JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نصف هنا طريقة محددة زمنيا للتعامل بفعالية مع المسارات التنموية الحرجة في مشيمة الفأر في الجسم الحي. يتم إجراء ذلك من خلال الحقن والتثقيب الكهربائي لبلازميدات كريسبر في مشيمة السدود الحامل في اليوم الجنيني 12.5.

Abstract

المشيمة هي عضو أساسي ينظم ويحافظ على نمو الثدييات في الرحم. المشيمة مسؤولة عن نقل العناصر الغذائية والفضلات بين الأم والجنين وإنتاج وتوصيل عوامل النمو والهرمونات. تعد التلاعب الجيني المشيمي في الفئران أمرا بالغ الأهمية لفهم الدور المحدد للمشيمة في تطور ما قبل الولادة. الفئران المعدلة وراثيا المعبرة عن المشيمة لها فعالية متفاوتة ، ويمكن أن تكون الطرق الأخرى لمعالجة الجينات المشيمة بدائل مفيدة. تصف هذه الورقة تقنية لتغيير التعبير الجيني المشيمي مباشرة باستخدام معالجة الجينات كريسبر ، والتي يمكن استخدامها لتعديل التعبير عن الجينات المستهدفة. باستخدام نهج جراحي متقدم نسبيا ، تخضع السدود الحامل لبضع البطن في اليوم الجنيني 12.5 (E12.5) ، ويتم تسليم بلازميد كريسبر بواسطة ماصة زجاجية دقيقة إلى المشيمة الفردية. يتم إلكتروبيد البلازميد على الفور بعد كل حقنة. بعد تعافي السد، يمكن أن تستمر المشيمة والأجنة في النمو حتى التقييم في وقت لاحق. يمكن أن يحدد تقييم المشيمة والنسل بعد استخدام هذه التقنية دور وظيفة المشيمة المحددة زمنيا في التنمية. سيسمح هذا النوع من التلاعب بفهم أفضل لكيفية تأثير علم الوراثة المشيمة ووظيفتها على نمو الجنين وتطوره في سياقات مرضية متعددة.

Introduction

المشيمة هي عضو أساسي يشارك في نمو الجنين. يتمثل الدور الرئيسي للمشيمة في توفير العوامل الأساسية وتنظيم نقل العناصر الغذائية والفضلات من وإلى الجنين. تتكون مشيمة الثدييات من أنسجة الجنين والأم ، والتي تشكل واجهة الجنين والأم ، وبالتالي ، فإن الوراثة لكل من الأم والجنين تؤثر على الوظيفة1. يمكن أن تؤدي التشوهات الوراثية أو ضعف وظيفة المشيمة إلى تغيير نمو الجنين بشكل كبير. أظهرت الأعمال السابقة أن علم الوراثة المشيمية وتطورها يرتبطان بالتطور المتغير لأنظمة أعضاء معينة في الجنين. على وجه الخصوص ، ترتبط التشوهات في المشيمة بالتغيرات في دماغ الجنين والقلب ونظام الأوعية الدموية2،3،4،5.

يلعب نقل الهرمونات وعوامل النمو والجزيئات الأخرى من المشيمة إلى الجنين دورا رئيسيا في نمو الجنين6. لقد ثبت أن تغيير إنتاج المشيمة لجزيئات معينة يمكن أن يغير النمو العصبي. يمكن أن يزيد التهاب الأم من إنتاج السيروتونين عن طريق تغيير التعبير الجيني الأيضي للتريبتوفان (TRP) في المشيمة ، مما يؤدي لاحقا إلى تراكم السيروتونين في دماغ الجنين7. وقد وجدت دراسات أخرى تشوهات المشيمة جنبا إلى جنب مع عيوب القلب. يعتقد أن التشوهات في المشيمة تساهم في عيوب القلب الخلقية ، وهو أكثر العيوب الخلقية شيوعا لدى البشر8. حددت دراسة حديثة العديد من الجينات التي لها مسارات خلوية مماثلة في كل من المشيمة والقلب. إذا تعطلت ، يمكن أن تسبب هذه المسارات عيوبا في كلا الجهازين9. قد تؤدي العيوب في المشيمة إلى تفاقم عيوب القلب الخلقية. يعد دور علم الوراثة المشيمة ووظيفتها في تطوير نظام أعضاء الجنين المحدد مجالا ناشئا للدراسة.

