Mouse In Vivo Placental Alvo CRISPR Manipulação

Resumo

Aqui descrevemos um método tempo-específico para manipular efetivamente vias críticas de desenvolvimento na placenta de camundongos in vivo. Isto é realizado através da injeção e eletroporação de plasmídeos CRISPR nas placentas de fêmeas grávidas no dia embrionário 12.5.

Resumo

A placenta é um órgão essencial que regula e mantém o desenvolvimento dos mamíferos no útero. A placenta é responsável pela transferência de nutrientes e resíduos entre a mãe e o feto e pela produção e entrega de fatores de crescimento e hormônios. Manipulações genéticas placentárias em camundongos são críticas para a compreensão do papel específico da placenta no desenvolvimento pré-natal. Camundongos transgênicos que expressam Cre específicos da placenta têm eficácia variável, e outros métodos para manipulação gênica placentária podem ser alternativas úteis. Este artigo descreve uma técnica para alterar diretamente a expressão gênica placentária usando a manipulação do gene CRISPR, que pode ser usada para modificar a expressão de genes-alvo. Usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada, as fêmeas grávidas são submetidas a uma laparotomia no dia embrionário 12.5 (E12.5), e um plasmídeo CRISPR é entregue por uma micropipeta de vidro nas placentas individuais. O plasmídeo é eletroporado imediatamente após cada injeção. Após a recuperação da barragem, as placentas e embriões podem continuar o desenvolvimento até a avaliação em um momento posterior. A avaliação da placenta e da prole após o uso dessa técnica pode determinar o papel da função placentária tempo-específica no desenvolvimento. Esse tipo de manipulação permitirá uma melhor compreensão de como a genética e a função placentárias afetam o crescimento e o desenvolvimento fetal em múltiplos contextos patológicos.

Introdução

A placenta é um órgão essencial envolvido no desenvolvimento do feto. O principal papel da placenta é fornecer fatores essenciais e regular a transferência de nutrientes e resíduos de e para o feto. As placentas de mamíferos são compostas por tecido fetal e materno, que compõem a interface feto-materna e, portanto, a genética da função de impacto materno-fetal¹. Anomalias genéticas ou função prejudicada da placenta podem alterar drasticamente o desenvolvimento fetal. Trabalhos anteriores mostraram que a genética e o desenvolvimento placentário estão associados ao desenvolvimento alterado de sistemas orgânicos específicos no feto. Particularmente, anormalidades na placenta estão ligadas a alterações no cérebro, coração e sistema vascular fetal2,3,4,5.

O transporte de hormônios, fatores de crescimento e outras moléculas da placenta para o feto desempenha um papel importante no desenvolvimento fetal⁶. Tem sido demonstrado que alterar a produção placentária de moléculas específicas pode alterar o neurodesenvolvimento. A inflamação materna pode aumentar a produção de serotonina por alterar a expressão gênica metabólica do triptofano (TRP) na placenta, o que, posteriormente, cria um acúmulo de serotonina no cérebro fetal⁷. Outros estudos encontraram anormalidades placentárias ao lado de defeitos cardíacos. Acredita-se que anormalidades na placenta contribuam para defeitos cardíacos congênitos, o defeito congênito mais comum em humanos⁸. Um estudo recente identificou vários genes que têm vias celulares semelhantes na placenta e no coração. Se rompidas, essas vias podem causar defeitos em ambos os órgãos⁹. Os defeitos na placenta podem exacerbar defeitos cardíacos congênitos. O papel da genética e função placentária no desenvolvimento de sistemas de órgãos fetais específicos é um campo de estudo emergente.

