陥は、疾患の病因に重要な役割を果たしています^2,3。

自己免疫疾患の動物モデルは、潜在的な治療法を調査するために不可欠なツールです。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルは、^MS4に関心のある研究者によってほぼ1世紀にわたって使用されてきました。初期の実験では、この病気の発生率は比較的低かった。 マイコバクテリウム と百日咳毒素を含む完全フロイントアジュバント(CFA)の導入により、マウスにおけるEAEの一貫した誘導が可能になり^ました4。最も重要なことは、CFAを中枢神経系(CNS)特異的抗原と混合して、EAEを誘導するための均質な油中水型エマルジョンを生成する必要があることです。現在利用可能な最も一般的なEAEモデルは、脳原性ペプチドによるマウスの能動免疫に基づいています。マウスの遺伝的背景は疾患感受性に重要な役割を果たしており、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG_35-55)およびミエリンプロテオリピドタンパク質(PLP_139-151)ペプチドは、それぞれC57BL/6JおよびSJLマウスにおいてEAEを誘導するために用いられている⁵。しかしながら、他のマウス系統およびCNS由来ペプチドも使用することができる。

CFA/ペプチドエマルジョンの品質は、能動免疫EAEモデルにおける疾患浸透率を決定する重要な要素です⁶。均質な油中水型エマルジョンは、水性緩衝液に溶解した脳形成ペプチドをCFAと混合することによって調製されなければならず、そうでなければ動物は疾患を発症しないであろう。CFA/ペプチドエマルジョンの調製に関する多数のプロトコルが公開されています。例としては、渦⁷、超音波処理⁸、シリンジおよび三方Tコネクタ⁹、または1つのシリンジのみ⁵の使用が含まれる。ただし、これらの方法はすべて標準化が難しく、多くの場合、長く複雑なプロトコルに関連付けられています。

上記のすべての方法と比較して、エマルジョン調製のためにここで説明する簡単な方法は、人間の違いがなく、比較的高速であるという利点を提供します。エマルジョンは、設定された速度、時間、温度で試薬を振とうするホモジナイザーによって生成され、高速で一貫した結果を保証します。この方法は、EAEモデルで疾患を誘発するだけでなく、コラーゲン誘発関節炎(CIA)や抗原誘発関節炎(AIA)などの他の自己免疫疾患モデルの研究にも使用できます⁶。したがって、この方法は、実験的自己免疫性神経炎(EAN)¹⁰、実験的自己免疫性甲状腺炎(EAT)11、自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)¹²、重症筋無力症(MG)¹³など、自己抗原を含む油中水型エマルジョンに依存する他の動物モデルで疾患を一貫して誘発するために使用できることが期待されます。この方法はまた、遅延型過敏症(DTH)などの一般的な免疫応答を一貫して誘導^するため6、癌やマラリアワクチンの送達に使用できる可能性があります(議論を参照)。

したがって、迅速(総調製時間~30分)、単純(すべての試薬を事前に調製して保存することができる)、および標準化された(エマルジョンは振とうホモジナイザーを使用して達成される)方法が開発され、ここに提示されています。このプロトコルを使用して調製されたCFA /抗原エマルジョンは、自己免疫動物モデルで一貫して疾患を誘発します。

プロトコル

すべての動物の手順は、スウェーデン動物研究委員会の慣行に従って実行され、スウェーデンのルンドマルメにある動物倫理委員会によって承認されました(許可番号:M126-16)。

注: この方法の概略フローを 図 1 に示します。

1.材料の準備

注:すべての試薬を滅菌フードで無菌的に調製し、指定された温度で分注して保管します。試薬は、効果を失うことなく最大2年間保存できます。

1. 下記のように、20 mg/mLの結核菌 を含むCFAを調製します。
   1. 100 mgの凍結乾燥 結核菌 H37RA(材料 表を参照)と5つの3.2 mmスチールビーズを7 mLチューブ( 材料表を参照)に加えます。チューブをホモジナイザー( 材料表を参照)で最高速度設定(5,000 rpm)で60秒間振とうします。
   2. 5 mLの不完全なフロイントアジュバント(IFA)をチューブに加え、最高速度で60秒間再び振とうします。IFA(現在はCFAと名付けられています)で均質化された 結核菌 のスラリーを、ビーズを残してピペット付きの新しいチューブに移し、使用するまで4°Cで保存します。
2. MOG_35-55 ペプチドの凍結乾燥粉末( 材料表参照)に超純水を加え、最終ペプチド濃度10mg/mLを得た。溶液を0.2μmのフィルターに通して滅菌します。60 μLのアリコートを調製し、使用するまで-20°Cで保存します。
   注:この実験に使用したMOG_35-55 ペプチドは、ImmunoGrade純度(~70%)であり、TFA切断され、水に容易に溶解し、C末端アミド(-_NH2)を含むため、 生体内 安定性が向上します¹⁴。ペプチドアリコートは、2回以上解凍および再凍結することはなく、使用するまで-20°Cで保存した。
3. 100 mLの百日咳毒素バッファーを調製する:2.9 gのNaClを80 mLの1x Ca^2+/Mg²⁺ 遊離PBSに溶解し、100 μLの10%Triton X-100を加えます。PBSで容量を100 mLに調整し、0.2 μmのフィルターに通して溶液を滅菌します。10 mLアリコートを準備し、使用するまで4°Cで保存します。