الفئران لديها المشيمة الدموية وغيرها من ميزات المشيمة البشرية ، مما يجعلها نماذج مفيدة للغاية لدراسة الأمراض البشرية1. على الرغم من أهمية المشيمة ، يوجد حاليا نقص في التلاعب الجيني المستهدف في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، يوجد حاليا المزيد من الخيارات المتاحة للضربة القاضية أو الضربات القاضية أكثر من الإفراط في التعبير أو التلاعب باكتساب الوظيفة في المشيمة10. هناك العديد من خطوط التعبير عن الكري المعدلة وراثيا للتلاعب الخاص بالمشيمة ، كل منها في سلالات الأرومة الغاذية المختلفة في نقاط زمنية مختلفة. وتشمل هذه Cyp19-Cre و Ada / Tpbpa-Cre و PDGFRα-CreER و Gcm1-Cre 11،12،13،14. في حين أن جينات التحوير Cre هذه فعالة ، فقد لا تكون قادرة على التلاعب ببعض الجينات في نقاط زمنية محددة. هناك طريقة أخرى شائعة الاستخدام إما للتعبير الجيني عن الضربة القاضية أو الإفراط في التعبير عن التعبير الوراثي المشيمي وهي إدخال ناقلات الفيروسات العدسية في مزرعة الكيسة الأريمية ، مما يؤدي إلى التلاعب الجيني الخاص بالأرومة الغاذية15,16. تسمح هذه التقنية بتغيير قوي في التعبير الجيني المشيمي في وقت مبكر من التطور. تم استخدام تداخل الحمض النووي الريبي في الجسم الحي بشكل ضئيل في المشيمة. يمكن إجراء إدخال بلازميدات shRNA بشكل مشابه لتقنية CRIPSR الموضحة في هذه الورقة. وقد تم ذلك في E13.5 لتقليل تعبير PlGF بنجاح في المشيمة ، مع تأثيرات على الأوعية الدموية في الدماغالنسل 17.

بالإضافة إلى التقنيات التي تستخدم في المقام الأول للضربة القاضية أو الضربة القاضية ، يتم إجراء الإفراط في التعبير بشكل شائع مع الفيروسات الغدية أو إدخال بروتين خارجي. التقنيات المستخدمة للإفراط في التعبير لها معدلات نجاح متفاوتة وقد تم إجراؤها في الغالب في وقت لاحق من الحمل. للتحقيق في دور عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 (IGF-1) في وظيفة المشيمة ، تم إجراء نقل جين المشيمة بوساطة غدية للحث على الإفراط في التعبير عن جين IGF-1 18,19. تم إجراء ذلك في وقت متأخر من حمل الفئران على E18.5 عن طريق حقن المشيمة المباشر. لتوفير خيارات إضافية والتحايل على الإخفاقات المحتملة للتلاعبات الجينية المشيمية الراسخة ، مثل فشل تركيبة Cre-Lox ، والسمية المحتملة للفيروسات الغدية ، والآثار غير المستهدفة ل shRNA ، يمكن استخدام معالجة CRISPR المباشرة للمشيمة في الجسم الحي 20،21،22. تم تطوير هذا النموذج لمعالجة عدم وجود نماذج الإفراط في التعبير ولإنشاء نموذج يتسم بالمرونة.

تعتمد هذه التقنية على عمل Lecuyer et al. ، حيث تم استهداف بلازميدات shRNA و CRISPR مباشرة في الجسم الحي إلى مشيمة الفئران لتغيير تعبير PlGF 17. يمكن استخدام هذه التقنية لتغيير التعبير الجيني المشيمي مباشرة باستخدام معالجة كريسبر في نقاط زمنية متعددة. لهذا العمل ، تم اختيار E12.5. نضجت المشيمة عند هذه النقطة وهي كبيرة بما يكفي للتلاعب بها ، مما يسمح بإدخال بلازميد كريسبر معين على E12.5 ، والذي يمكن أن يكون له تأثير كبير على نمو الجنين من منتصف إلى أواخر الحمل23,24. على عكس الأساليب المعدلة وراثيا ، ولكن على غرار التحريضات الفيروسية أو تداخل الحمض النووي الريبي ، تسمح هذه التقنية بالإفراط في التعبير أو الضربة القاضية في نقاط زمنية معينة باستخدام نهج جراحي متقدم نسبيا ، وبالتالي تجنب ضعف المشيمة المحتمل أو الفتك الجنيني من التغييرات السابقة. نظرا لأن عددا قليلا فقط من المشيمة يتلقى البلازميد التجريبي أو الرقابي داخل القمامة ، فإن النهج يسمح بنوعين من الضوابط الداخلية. هذه الضوابط هي تلك التي يتم حقنها وتزويدها بالكهرباء باستخدام بلازميد التحكم المناسب وتلك التي لا تتلقى أي معالجة مباشرة. تم تحسين هذه التقنية لإنشاء تعبير مفرط عن جين IGF-1 في مشيمة الفأر عبر وسيط التنشيط التآزري (SAM) CRISPR Plasmid. تم اختيار جين IGF-1 ، حيث أن IGF-1 هو هرمون نمو أساسي يتم تسليمه إلى الجنين ويتم إنتاجه بشكل أساسي في المشيمة قبل الولادة25,26. ستسمح تقنية كريسبر الجديدة التي تستهدف المشيمة بالتلاعب المباشر للمساعدة في تحديد العلاقة بين وظيفة المشيمة ونمو الجنين.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا والامتثال للوائح الفيدرالية وسياسة جامعة أيوا وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية.