Camundongos possuem placentas hemocoriais e outras características das placentas humanas, o que os torna modelos altamente úteis para o estudo de doenças humanas¹. Apesar da importância da placenta, atualmente há uma falta de manipulações genéticas direcionadas in vivo. Além disso, atualmente há mais opções disponíveis para knockouts ou knockdowns do que manipulações de superexpressão ou ganho de função na placenta¹⁰. Existem várias linhas transgênicas de Cre-expressando para manipulação placentária-específica, cada uma em diferentes linhagens de trofoblastos em diferentes pontos de tempo. Estes incluem Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER, e Gcm1-Cre 11,12,13,14. Embora esses transgenes Cre sejam eficientes, eles podem não ser capazes de manipular alguns genes em pontos de tempo específicos. Outro método comumente utilizado para nocautear ou superexpressar a expressão gênica placentária é a inserção de vetores lentivirais em cultura de blastocisto, o que causa uma manipulação genética trofoblasto-específica^15,16. Esta técnica permite uma mudança robusta na expressão gênica placentária no início do desenvolvimento. O uso de RNA de interferência in vivo tem sido pouco utilizado na placenta. A inserção de plasmídeos de shRNA pode ser realizada de forma semelhante à técnica CRIPSR descrita neste trabalho. Isso foi feito no E13.5 para diminuir com sucesso a expressão de PlGF na placenta, com impactos na vasculatura cerebral da prole¹⁷.

Além das técnicas que são usadas principalmente para knockout ou knockdown, a indução da superexpressão é comumente realizada com adenovírus ou a inserção de uma proteína exógena. As técnicas utilizadas para superexpressão têm taxas variáveis de sucesso e têm sido realizadas, na maioria das vezes, mais tardiamente na gestação. Para investigar o papel do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) na função placentária, uma transferência gênica placentária mediada por adenovírus foi realizada para induzir a superexpressão do gene IGF-1 ^18,19. Isso foi realizado no final da gestação de camundongos com E18.5 por injeção direta na placenta. Para fornecer opções adicionais e contornar possíveis falhas de manipulações genéticas placentárias estabelecidas, como falhas na combinação Cre-Lox, a possível toxicidade de adenovírus e os efeitos fora do alvo do shRNA, a manipulação direta in vivo de CRISPR da placenta pode ser usada^20,21,22. Este modelo foi desenvolvido para resolver a falta de modelos de superexpressão e para criar um modelo com flexibilidade.

Essa técnica é baseada no trabalho de Lecuyer e cols., no qual plasmídeos shRNA e CRISPR foram direcionados diretamente in vivo para placentas de camundongos para alterar a expressão de PlGF ¹⁷. Esta técnica pode ser usada para alterar diretamente a expressão gênica placentária usando a manipulação de CRISPR em vários pontos de tempo; para este trabalho, foi selecionado o E12.5. A placenta já amadureceu a esse ponto e é grande o suficiente para manipular, permitindo a inserção de um plasmídeo CRISPR específico no E12.5, o que pode ter um impacto significativo no desenvolvimento fetal a partir de meados da gestação^23,24. Ao contrário das abordagens transgênicas, mas semelhantes às induções virais ou interferência de RNA, esta técnica permite a superexpressão ou knockout em pontos de tempo específicos usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada, evitando assim possível placentação prejudicada ou letalidade embrionária de alterações anteriores. Como apenas algumas placentas recebem o plasmídeo experimental ou de controle dentro de uma ninhada, a abordagem permite dois tipos de controles internos. Esses controles são aqueles injetados e eletroporados com o plasmídeo de controle apropriado e aqueles que não recebem manipulação direta. Esta técnica foi otimizada para criar uma superexpressão do gene IGF-1 na placenta de camundongos através de um plasmídeo CRISPR mediador de ativação sinérgica (SAM). O gene IGF-1 foi escolhido, pois o IGF-1 é um hormônio de crescimento essencial entregue ao feto que é primariamente produzido na placenta antes do nascimento^25,26. Esta nova técnica CRISPR direcionada à placenta permitirá a manipulação direta para ajudar a definir a conexão entre a função placentária e o desenvolvimento fetal.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as regulamentações federais e a política da Universidade de Iowa e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.

1. Animais e criação

1. Manter os animais em um ciclo diurno de 12 h com ração e água ad libitum.
2. Use camundongos fêmeas CD-1 com idade entre 8-15 semanas. Utilizar a presença de um tampão copulatório para identificar o E0.5.
3. Na E0.5, abrigar isoladamente as represas prenhes.

2. Calibração da micropipeta

NOTA: A calibração da micropipeta deve ser realizada antes da cirurgia, quando possível.