2. CFA/ペプチドエマルジョンの調製

1. 予防接種に必要なエマルジョンの量を計算します。この標準プロトコルでは、各マウスは、フロイントアジュバント(CFA)に分散した50μgのMOG_35-55 ペプチドおよび300μgの 結核菌 を投与されます。エマルジョンの調製に必要な各試薬(MOG_35-55 ペプチド、PBS、CFA、およびIFA)の量は、 補足ファイル1を使用して計算できます。エマルジョンのわずかな損失を補うために、全試薬の追加の20%が計算に含まれます。
   注:この研究で使用された市販のエマルジョンキット( 材料表を参照)は、滅菌ポーチ内のチューブ、スクリューキャップ、およびプランジャーで構成されています。エマルジョンキットの各チューブは最大9.6 mLを保持し、40匹のマウス(または1匹あたり100 μLのエマルジョンを使用する場合は80匹)の免疫に十分な8 x 1 mLシリンジを準備することができます。
2. スクリューキャップ付きチューブ(市販のエマルジョンキットから)と使用する試薬を氷上に置きます。
3. ステップ2.1で計算された容量に次の順序でエマルジョン成分を追加します:PBS、次にペプチド、次にCFAの 結核菌 、最後にIFAです。
4. キャップを数回締めたり緩めたりして、キャップ付きのチューブをしっかりと閉じます。チューブを手で5〜10秒間激しく振って、試薬を事前に混合します。
5. チューブを振とうホモジナイザーに入れ、ロッドで固定します。速度を最高設定に設定し、時間を60秒に設定します。実行が終了したら、チューブを氷の上に3分間置きます。同じ設定でさらに1〜2回実行を繰り返します。
6. チューブを300 x g で1分間遠心分離して、閉じ込められた空気を取り除き、エマルジョンを圧縮します。
7. チューブからキャップを外し、プランジャーをチューブに挿入し、エマルジョンの上部に達するまでゆっくりと押し下げます。チューブの下部にあるスナップオフクロージャーをねじって取り外します。
8. 注射器からプランジャーを取り外します(1 mL; 材料の表を参照)。注射器に針(好ましくは25〜27G)を加える。
9. 注射器の後端をチューブの下部にある専用ロックに取り付け、短いひねりでロックします。
10. プランジャーを軽く押して、エマルジョンをチューブから注射シリンジに移します。エマルジョンが注射器の0.15mL目盛りに達したら停止します。.
11. 注射器をチューブから分離し、空気が注射器に入らないように注意しながら、プランジャーを慎重に挿入します。エマルジョンが針から出てくるまでプランジャーを押します。
    注:この時点で、エマルジョンの一部を品質管理に使用できます(ステップ3を参照)。
12. チューブ内に存在する残りのエマルジョンについて、手順2.8〜2.11を繰り返します。
    注:高価なCFA/抗原エマルジョンの無駄を最小限に抑えるために、1mLシリンジを使用する必要があります。チューブの底部にある専用ロックに適合する他のシリンジを使用してもよい。しかしながら、より大きな体積のエマルジョンを調製する必要があるかもしれない。CFA/MOG_35-55 ペプチドエマルジョンは、EAE誘導能を失うことなく、4°Cで最大15週間保存できます。