1. الحيوانات والتربية

  1. حافظ على الحيوانات في دورة ضوء النهار لمدة 12 ساعة مع الطعام والماء الإعلاني.
  2. استخدم إناث الفئران CD-1 الذين تتراوح أعمارهم بين 8-15 أسبوعا. استخدم وجود سدادة جماعية لتحديد E0.5.
  3. على E0.5 ، إيواء منفردة السدود الحامل.

2. معايرة الماصة الدقيقة

ملاحظة: يجب إجراء معايرة الماصة الدقيقة قبل الجراحة عندما يكون ذلك ممكنا.

  1. قبل صنع ومعايرة الماصة الدقيقة ، قم بتخفيف جميع البلازميدات إلى التركيز الموصى به (0.1 ميكروغرام / ميكرولتر) في الماء الخالي من DNase. امزج البلازميد مع صبغة Fast Green المخففة بشكل مناسب (1 ميكروغرام / ميكرولتر في PBS) (تركيز البلازميد النهائي: 0.06 ميكروغرام / ميكرولتر).
  2. اسحب الماصات الدقيقة باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية 10 سم بقطر خارجي 1.5 مم وقطر داخلي 0.86 مم مع مجتذب ماصة دقيقة.
  3. قطع بعناية طرف micropipette (2-3 مم) مع ملقط معقمة.
  4. قم بتحميل الماصة الدقيقة في طرف شعري دقيق متصل بحاقن دقيق. تأكد من توصيل الحاقن الدقيق بآلة الحقن المجهري وأن هناك مستويات كافية من النيتروجين لمعايرة الماصة الدقيقة.
  5. بمجرد توصيل الماصة الدقيقة بالحاقن الدقيق ، قم بتحميلها بمحلول صبغة Fast Green لإجراء المعايرة (1 ميكروغرام / ميكرولتر في PBS). قم بمعايرة الماصة الدقيقة لحقن حجم يبلغ حوالي 3.5 ميكرولتر. أفرغ ("امسح") الماصة الدقيقة استعدادا لتحميل محاليل البلازميد على النحو التالي.
    ملاحظة: كل ماصة صغيرة ستكون مختلفة قليلا. لتجنب إتلاف المشيمة أثناء الحقن ، يجب ضبط وقت الحقن بين 0.5-1.5 ثانية. يجب ضبط الضغط بين 1-8.5 رطل / بوصة مربعة. معايرة كل ماصة صغيرة على حدة ؛ إذا تعذر معايرة الماصة الدقيقة ضمن هذه المعلمات ، فلا ينبغي استخدامها.

3. الجراحة (الشكل 1 أ)

ملاحظة: للتحضير ، قم بتنظيف أسطح كل من مناطق التحضير والجراحة بنسبة 70٪ من الإيثانول. ضع وسادة سفلية ماصة في منطقة التحضير. في منطقة الجراحة ، ضع وسادة تدفئة لأسفل ، ثم ضع وسادة سفلية ماصة فوقها. تعقيم جميع الأدوات قبل الجراحة. يجب أن يكون الوقت الذي يكون فيه السد تحت التخدير أقل من 1 ساعة.