1. Antes de fazer e calibrar a micropipeta, diluir todos os plasmídeos até a concentração recomendada (0,1 μg/μL) em água livre de DNase. Misturar o plasmídeo com o corante Fast Green adequadamente diluído (1 μg/μL em PBS) (concentração final do plasmídeo: 0,06 μg/μL).
2. Puxe as micropipetas usando capilares de vidro de 10 cm com diâmetro externo de 1,5 mm e diâmetro interno de 0,86 mm com um puxador de micropipetas.
3. Quebre cuidadosamente a ponta de uma micropipeta (2-3 mm) com pinças estéreis.
4. Coloque a micropipeta em uma ponta microcapilar conectada a um microinjetor. Verifique se o microinjetor está conectado à máquina de microinjeção e se há níveis suficientes de nitrogênio para calibrar a micropipeta.
5. Uma vez que a micropipeta esteja conectada ao microinjetor, carregue-a com a solução de corante Fast Green para realizar a calibração (1 μg/μL em PBS). Calibrar a micropipeta para injetar um volume de aproximadamente 3,5 μL. Esvaziar ("limpar") a micropipeta em preparação para carregar as soluções de plasmídeo conforme abaixo.
   NOTA: Cada micropipeta será ligeiramente diferente. Para evitar danificar a placenta durante a injeção, o tempo de injeção deve ser definido entre 0,5-1,5 s. A pressão deve ser ajustada entre 1-8,5 psi. Calibrar cada micropipeta separadamente; Se a micropipeta não puder ser calibrada dentro desses parâmetros, ela não deve ser usada.

3. Cirurgia (Figura 1A)

OBS: Para o preparo, limpe as superfícies das áreas de preparo e cirúrgicas com etanol 70%. Coloque uma almofada absorvente na área de preparação. Na área da cirurgia, coloque uma almofada de aquecimento para baixo e, em seguida, coloque uma almofada absorvente em cima desta. Esterilizar todas as ferramentas antes da cirurgia. O tempo que a barragem está sob anestesia deve ser inferior a 1 h.