3.エマルジョンの品質管理

1. 落下試験:20mLの冷水で満たされた滅菌済みの50mLコニカルチューブに少量のエマルジョンを追加します。チューブを閉じて、手で数秒間振ってください。小さな明確な液滴の出現は、油中水型エマルジョンの形成を裏付けています。
2. 位相差顕微鏡を用いてエマルションを調べる。
   1. 油中水粒子のサイズを分析するには、顕微鏡スライドにエマルジョンの小さな滴(2〜3 μL)を加え、カバースリップで塗りつけてから、円を描くように強く押してエマルジョンを平らにします。
   2. 塗抹されたエマルジョンを400倍の倍率の位相差顕微鏡( 材料表を参照)で調べ、エマルジョンの単層を有するフィールドに焦点を合わせる。小さな均一な灰色/白の粒子が見えることを確認します(図2A)。
3. レーザー回折を用いてエマルジョン粒子径を分析します。
   注:レーザー回折は、レーザービームを使用して粒度分布を測定します。これは、エマルジョンの究極の品質管理テストです。ここで記載した方法を用いた粒度分布の代表的な結果を 図2B に示す(詳細な説明については、Topping et ^al.6を参照されたい)。それにもかかわらず、落下試験および顕微鏡検査は、満足のいくエマルジョンが形成されたかどうかを検証するのに十分である。
   1. 粒度分析計(材料表を参照)では、分散剤の赤色レーザーと青色レーザーの両方の屈折率を1.456に設定し、サンプルの屈折率を1.33に設定します(材料表を参照)。屈折率の吸光度を0.02に設定します。
   2. ペプチドエマルジョンを含むシリンジから軽質鉱物油を含む分散ユニットに1滴加えます。エマルジョンの分散後すぐにデータ収集を開始します。
      注:粒度分布の推定には、汎用モデルを適用し、球状粒子を想定しました。

4. C57BL6/JマウスにおけるMOG _35-55 ペプチドエマルジョンを用いたEAE誘導

注:すべての実験において、5匹の8〜12週齢の雌C57BL6 / Jマウスが使用されました。

1. 免疫の前に、2.5%気化したイソフルランを用いてマウスを麻酔し、しっかりとつま先ピンチを用いて確認する。
2. 1 mLシリンジを使用して各マウスを後腹の右側と左側の2つの異なる部位に、50 μgのMOG_35-55 ペプチドを1:1(v / v)比のペプチド/ CFAで含む200 μLのエマルジョンを皮下注射します。
3. エマルジョンによる免疫の少なくとも1.5時間後、および24時間後に、腹腔内注射(左側に100 μL、右側に100 μL)を介して、各マウスに200 μLの百日咳毒素中の百日咳菌菌の合計80 ngを投与します。
   注:百日咳毒素による腹腔内注射の正確な局在化は、排液リンパ節¹⁵におけるT細胞の活性化に不可欠であることが示されている。
4. オプション:ステップ4.2を繰り返して、7日目(一部のプロトコル¹⁶で使用されているように)にMOG_35-55ペプチドを再度注入します。
   注意: 最も重要なことは、MOG / CFAまたは百日咳毒素を含む予防接種に使用される注射器と針がバイオハザードバッグ/容器に適切に廃棄されていることを確認することです。
5. 前述のように0〜6のスケールを使用して、臨床スコアを毎日評価します⁶。

結果

CFA/MOGエマルジョンを調製するための迅速でシンプルで標準化されたプロトコルを 図1に示します。この方法は、最近、他の場所6^{に記載されている。}CFA/MOGエマルジョンは、従来のシリンジ法やボルテックス法などの他の方法で調製することもできます。これらの方法は、エマルジョンの品質を評価することによってここで比較されました。すべての方?...

ディスカッション

抗原/フロイントアジュバントなどの油中水型エマルジョンは、EAE¹⁷を誘導するために半世紀以上にわたって使用されてきました。現在、ヒトの影響に依存しない抗原乳剤を調製するための標準化された方法はありません。シリンジを使用した手動混合はほとんどの研究室で標準的ですが、この方法は時間がかかり、多くの場合、材料の過度の損失をもたらし、品質は準備す?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Injection syringe	B. Braun	9166017V
1 mL Injection syringe	Sigma-Aldrich	Z683531
7 ml empty tubes with caps	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	7 mL tube
50 mL sterile centrifuge tube	Fisher Scientific	10788561	50 mL tube
Bordetella pertussis toxin	Sigma-Aldrich	P2980	Store at -20 °C
Dispersant, light mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Store at RT
Emulsion kit	Bertin-Instruments	D34200.10 ea	Containing a tube, cap, and plunger
Incomplete Freund's Adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Store at +4 °C
Mastersizer 2000	Malvern Panalytical	N/A	Particle size analyzer
Minilys-Personal homogenizer	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	Shaking homogenizer
MOG 35-55 Peptide	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	FDA-approved oil adjuvant
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm	Fisher Scientific	17124381	Sterlie filter
PBS, Ca2+/Mg2+ free	Thermo Fisher Scientific	14190144	PBS
Phase-Constrast Microscope	Olympus	BX40-B
Steel Beads 3.2 mm	Fisher Scientific	NC0445832	Autoclave and store at RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648463	Store at RT