  1. التخدير
    1. تطبيق 5 ملغ/ كغ من مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية (ميلوكسيكام) أو مسكن آخر معتمد لدى السد الحامل قبل 30 دقيقة إلى 1 ساعة من الجراحة.
    2. ضع السد الحامل في غرفة تحريض متصلة بمبخر إيزوفلوران.
    3. اضبط المرذاذ على 4٪ إيزوفلوران و 3.5 لتر / دقيقة أكسجين.
    4. بمجرد تأكيد التخدير من خلال عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم وانخفاض معدل التنفس ، قم بإزالة السد من غرفة الحث إلى منطقة التحضير.
  2. التحضير للجراحة
    1. في منطقة التحضير ، ضع السد ضعيفا مع مخروط الأنف.
    2. قلل المرذاذ إلى 2٪ إيزوفلوران و 3.5 لتر / دقيقة أكسجين أثناء وجود السد في مخروط الأنف.
    3. حلق بطن السد جيدا وإزالة الفراء الزائد. قم بطلاء البطن المحلوق بمحلول البوفيدون و 70٪ من الإيثانول ثلاث مرات باستخدام أدوات تطبيق معقمة ذات رؤوس قطنية. تطبيق الطبقة النهائية من محلول البوفيدون. لمنع جفاف القرنية ، ضع الجل المسيل للدموع الاصطناعي على كلتا عيني السد (الشكل 2 أ ، ب).
    4. بعد التحضير ، انقل السد مع مخروط الأنف إلى منطقة الجراحة المخصصة.
  3. بضع البطن الرحمي
    ملاحظة: استخدم قفازات معقمة طوال العملية الجراحية. قم بتغيير القفازات في حالة ملامسة أي سطح غير معقم.
    1. في منطقة الجراحة ، ضع السد مستلقا ، وقم بتثبيت مخروط الأنف في مكانه بشريط. اضبط وسادة التدفئة أسفل وسادة الامتصاص على 45 درجة مئوية.
    2. باستخدام ملقط ومقص ، قم بعمل شق خط الوسط تقريبا 2 سم عبر الجلد. استخدم الملقط لخيمة الجلد ، وقم بعمل شق عمودي في الجلد. بعد ذلك ، قم بعمل شق آخر مماثل الحجم عبر الصفاق لفضح قرون الرحم. باستخدام الملقط ، خيمة الصفاق أثناء عمل شق عمودي (الشكل 2C ، D).
      ملاحظة: قد يؤدي عدم وضع الخيمة بشكل صحيح أثناء شق الصفاق إلى شق قاتل في الأمعاء.
    3. تدليك بلطف قرون الرحم من خلال شق عن طريق الضغط على جانبي البطن. افعل ذلك عن طريق توجيه الرحم بعناية بدون أدوات ، باستخدام الأصابع فقط لتجنب الإصابة العرضية. ضعي الرحم المكشوف فوق ستارة جراحية معقمة تغطي بطن السد وحافظي على رطوبته طوال الجراحة باستخدام قطرات من محلول ملحي معقم ، والذي يمكن تسخينه إلى 30 درجة مئوية قبل الاستخدام حسب الحاجة (الشكل 2E ، F).
      ملاحظة: يمكن تحديد قرون الرحم كما هو موضح في Wang et al.27.
    4. بمجرد تعرض الرحم ، حدد ثلاثة أزواج من المشيمة للتلاعب.
      ملاحظة: يمكن تحديد المشيمة كما وصفها Elmore et al.24. لتحقيق أقصى قدر من بقاء الأجنة ، لا ينبغي علاج أكثر من 6 مشيمات. إذا كان هناك أقل من 12 جنينا ، فلا ينبغي حقن أكثر من 4 مشيمة. اختر مشيمتين متجاورتين بحيث يتلقى أحدهما حقنة تحكم والآخر يتلقى البلازميد التجريبي. يسمح استخدام مشيمتين متجاورتين بمقارنة أفضل للمشيمة في مواقع مماثلة في الرحم ويتيح أيضا زيادة معدل البقاء على قيد الحياة. يتم اختيار أزواج المشيمة المختارة عشوائيا ومتباعدة في جميع أنحاء قرني الرحم (الشكل 1B).
    5. سجل موقع التلاعب بالمشيمة وتنظيم الأجنة داخل قرون الرحم بحيث يمكن التعرف على الأجنة والمشيمة أثناء الجمع ، حيث سيحمل سد واحد كلا من المشيمة / الأجنة المعالجة تجريبيا.
  4. حقن المشيمة والتثقيب الكهربائي لبلازميد التحكم