1. Anesthetization
   1. Administrar 5 mg/kg de AINE (meloxicam) ou outro analgésico aprovado à mãe gestante 30 min a 1 h antes da cirurgia.
   2. Coloque a barragem gestante em uma câmara de indução acoplada a um vaporizador de isoflurano.
   3. Ajuste o vaporizador para isoflurano a 4% e oxigênio a 3,5 L/min.
   4. Uma vez confirmada a anestesia pela falta de resposta a uma pinça do dedo do pé e uma taxa respiratória reduzida, remova a barragem da câmara de indução para a área de preparação.
2. Preparo cirúrgico
   1. Na área de preparação, coloque a barragem em decúbito dorsal com um cone nasal.
   2. Reduzir o vaporizador para 2% de isoflurano e 3,5 L/min de oxigênio enquanto a barragem estiver no cone nasal.
   3. Faça a barba bem no abdômen da barragem e remova o excesso de pelos. Revestimento alternado do abdome raspado com solução de povidona e etanol 70% três vezes com aplicadores estéreis com ponta de algodão. Aplicar camada final de solução de povidona. Para evitar o ressecamento da córnea, colocar gel de lágrima artificial sobre os dois olhos da barragem (Figura 2A, B).
   4. Após o preparo, mova a barragem com o cone nasal para a área de cirurgia designada.
3. Laparotomia uterina
   OBS: Utilizar luvas estéreis durante todo o procedimento cirúrgico. Troque as luvas se alguma superfície não estéril for contatada.
   1. Na área da cirurgia, coloque a barragem em decúbito dorsal e fixe o cone nasal no lugar com fita adesiva. Ajuste a almofada de aquecimento por baixo da almofada absorvente para 45 °C.
   2. Usando pinça e tesoura, faça uma incisão mediana de aproximadamente 2 cm através da pele. Use pinças para atendar a pele e faça uma incisão vertical na pele. Depois disso, faça outra incisão de tamanho semelhante através do peritônio para expor os cornos uterinos. Com pinças, tenda o peritônio enquanto se faz a incisão vertical (Figura 2C, D).
      NOTA: A falha em tenda adequada durante a incisão do peritônio pode levar a uma incisão fatal dos intestinos.
   3. Massageie suavemente os cornos uterinos através da incisão, pressionando os lados do abdômen. Faça isso guiando cuidadosamente o útero sem ferramentas, usando apenas os dedos para evitar lesões acidentais. Coloque o útero exposto em cima de um pano cirúrgico estéril cobrindo o abdome da barragem e mantenha-o úmido durante toda a cirurgia com gotas de soro fisiológico estéril, que pode ser aquecido a 30 °C antes do uso, conforme necessário (Figura 2E, F).
      NOTA: Os cornos uterinos podem ser identificados conforme descrito em Wang et ^al.27.
   4. Uma vez que o útero está exposto, selecione três pares de placentas para manipulação.
      NOTA: As placentas podem ser identificadas conforme descrito por Elmore et ^al.24. Para maximizar a sobrevivência dos embriões, não mais do que 6 placentas devem ser tratadas. Se houver menos de 12 embriões presentes, não mais do que 4 placentas devem ser injetadas. Selecionar duas placentas adjacentes para que uma receba uma injeção controle e a outra receba o plasmídeo experimental. O uso de duas placentas adjacentes permite uma melhor comparação de placentas em localizações semelhantes no útero e também possibilita um aumento da taxa de sobrevida. Os pares placentários selecionados são escolhidos aleatoriamente e espaçados ao longo de ambos os cornos uterinos (Figura 1B).
   5. Registrar a localização das manipulações placentárias e a organização dos embriões dentro dos cornos uterinos para que os embriões e placentas possam ser identificados durante a coleta, pois uma mãe carregará placentas/embriões controlados e tratados experimentalmente.
4. Injeção placentária e eletroporação do plasmídeo controle
   OBS: Para manter uma técnica asséptica, esterilizar as pás de eletroporação e o microinjetor com um esterilizante a frio antes do uso. Troque as luvas se alguma superfície não estéril for contatada.
   1. Usando a micropipeta calibrada, carregar uma quantidade suficiente do plasmídeo de controle apropriado para três injeções. Realizar todas as injeções a uma profundidade de ~0,5 mm lateralmente na placenta entre a decídua (branca) e a zona juncional (vermelho escuro) (Figura 3A-F).
   2. Realizar injeções nas três placentas de controle.
      NOTA: Realizar todas as injeções de plasmídios de controle antes das injeções experimentais para evitar a contaminação cruzada dos plasmídeos com a micropipeta. Isso permitirá que a mesma micropipeta seja usada, pois a troca de micropipetas e o tempo de calibração aumentam drasticamente o tempo de cirurgia e diminuem a sobrevivência da barragem.
   3. Realizar eletroporação das placentas de controle injetadas por plasmídeos dentro de 2 min após a injeção.
   4. Para a eletroporação, use um par de pás de 3 mm acopladas a uma máquina de eletroporação. Para garantir a eficiência da incorporação CRISPR e a viabilidade dos embriões, use as seguintes configurações de eletroporação: 2 pulsos, 30 V, pulso de 30 ms, pulso de 970 ms desligado, unipolar.
   5. Após a injeção, mas imediatamente antes da eletroporação, cubra os locais de contato com soro fisiológico estéril, aplicando o soro fisiológico precisamente nos três locais da parede uterina e nas pás com um conta-gotas ou seringa.
   6. Pressione suavemente as pás de eletroporação nas laterais da placenta. Coloque a pá do ânodo sobre o local de injeção e o cátodo diretamente oposto (Figura 4A-C).
   7. Pressione o pulso na máquina de eletroporação e aguarde a conclusão dos dois pulsos antes de remover as pás de eletroporação.
      NOTA: Uma pequena quantidade de espuma branca é frequentemente vista entre as pás e a placenta durante os pulsos. Se isso não ocorrer, verifique a tensão das pás com um voltímetro antes de usar novamente. Se a leitura no voltímetro não corresponder à configuração de tensão de eletroporação, as pás não funcionarão.
5. Injeção placentária e eletroporação do plasmídeo experimental
   1. Siga as mesmas instruções da etapa 3.4.1. para a etapa 3.4.2. usando o plasmídeo experimental em vez do plasmídeo controle.
   2. Realizar a eletroporação das três placentas experimentais injetadas dentro de 2 min após a injeção. Isso deve ser realizado da mesma maneira que para aqueles injetados com os plasmídeos de controle. Siga o passo 3.4.4. para a etapa 3.4.7.
6. Conclusão da cirurgia
   1. Uma vez concluída a manipulação placentária, massageie suavemente os cornos uterinos de volta para dentro da cavidade abdominal usando apenas os dedos (Figura 5A).
   2. Primeiro, realizar suturas simples com dois nós na camada de peritônio usando suturas solúveis revestidas e trançadas com 45 cm de comprimento e uma liga de agulha 3/8c de 13 mm. Espaçar as suturas a 2-3 mm de distância (Figura 5B).
   3. Após sutura da camada peritoneal, sutura da pele com pontos solúveis. Nó triplo, as suturas únicas com 2-3 mm de distância para garantir que a barragem não possa desfazer a sutura (Figura 5C).
   4. Concluída a sutura, fixa-se o isoflurano a 1% e o oxigênio a 3,5 L/min, aplicando-se adesivo tecidual nas suturas sobre a pele (Figura 5D).
      NOTA: O adesivo tecidual é opcional, mas recomendado para evitar a reabertura da incisão devido à mastigação da barragem.
   5. Quando o adesivo de tecido tiver secado, desligue o vaporizador e remova a barragem da área da cirurgia. Coloque a barragem em uma gaiola de apoio nas costas.

4. Cuidados e acompanhamento pós-cirúrgico

1. Permita que a mãe grávida se recupere em uma gaiola limpa sob supervisão por um mínimo de 30 minutos para garantir que não haja complicações imediatas da cirurgia. Observe até que esteja totalmente deambulado e possa virar para os pés sem assistência. Abriga isoladamente a barragem pós-cirurgia.
2. Acompanhar os cuidados institucionais pós-operatórios e acompanhamento até a coleta do embrião. Registre o peso da barragem e monitore diariamente as suturas e o local da incisão.

5. E14.5 coleção placentária

1. No E14.5, anestesiar profundamente a barragem com um coquetel de ketamina/xilazina (1 mg/mL de quetamina e 0,1 mg/mL de xilazina) e, em seguida, deslocar cervicamente a barragem.
2. Faça uma incisão em forma de V no abdômen da barragem com tesoura e remova o útero. Coloque imediatamente em uma placa de Petri de 5 cm sobre gelo. Usando fórceps, remova cuidadosamente o embrião e a placenta correspondente do útero.
   NOTA: Manter um registro da localização do embrião e placenta correspondente nos cornos uterinos para determinar qual recebeu a manipulação direta durante a cirurgia.
3. Registre os pesos placentários. Usando pinças e lâminas de barbear sem RNAse, corte a placenta ao meio na linha média. Colocar metade em 4% de PFA a 4 °C. Corte a metade restante ao meio novamente e armazene os dois quartos restantes a -80 °C em dois tubos, um com reagente de armazenamento de RNA.
   NOTA: Embriões e outros tecidos maternos podem ser armazenados da coleção a -80 °C para uso futuro.

6. Análise da expressão gênica placentária

1. Use o quarto da placenta armazenado a -80 °C no reagente de armazenamento de RNA.
2. Processar as placentas para qPCR como descrito em Elser e col. usando o método Trizol para isolamento de RNA, um espectrofotômetro para concentração de RNA, um kit de síntese de cDNA e qPCR com SYBR Green Master Mix²⁸. No lugar do kit Turbo DNAfree referenciado em Elser et al., utilizar um kit de limpeza de RNA após o isolamento do RNA Trizol para garantir que as amostras não contenham contaminantes²⁸.
   NOTA: Leia a ficha de dados de segurança do material (FISPQ) para Trizol e use-a em um exaustor de fumaça química.
3. Avaliar a inserção plasmidial do plasmídeo controle com primers de GFP e do plasmídeo experimental com primers BLAST (primers listados na Tabela Suplementar 1). Use o valor de CT para determinar a presença do plasmídeo.
   NOTA: Valores de TC acima de 35 são falsos positivos, e apenas aqueles abaixo de 35 devem ser considerados um indicador positivo de que o plasmídeo foi inserido com sucesso.
4. Avaliar a expressão placentária de IGF-1 normalizada para o gene housekeeping 18s (primers listados na Tabela Suplementar 1). Use o método ddCT para calcular a mudança de dobra e, em seguida, calcular a mudança de dobra normalizada das amostras experimentais para a mudança média de dobra das amostras controle.