    ملاحظة: للحفاظ على تقنية التعقيم ، قم بتعقيم المجاذيف الكهربائية والحاقن الدقيق بمعقم بارد قبل الاستخدام. قم بتغيير القفازات في حالة ملامسة أي سطح غير معقم.
    1. باستخدام الماصة الدقيقة المعايرة ، قم بتحميل كمية كافية من بلازميد التحكم المناسب لثلاث حقن. قم بإجراء جميع الحقن على عمق ~ 0.5 مم أفقيا في المشيمة بين النفضية (البيضاء) ومنطقة الوصلات (الأحمر الداكن) (الشكل 3A-F).
    2. إجراء الحقن في المشيمة السيطرة الثلاثة.
      ملاحظة: قم بإجراء جميع حقن البلازميد الضابطة قبل الحقن التجريبية لتجنب التلوث المتبادل للبلازميدات باستخدام الماصة الدقيقة. سيسمح ذلك باستخدام نفس الماصة الدقيقة ، حيث أن تغيير الماصات الدقيقة ووقت المعايرة يزيد بشكل كبير من وقت الجراحة ويقلل من بقاء السد.
    3. إجراء التثقيب الكهربائي للمشيمة المحقونة بالبلازميد في غضون 2 دقيقة من الحقن.
    4. للتثقيب الكهربائي ، استخدم زوجا من المجاذيف مقاس 3 مم متصلة بآلة التثقيب الكهربائي. لضمان كفاءة دمج كريسبر وصلاحية الأجنة، استخدم إعدادات التثقيب الكهربائي التالية: 2 نبضة، 30 فولت، 30 مللي ثانية نبضة، 970 مللي ثانية نبضة، أحادية القطب.
    5. بعد الحقن ولكن قبل التثقيب الكهربائي مباشرة ، قم بتغطية أماكن التلامس بمحلول ملحي معقم ، مع تطبيق المحلول الملحي بدقة على المواقع الثلاثة على جدار الرحم والمجاديف بقطارة أو حقنة.
    6. اضغط برفق على مجاذيف التثقيب الكهربائي على الجوانب الجانبية للمشيمة. ضع مجداف الأنود فوق موقع الحقن والكاثود المقابل مباشرة (الشكل 4A-C).
    7. اضغط على النبض الموجود على آلة التثقيب الكهربائي ، وانتظر حتى تكتمل النبضتان قبل إزالة مجاذيف التثقيب الكهربائي.
      ملاحظة: غالبا ما ترى كمية صغيرة من الرغوة البيضاء بين المجاذيف والمشيمة أثناء النبضات. إذا لم يحدث هذا ، تحقق من الجهد من المجاذيف باستخدام الفولتميتر قبل الاستخدام مرة أخرى. إذا كانت القراءة على الفولتميتر لا تتطابق مع إعداد جهد التثقيب الكهربائي ، فإن المجاذيف لا تعمل.
  5. حقن المشيمة والتثقيب الكهربائي للبلازميد التجريبي
    1. اتبع نفس الإرشادات الواردة في الخطوة 3.4.1. إلى الخطوة 3.4.2. باستخدام البلازميد التجريبي بدلا من بلازميد التحكم.
    2. إجراء التثقيب الكهربائي لجميع المشيمة التجريبية الثلاثة المحقونة في غضون 2 دقيقة من الحقن. يجب أن يتم ذلك بنفس الطريقة التي يتم بها حقن بلازميدات التحكم. اتبع الخطوة 3.4.4. إلى الخطوة 3.4.7.
  6. الانتهاء من الجراحة
    1. بمجرد اكتمال معالجة المشيمة ، قم بتدليك قرون الرحم برفق داخل تجويف البطن باستخدام الأصابع فقط (الشكل 5 أ).
    2. أولا ، قم بإجراء خيوط مفردة مزدوجة العقد على طبقة الصفاق باستخدام خيوط قابلة للذوبان مطلية ومضفرة بطول 45 سم مع سبيكة إبرة 13 مم 3/8c. باعد بين الغرز بمسافة 2-3 مم (الشكل 5 ب).
    3. بعد خياطة طبقة الصفاق ، قم بخياطة الجلد بخيوط قابلة للذوبان. عقدة ثلاثية الغرز المفردة بمسافة 2-3 مم لضمان عدم تمكن السد من التراجع عن الخياطة (الشكل 5C).
    4. بمجرد اكتمال الخياطة ، اضبط الأيزوفلوران على 1٪ والأكسجين على 3.5 لتر / دقيقة ، وقم بتطبيق لاصق الأنسجة على الغرز على الجلد (الشكل 5 د).
      ملاحظة: لاصق الأنسجة اختياري ولكن يوصى به لمنع إعادة فتح الشق بسبب مضغ السد.
    5. عندما يجف لاصق الأنسجة ، قم بإيقاف تشغيل المرذاذ وإزالة السد من منطقة الجراحة. ضع السد في قفص داعم على ظهره.