7. Análise do nível de proteína placentária

1. Use o quarto da placenta que foi armazenada a -80 °C. Homogeneizar o tecido em uma solução tampão à frente de 11,5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl 2 e 10 mM inibidor de protease em diH₂ O com pH final de 7,4. Use um homogeneizador portátil e pilão para quebrar o tecido.
   NOTA: A amostra não deve exceder 10% do volume do buffer.
2. Diluir as amostras homogeneizadas no tampão a 1:12, de modo a que estejam dentro do intervalo detectável de um kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA). Realizar o ensaio de BCA de acordo com as instruções do fabricante e quantificar a proteína total usando um leitor de placas.
3. Após a realização do ensaio de BCA, normalizar todas as amostras para a mesma concentração de proteína total de 2 mg/mL para o ELISA de IGF-1, como feito em Gumusoglu et ^al.29.
4. Realizar o ELISA de IGF-1 de acordo com as instruções do fabricante e quantificar os níveis de proteína IGF-1 com um leitor de placas usando uma curva de concentração padrão.

8. Verificação espacial do CRIPSR usando marcação fluorescente em hibridização in situ

1. Depois que as metades placentárias tiverem sido adequadamente fixadas em PFA a 4% a 4 °C por 1-3 dias, mova-as para sacarose a 20% a 4 °C antes de congelá-las em composto de temperatura de corte ótima (OCT).
2. Seccione serialmente as metades da placenta emblocadas em OCT em um criostato de -20 °C em seções de 10 μm e coloque-as em lâminas para serem marcadas. Seccione a placenta pela metade, de modo que todas as três sub-regiões sejam visíveis. Conservar as lâminas a -80 °C até à utilização para hibridização in situ .
3. Realizar marcação por hibridação in situ fluorescente (FISH) seguindo os protocolos do fabricante. Hibridizar uma lâmina com uma sonda dCas9-3xNLS-VP64 e uma segunda lâmina "irmã" da mesma placenta com uma sonda Prl8a8.
   NOTA: A sonda dCas9-3xNLS-VP64 detecta a presença do plasmídeo de superexpressão. A sonda Prl8a8 destaca espongiotrofoblastos da zona juncional, o que permite identificar as sub-regiões da placenta. Essas duas sondas são marcadas em lâminas "irmãs" separadas para evitar a interferência da fluorescência multicanal com a autofluorescência verde nas placentas.
4. Rotule ambas as sondas com o corante de detecção (Opal 620). Depois de completar o protocolo do fabricante para FISH, aplique o meio de montagem DAPI e coloque uma tampa na lâmina. Sele a lamínula com esmalte transparente.
5. Obtenha imagens das lâminas em um microscópio de fluorescência composto vertical e processe-as usando um software de processamento de imagem apropriado. Aqui, foi utilizado o software CellSens.

Resultados

Resultados gerais do procedimento (Figura 6)
No estudo, houve três grupos manipulados. Estes incluíram placentas injetadas com um plasmídeo de controle geral CRISPR Cas9 (Cas9 Control), um plasmídeo CRISPR de controle de ativação (Act Control), ou um plasmídeo de ativação de IGF-1 SAM (Igf1-OE). O Cas9 Control é mais adequado para plasmídeos knockout, e o controle de ativação é mais adequado para plasmídeos de superexpressão/ativa...

Discussão

A placenta é um regulador primário do crescimento fetal e, como observado anteriormente, alterações na expressão ou função gênica placentária podem afetar significativamente o desenvolvimento fetal⁶. O protocolo descrito aqui pode ser usado para realizar uma manipulação CRISPR in vivo direcionada da placenta de camundongo usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada. Esta técnica permite um rendimento significativo de embriões viáveis e suas placentas corresponden...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml Tubes	USA Scientific Inc	1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS	Thermo Fisher Scientific	J61899.AP
96 Well plate	Cornings	3598	For BCA kit
Absorbent Underpads	Fisher Scientific	14-206-62
Activation Control Plasmid	Santa Cruz Biotechnology	sc-437275	Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0277L	Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor	Vetamac	VAD-601TT	VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel	Akorn	NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Protein quantification
Biovortexer	Bellco Glass, Inc.	198050000	Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software	Olympus	V4.1.1	Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810	Eppendorf	EP022628168	Plate centrifuge
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	J67241-AP	RNA isolation
Cotton Tipped Applicators	ProAdvantage	77100	Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid	Santa Cruz Biotechnology	sc-418922	Dnase-free water provided for dilution
CryoStat	Leica	CM1950
Dissection Microscope	Leica	M125 C	Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures	Med Vet International	J385H
Distilled Water	Gibco	15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Thermo fisher Scientific	14190144	(-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine)	BTX Harvard Apparatus	45-0662	Generator only
Electric Razor	Wahl	CL9990	Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0487	3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK	Grainger	21RK94	Placenta embedding cassettes
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	268280010
F-Air Canisters	Penn Veterinary Supply Inc	BIC80120	Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF	Sigma	F7252-5G	Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader)	Fisher Scientific	14377576	Can be used for BCA and ELISA
Forceps	VWR	82027-386	Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma Aldrich	HT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette)	Sutter Instrument	B150-86-10	O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x)	Thermo Scientific	1861281	Protein homogenization buffer
Heating Pad	Thermotech	S766D	Digitial Moist Heating Pad
Hemostats	VWR	10806-188	Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath	Fisher Scientific	20253	Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1)	Santa Cruz Biotechnology	sc-421056-ACT	Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber	Vetamac	941443	No specific liter size required
Isoflurane	Piramal Pharma Limited	NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal	Fisher Scientific	A451-4	RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml	Akorn	NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride	Sigma Aldrich	63069-100ML	1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode	Fisher Scientific	4309849	Barcoded plates not required
Microcapillary Tip	Eppendorf	5196082001	Attached to BTX Microinjector
Microinjector	BTX Harvard Apparatus	45-0766	Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine)	BTX Harvard Apparatus	45-0751	MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97	Sutter Instrument	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker)	scilogex	822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit	R & D Systems	MG100
Needles	BD - Becton, Dickson, and Company	305106	30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank	Linde	7727-37-9	Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID)	Norbrook Laboratories Limited	NDC 55529-040-10	Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone	Vetamac	921609	9-14 mm
Opal 620 detection dye	Akoya Biosciences	SKU FP1495001KT	Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound	Sakura	4583
Oxygen Tank	Linde	7782 - 44 - 7	Medical grade oxygen
Pestles	USA Scientific Inc	14155390
Povidone-Iodine Solution, 5%	Avrio Health L.P.	NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4367659	Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers)	New England Biolabs	S1330S	Use for cDNA synthesis
Razor Blade	Grainger	26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator	Zymo Research	R1013
RNALater	Thermo Fisher Scientific	AM7021
RNAscope kit v.2.5	Advanced Cells Diagnostics	323100	Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2	Advanced Cells Diagnostics	528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64	Advanced Cells Diagnostics	527421
Roto-Therm Mini	Benchmark	R2020	Dry oven for in situ hybridization
Scissors	VWR	82027-578	Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline)	Hospra	NDC 0409-4888-03	Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate]	Research Product International	03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical	Fisher Scientific	SS277	Protein homogenization buffer
Steamer	Bella	B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape	Busse	696	Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60	Leica	3800160
Syringes	BD - Becton, Dickson, and Company	309659	BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer	Fisher Scientific	13-400-525	This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive	3M	1469SB	VetBond
Tris HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025	1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018	RNA isolation
TSA Buffer Pack	Advanced Cells Diagnostics	322810	Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit	Vetamac	40200	Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope	Olympus	BX61VS	Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block	Thermo Fisher Scientific	4453536	This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color	Amazon	C450B
Xylazine 20mg/ml	Anased	343730_RX