4. رعاية ومراقبة ما بعد الجراحة

  1. اسمح للسد الحامل بالتعافي في قفص نظيف تحت الإشراف لمدة لا تقل عن 30 دقيقة لضمان عدم حدوث مضاعفات فورية للجراحة. راقب حتى يصبح متنقلا بالكامل ويمكن أن ينقلب على قدميه دون مساعدة. منزل منفرد السد بعد الجراحة.
  2. اتبع الرعاية المؤسسية بعد الجراحة والمراقبة حتى جمع الأجنة. سجل وزن السد ، وراقب الغرز وموقع الشق يوميا.

5. E14.5 جمع المشيمة

  1. في E14.5 ، قم بتخدير السد بعمق باستخدام كوكتيل الكيتامين / الزيلازين (1 مجم / مل من الكيتامين و 0.1 مجم / مل زيلازين) ، ثم قم بخلع عنق الرحم للسد.
  2. قم بعمل شق على شكل حرف V في بطن السد بالمقص ، وأزل الرحم. ضعيها على الفور على طبق بتري 5 سم على الثلج. باستخدام ملقط ، قم بإزالة الجنين والمشيمة المقابلة بعناية من الرحم.
    ملاحظة: احتفظ بسجل لموقع الجنين والمشيمة المقابلة في قرون الرحم لتحديد أي منها تلقى التلاعب المباشر أثناء الجراحة.
  3. سجل أوزان المشيمة. باستخدام ملقط وشفرات حلاقة خالية من الحمض النووي الريبي ، اقطع المشيمة إلى نصفين أسفل خط الوسط. ضع نصفا في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية. اقطع النصف المتبقي إلى النصف مرة أخرى ، وقم بتخزين الربعين المتبقيين عند -80 درجة مئوية في أنبوبين ، أحدهما مزود بكاشف تخزين الحمض النووي الريبي.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأجنة وأنسجة الأم الأخرى من المجموعة عند -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

6. تحليل التعبير الجيني المشيمي

  1. استخدم ربع المشيمة المخزنة عند -80 درجة مئوية في كاشف تخزين الحمض النووي الريبي.
  2. قم بمعالجة المشيمة ل qPCR كما هو موضح في Elser et al. باستخدام طريقة Trizol لعزل الحمض النووي الريبي ، ومقياس الطيف الضوئي لتركيز الحمض النووي الريبي ، ومجموعة تخليق cDNA ، و qPCR مع SYBR Green Master Mix28. بدلا من مجموعة Turbo DNAfree DNA المشار إليها في Elser et al. ، استخدم مجموعة RNAcleanup بعد عزل Trizol RNA للتأكد من أن العينات لا تحتوي على ملوثات28.
    ملاحظة: اقرأ ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS) ل Trizol ، واستخدمها في غطاء دخان كيميائي.
  3. تقييم إدخال البلازميد لبلازميد التحكم باستخدام بادئات GFP والبلازميد التجريبي باستخدام بادئات BLAST (الاشعال المدرجة في الجدول التكميلي 1). استخدم قيمة التصوير المقطعي المحوسب لتحديد وجود البلازميد.
    ملاحظة: قيم التصوير المقطعي المحوسب فوق 35 هي إيجابيات كاذبة ، ويجب اعتبار تلك التي تقل عن 35 فقط مؤشرا إيجابيا على إدخال البلازميد بنجاح.
  4. تقييم تعبير المشيمة IGF-1 الطبيعي لجين التدبير المنزلي 18s (الاشعال المدرجة في الجدول التكميلي 1). استخدم طريقة ddCT لحساب تغير الطي ، ثم احسب تغيير الطي الطبيعي للعينات التجريبية إلى متوسط تغيير الطي لعينات التحكم.

7. تحليل مستوى البروتين المشيمي

  1. استخدم ربع المشيمة المخزنة عند -80 درجة مئوية. تجانس الأنسجة في محلول عازل مصنوع من 11.5 mM Tris HCl و 5 mM MgCl 2 ومثبط الأنزيم البروتيني 10 mM في diH2O مع درجة حموضة نهائية تبلغ 7.4. استخدم الخالط المحمول والمدقة لتفتيت الأنسجة.
    ملاحظة: يجب ألا تتجاوز العينة 10٪ من حجم المخزن المؤقت.
  2. قم بتخفيف العينات المتجانسة في المخزن المؤقت عند 1:12 ، بحيث تكون ضمن النطاق الذي يمكن اكتشافه لمجموعة مقايسة حمض البيسينتشونينيك (BCA). قم بإجراء مقايسة BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وحدد البروتين الكلي باستخدام قارئ اللوحة.
  3. بعد إجراء مقايسة BCA ، قم بتطبيع جميع العينات إلى نفس تركيز البروتين الكلي البالغ 2 مجم / مل ل IGF-1 ELISA ، كما حدث في Gumusoglu et al.29.
  4. قم بإجراء IGF-1 ELISA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وحدد مستويات بروتين IGF-1 باستخدام قارئ لوحة باستخدام منحنى تركيز قياسي.

8. التحقق المكاني من CRIPSR باستخدام وسم التهجين الفلوري في الموقع

  1. بعد تثبيت نصفي المشيمة بشكل مناسب في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية لمدة 1-3 أيام ، انقلها إلى 20٪ سكروز عند 4 درجات مئوية قبل تجميدها في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT).
  2. تقسم المشيمة المدمجة في OCT إلى نصفين في كريوستات -20 درجة مئوية إلى أقسام 10 ميكرومتر ، وتضعها على شرائح ليتم تصنيفها. قسم المشيمة إلى نصفين بحيث تكون المناطق الفرعية الثلاث مرئية. قم بتخزين الشرائح في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يتم استخدامها للتهجين في الموقع .
  3. قم بإجراء وضع العلامات على التهجين الفلوري في الموقع (FISH) باتباع بروتوكولات الشركة المصنعة. قم بتهجين شريحة واحدة باستخدام مسبار dCas9-3xNLS-VP64 وشريحة "شقيقة" ثانية من نفس المشيمة باستخدام مسبار Prl8a8.
    ملاحظة: يكتشف مسبار dCas9-3xNLS-VP64 وجود بلازميد التعبير المفرط. يسلط مسبار Prl8a8 الضوء على الأرومات الإسفنجية في منطقة الوصلة ، مما يسمح بتحديد المناطق الفرعية للمشيمة. يتم تمييز هذين المجسين على شرائح "شقيقة" منفصلة لتجنب تداخل التألق متعدد القنوات مع التألق الذاتي الأخضر في المشيمة.
  4. قم بتسمية كلا المجسين بصبغة الكشف (Opal 620). بعد الانتهاء من بروتوكول الشركة المصنعة ل FISH ، قم بتطبيق وسيط تركيب DAPI ، وضع غطاء على الشريحة. أغلق غطاء الغطاء بطلاء أظافر شفاف.
  5. قم بتصوير الشرائح على مجهر مضان مركب قائم ، وقم بمعالجتها باستخدام برنامج مناسب لمعالجة الصور. هنا ، تم استخدام برنامج CellSens.

النتائج

نتائج الإجراءات العامة (الشكل 6)
في الدراسة ، كانت هناك ثلاث مجموعات تم التلاعب بها. وشملت هذه المشيمة التي تم حقنها ببلازميد التحكم العام CRISPR Cas9 (Cas9 Control) ، أو بلازميد CRISPR للتحكم في التنشيط (التحكم في الفعل) ، أو بلازميد تنشيط IGF-1 SAM (Igf1-OE). يعتبر Cas9 Control ...

Discussion

المشيمة هي المنظم الأساسي لنمو الجنين ، وكما لوحظ سابقا ، فإن التغيرات في التعبير الجيني للمشيمة أو وظيفتها قد تؤثر بشكل كبير على نمو الجنين6. يمكن استخدام البروتوكول الموضح هنا لإجراء معالجة مستهدفة في الجسم الحي بتقنية كريسبر لمشيمة الفأر باستخدام نهج جراحي متقدم نسبي...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يقر المؤلفون بمصادر التمويل التالية: R01 MH122435 و NIH T32GM008629 و NIH T32GM145441. يشكر المؤلفون مختبرات الدكتور فال شيفيلد والدكتور كالفن كارتر في جامعة أيوا على استخدام غرفة الجراحة والمعدات الخاصة بهم ، وكذلك الدكتور إريك فان أوترلو والدكتور نانداكومار نارايانان والدكتور ماثيو ويبر لمساعدتهم في الفحص المجهري. كما يشكر المؤلفون الدكتورة سارة ماورير ومايا إيفانز وسريليخا كوندو على مساعدتهم في العمليات الجراحية التجريبية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml TubesUSA Scientific Inc1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBSThermo Fisher ScientificJ61899.AP
96 Well plateCornings3598For BCA kit
Absorbent UnderpadsFisher Scientific14-206-62
Activation Control PlasmidSanta Cruz Biotechnologysc-437275Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse TranscriptaseNew England BiolabsM0277LUse for cDNA synthesis
Anesthetic Gas VaporizorVetamacVAD-601TTVAD-compact vaporizer
Artifical Tear GelAkornNDC 59399-162-35
BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23227Protein quantification
BiovortexerBellco Glass, Inc.198050000Hand-held tissue homogenizer
CellSens SoftwareOlympusV4.1.1Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810EppendorfEP022628168Plate centrifuge
ChloroformThermo Fisher ScientificJ67241-APRNA isolation
Cotton Tipped ApplicatorsProAdvantage77100Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control PlasmidSanta Cruz Biotechnologysc-418922Dnase-free water provided for dilution
CryoStatLeicaCM1950
Dissection MicroscopeLeicaM125 CUsed for post-necroscopy imaging
Dissolvable SuturesMed Vet InternationalJ385H
Distilled WaterGibco15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Thermo fisher Scientific14190144(-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine)BTX Harvard Apparatus45-0662Generator only
Electric RazorWahlCL9990Kent Scientific
Electroporation paddles/TweezertrodesBTX Harvard Apparatus45-04873 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PKGrainger21RK94Placenta embedding cassettes
EthanolThermo Fisher Scientific268280010
F-Air CanistersPenn Veterinary Supply IncBIC80120Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCFSigmaF7252-5GDissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader)Fisher Scientific14377576Can be used for BCA and ELISA
ForcepsVWR82027-386Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10%Sigma AldrichHT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette)Sutter InstrumentB150-86-10O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x)Thermo Scientific1861281Protein homogenization buffer
Heating PadThermotechS766DDigitial Moist Heating Pad
HemostatsVWR10806-188Fully surrated jaw; curved
Hot Water BathFisher Scientific20253Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1)Santa Cruz Biotechnologysc-421056-ACTDnase-free water provided for dilution
Induction ChamberVetamac941443No specific liter size required
IsofluranePiramal Pharma LimitedNDC 66794-013-25
Isoproponal/2-ProponalFisher ScientificA451-4RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/mlAkornNDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum ChlorideSigma Aldrich63069-100ML1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with BarcodeFisher Scientific4309849Barcoded plates not required
Microcapillary TipEppendorf5196082001Attached to BTX Microinjector
MicroinjectorBTX Harvard Apparatus45-0766Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine)BTX Harvard Apparatus45-0751MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97Sutter InstrumentP-97Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker)scilogex822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA KitR & D SystemsMG100
NeedlesBD - Becton, Dickson, and Company30510630 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen TankLinde7727-37-9Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID)Norbrook Laboratories LimitedNDC 55529-040-10Analesgic such as Meloxicam
Nose ConeVetamac9216099-14 mm
Opal 620 detection dyeAkoya BiosciencesSKU FP1495001KTUsed for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) CompoundSakura4583
Oxygen TankLinde7782 - 44 - 7Medical grade oxygen
PestlesUSA Scientific Inc14155390
Povidone-Iodine Solution, 5%Avrio Health L.P.NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4367659Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers)New England BiolabsS1330SUse for cDNA synthesis
Razor BladeGrainger26X080
RNA Cleanup Kit & ConcentratorZymo ResearchR1013
RNALaterThermo Fisher ScientificAM7021
RNAscope kit v.2.5Advanced Cells Diagnostics323100Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2Advanced Cells Diagnostics 528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64Advanced Cells Diagnostics527421
Roto-Therm MiniBenchmarkR2020Dry oven for in situ hybridization
ScissorsVWR82027-578Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline)HospraNDC 0409-4888-03Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate]Research Product International03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher ChemicalFisher ScientificSS277Protein homogenization buffer
SteamerBellaB00DPX8UBA
Sterile Surgical DrapeBusse696Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60Leica3800160
SyringesBD - Becton, Dickson, and Company309659BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 FluorometerFisher Scientific13-400-525This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive3M1469SBVetBond
Tris HClThermo Fisher Scientific155680251M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ ReagentThermo Fisher Scientific15596018RNA isolation
TSA Buffer PackAdvanced Cells Diagnostics322810Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-CircuitVetamac40200Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence MicroscopeOlympusBX61VSUsed for FISH imaging
Vectorshield with DAPIVector LaboratoriesH-1200Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well BlockThermo Fisher Scientific4453536This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail ColorAmazonC450B
Xylazine 20mg/mlAnased343730_RX

References

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. . Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

194 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved