Maus-In-vivo-Plazenta-gezielte CRISPR-Manipulation

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir eine zeitspezifische Methode, um kritische Entwicklungswege in der Plazenta der Maus in vivo effektiv zu manipulieren. Dies geschieht durch die Injektion und Elektroporation von CRISPR-Plasmiden in die Plazenta trächtiger Muttertiere am Embryonaltag 12.5.

Zusammenfassung

Die Plazenta ist ein essentielles Organ, das die Entwicklung von Säugetieren im Mutterleib reguliert und aufrechterhält. Die Plazenta ist verantwortlich für den Transfer von Nährstoffen und Abfallstoffen zwischen Mutter und Fötus sowie für die Produktion und Abgabe von Wachstumsfaktoren und Hormonen. Plazentare genetische Manipulationen bei Mäusen sind entscheidend für das Verständnis der spezifischen Rolle der Plazenta in der pränatalen Entwicklung. Plazenta-spezifische Cre-exprimierende transgene Mäuse haben eine unterschiedliche Wirksamkeit, und andere Methoden zur Manipulation von Plazenta-Genen können nützliche Alternativen sein. Diese Arbeit beschreibt eine Technik zur direkten Veränderung der plazentaren Genexpression mittels CRISPR-Genmanipulation, mit der die Expression von Zielgenen modifiziert werden kann. Bei einem relativ fortschrittlichen chirurgischen Ansatz werden trächtige Muttertiere am Embryonaltag 12,5 (E12,5) einer Laparotomie unterzogen und ein CRISPR-Plasmid wird durch eine Glasmikropipette in die einzelnen Plazenten eingebracht. Das Plasmid wird sofort nach jeder Injektion elektroporiert. Nach der Wiederherstellung des Muttertiers können sich die Plazenta und die Embryonen bis zur Beurteilung zu einem späteren Zeitpunkt weiterentwickeln. Die Beurteilung der Plazenta und der Nachkommen nach der Anwendung dieser Technik kann die Rolle der zeitspezifischen Plazentafunktion in der Entwicklung bestimmen. Diese Art der Manipulation ermöglicht ein besseres Verständnis dafür, wie sich die Genetik und Funktion der Plazenta auf das Wachstum und die Entwicklung des Fötus in verschiedenen Krankheitskontexten auswirkt.

Einleitung

Die Plazenta ist ein wesentliches Organ, das an der Entwicklung des Fötus beteiligt ist. Die Hauptaufgabe der Plazenta besteht darin, wesentliche Faktoren bereitzustellen und den Transfer von Nährstoffen und Abfallstoffen zum und vom Fötus zu regulieren. Die Plazenta von Säugetieren besteht sowohl aus fötalem als auch aus mütterlichem Gewebe, die die Schnittstelle zwischen Fötus und Mutter bilden, und so wirkt sich die Genetik sowohl der Mutter als auch des Fötus auf die Funktion^{aus 1}. Genetische Anomalien oder eine gestörte Funktion der Plazenta können die Entwicklung des Fötus drastisch verändern. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Genetik und Entwicklung der Plazenta mit der veränderten Entwicklung bestimmter Organsysteme beim Fötus verbunden ist. Insbesondere Anomalien in der Plazenta sind mit Veränderungen des fetalen Gehirns, des Herzens und des Gefäßsystems verbunden 2,3,4,5.

Der Transport von Hormonen, Wachstumsfaktoren und anderen Molekülen von der Plazenta zum Fötus spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Fötus⁶. Es hat sich gezeigt, dass die Veränderung der Plazentaproduktion bestimmter Moleküle die Neuroentwicklung verändern kann. Eine mütterliche Entzündung kann die Produktion von Serotonin erhöhen, indem sie die metabolische Genexpression von Tryptophan (TRP) in der Plazenta verändert, was in der Folge zu einer Anhäufung von Serotonin im fetalen Gehirn führt⁷. Andere Studien haben neben Herzfehlern auch Plazentaanomalien gefunden. Es wird angenommen, dass Anomalien in der Plazenta zu angeborenen Herzfehlern beitragen, dem häufigsten Geburtsfehler beim Menschen⁸. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat mehrere Gene identifiziert, die sowohl in der Plazenta als auch im Herzen ähnliche zelluläre Signalwege aufweisen. Wenn diese Signalwege gestört sind, können sie zu Defekten in beiden Organen führen⁹. Die Defekte in der Plazenta können angeborene Herzfehler verschlimmern. Die Rolle der Plazentagenetik und -funktion bei der Entwicklung spezifischer fetaler Organsysteme ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet.

Mäuse haben hämochoriale Plazenten und andere Merkmale menschlicher Plazenten, was sie zu sehr nützlichen Modellen für die Erforschung menschlicher Krankheiten macht¹. Trotz der Bedeutung der Plazenta fehlt es derzeit an gezielten in vivo Genmanipulationen. Darüber hinaus stehen derzeit mehr Optionen für Knockouts oder Knockdowns zur Verfügung als für Überexpressions- oder Gain-of-Function-Manipulationen in der Plazenta¹⁰. Es gibt mehrere transgene Cre-exprimierende Linien für plazentaspezifische Manipulationen, jede in verschiedenen Trophoblastenlinien zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Dazu gehören Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER und Gcm1-Cre 11,12,13,14. Obwohl diese Cre-Transgene effizient sind, sind sie möglicherweise nicht in der Lage, einige Gene zu bestimmten Zeitpunkten zu manipulieren. Eine weitere häufig verwendete Methode, um die plazentare Genexpression entweder auszuknocken oder zu überexprimieren, ist die Insertion lentiviraler Vektoren in die Blastozystenkultur, was zu einer trophoblastenspezifischen genetischen Manipulation führt^15,16. Diese Technik ermöglicht eine robuste Veränderung der Plazenta-Genexpression in einem frühen Entwicklungsstadium. Die Verwendung von RNA-Interferenz in vivo wurde in der Plazenta nur spärlich genutzt. Die Insertion von shRNA-Plasmiden kann ähnlich wie die in dieser Arbeit beschriebene CRIPSR-Technik durchgeführt werden. Dies wurde bei E13.5 durchgeführt, um die PlGF-Expression in der Plazenta erfolgreich zu verringern, mit Auswirkungen auf das Gehirnsystem der Nachkommen¹⁷.

Zusätzlich zu Techniken, die in erster Linie für Knockout oder Knockdown verwendet werden, wird die Induktion einer Überexpression häufig mit Adenoviren oder der Insertion eines exogenen Proteins durchgeführt. Die Techniken, die für die Überexpression verwendet werden, haben unterschiedliche Erfolgsraten und wurden meist später in der Trächtigkeit durchgeführt. Um die Rolle des insulinähnlichen Wachstumsfaktors 1 (IGF-1) in der Plazentafunktion zu untersuchen, wurde ein adenoviral vermittelter Plazenta-Gentransfer durchgeführt, um die Überexpression des IGF-1-Gens zu induzieren^18,19. Dies wurde spät in der Trächtigkeit der Maus auf E18.5 mittels direkter Plazentainjektion durchgeführt. Um zusätzliche Optionen bereitzustellen und mögliche Misserfolge etablierter plazentagenetischer Manipulationen, wie z. B. Cre-Lox-Kombinationsfehler, die mögliche Toxizität von Adenoviren und die Off-Target-Effekte von shRNA, zu umgehen, kann in vivo die direkte CRISPR-Manipulation der Plazenta verwendet werden^20,21,22. Dieses Modell wurde entwickelt, um das Fehlen von Überexpressionsmodellen zu beheben und ein Modell mit Flexibilität zu erstellen.

Diese Technik basiert auf der Arbeit von Lecuyer et al., in der shRNA- und CRISPR-Plasmide direkt in vivo auf die Plazenta der Maus gerichtet wurden, um die PlGF-Expression ^{zu verändern 17}. Diese Technik kann verwendet werden, um die Plazenta-Genexpression durch CRISPR-Manipulation zu mehreren Zeitpunkten direkt zu verändern. für diese Arbeit wurde E12.5 ausgewählt. Die Plazenta ist zu diesem Zeitpunkt gereift und groß genug, um sie zu manipulieren, was die Insertion eines spezifischen CRISPR-Plasmids auf E12.5 ermöglicht, was einen erheblichen Einfluss auf die fetale Entwicklung von der mittleren bis zur späten Schwangerschaft haben kann^23,24. Im Gegensatz zu transgenen Ansätzen, aber ähnlich wie bei viralen Induktionen oder RNA-Interferenzen, ermöglicht diese Technik eine Überexpression oder einen Knockout zu bestimmten Zeitpunkten mit einem relativ fortschrittlichen chirurgischen Ansatz, wodurch eine mögliche Beeinträchtigung der Plazentation oder embryonale Letalität durch frühere Veränderungen vermieden wird. Da nur wenige Plazenten das Versuchs- oder Kontrollplasmid innerhalb eines Wurfes erhalten, erlaubt der Ansatz zwei Arten von internen Kontrollen. Bei diesen Kontrollen handelt es sich um solche, die mit dem entsprechenden Kontrollplasmid injiziert und elektroporiert werden, und solche, die keine direkte Manipulation erhalten. Diese Technik wurde optimiert, um eine Überexpression des IGF-1-Gens in der Mausplazenta über ein synergistisches Aktivierungsmediator (SAM) CRISPR-Plasmid zu erzeugen. Die Wahl fiel auf das IGF-1-Gen, da es sich bei IGF-1 um ein essentielles Wachstumshormon handelt, das dem Fötus zugeführt wird und vor der Geburt hauptsächlich in der Plazenta produziert wird^25,26. Diese neue, auf die Plazenta ausgerichtete CRISPR-Technik wird eine direkte Manipulation ermöglichen, um den Zusammenhang zwischen Plazentafunktion und fetaler Entwicklung zu definieren.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Bundesvorschriften und den Richtlinien der University of Iowa durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Tiere und Haltung

1. Halten Sie die Tiere in einem 12-stündigen Tageslichtzyklus mit Futter und Wasser ad libitum.
2. Verwenden Sie weibliche CD-1-Mäuse im Alter von 8-15 Wochen. Verwenden Sie das Vorhandensein eines Kopulationspfropfens, um E0.5 zu identifizieren.
3. Auf E0.5 werden die trächtigen Mütter einzeln untergebracht.

2. Kalibrierung der Mikropipette

HINWEIS: Die Kalibrierung der Mikropipette sollte nach Möglichkeit vor der Operation durchgeführt werden.

1. Vor der Herstellung und Kalibrierung der Mikropipette werden alle Plasmide auf die empfohlene Konzentration (0,1 μg/μl) in DNasefreiem Wasser verdünnt. Mischen Sie das Plasmid mit entsprechend verdünntem Fast Green-Farbstoff (1 μg/μl in PBS) (endgültige Plasmidkonzentration: 0,06 μg/μl).
2. Ziehen Sie Mikropipetten mit 10 cm Glaskapillaren mit einem Außendurchmesser von 1,5 mm und einem Innendurchmesser von 0,86 mm mit einem Mikropipettenzieher.
3. Brechen Sie die Spitze einer Mikropipette (2-3 mm) vorsichtig mit einer sterilen Pinzette ab.
4. Füllen Sie die Mikropipette in eine Mikrokapillarspitze, die an einem Mikroinjektor befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass der Mikroinjektor an der Mikroinjektionsmaschine angebracht ist und dass genügend Stickstoff vorhanden ist, um die Mikropipette zu kalibrieren.
5. Sobald die Mikropipette am Mikroinjektor befestigt ist, beladen Sie sie mit der Fast Green-Farbstofflösung, um die Kalibrierung durchzuführen (1 μg/μl in PBS). Kalibrieren Sie die Mikropipette, um ein Volumen von ca. 3,5 μl zu injizieren. Entleeren ("reinigen") Sie die Mikropipette, um die Beladung der Plasmidlösungen wie folgt vorzubereiten.
   Anmerkungen: Jede Mikropipette ist etwas anders. Um eine Schädigung der Plazenta während der Injektion zu vermeiden, sollte die Injektionszeit zwischen 0,5-1,5 s eingestellt werden. Der Druck sollte zwischen 1 und 8,5 psi eingestellt werden. Kalibrieren Sie jede Mikropipette separat. Wenn die Mikropipette nicht innerhalb dieser Parameter kalibriert werden kann, sollte sie nicht verwendet werden.

3. Chirurgie (Abbildung 1A)

Anmerkungen: Reinigen Sie zur Vorbereitung die Oberflächen sowohl des Präparations- als auch des Operationsbereichs mit 70 % Ethanol. Legen Sie eine saugfähige Unterlage in den Vorbereitungsbereich. Legen Sie im Operationsbereich ein Heizkissen ab und legen Sie dann eine saugfähige Unterlage darauf. Sterilisieren Sie alle Werkzeuge vor der Operation. Die Zeit, in der der Damm unter Narkose steht, sollte unter 1 Stunde liegen.

1. Betäubung
   1. Verabreichen Sie dem trächtigen Muttertier 30 Minuten bis 1 Stunde vor der Operation 5 mg/kg NSAR (Meloxicam) oder ein anderes zugelassenes Analgetikum.
   2. Legen Sie die trächtige Mutter in eine Induktionskammer, die an einem Isofluran-Verdampfer befestigt ist.
   3. Stellen Sie den Verdampfer auf 4% Isofluran und 3,5 l/min Sauerstoff ein.
   4. Sobald die Anästhesie durch das Ausbleiben des Ansprechens auf ein Zehenzwicken und eine reduzierte Atemfrequenz bestätigt wurde, entfernen Sie den Damm aus der Induktionskammer in den Präparationsbereich.
2. Vorbereitung auf die Operation
   1. Legen Sie den Damm in Rückenlage mit einem Nasenkegel in den Vorbereitungsbereich.
   2. Reduzieren Sie den Verdampfer auf 2% Isofluran und 3,5 l/min Sauerstoff, während sich der Damm im Nasenkegel befindet.
   3. Rasieren Sie den Bauch des Muttertiers gründlich und entfernen Sie überschüssiges Fell. Beschichten Sie den rasierten Bauch abwechselnd dreimal mit Povidon-Lösung und 70%igem Ethanol mit sterilen Applikatoren mit Wattespitze. Tragen Sie die letzte Schicht Povidon-Lösung auf. Um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern, tragen Sie künstliches Tränengel auf beide Augen des Muttertiers auf (Abbildung 2A, B).
   4. Bewegen Sie nach der Präparation den Damm mit dem Nasenkegel in den dafür vorgesehenen Operationsbereich.
3. Uterus Laparotomie
   Anmerkungen: Verwenden Sie während des gesamten chirurgischen Eingriffs sterile Handschuhe. Wechseln Sie die Handschuhe, wenn eine unsterile Oberfläche berührt wird.
   1. Legen Sie im Operationsbereich den Damm in Rückenlage und befestigen Sie den Nasenkegel mit Klebeband. Stellen Sie das Heizkissen unter dem saugfähigen Pad auf 45 °C ein.
   2. Machen Sie mit einer Pinzette und einer Schere einen ca. 2 cm langen Schnitt in der Mittellinie durch die Haut. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut zu spannen, und machen Sie einen vertikalen Schnitt in die Haut. Machen Sie danach einen weiteren ähnlich großen Schnitt durch das Bauchfell, um die Gebärmutterhörner freizulegen. Zelten Sie das Bauchfell mit einer Pinzette, während Sie den vertikalen Schnitt machen (Abbildung 2C, D).
      HINWEIS: Wenn das Bauchfell nicht richtig eingeschnitten wird, kann dies zu einem tödlichen Einschnitt des Darms führen.
   3. Massieren Sie die Gebärmutterhörner sanft durch den Schnitt, indem Sie auf die Seiten des Bauches drücken. Führen Sie dazu die Gebärmutter vorsichtig und ohne Hilfsmittel und nur mit den Fingern, um versehentliche Verletzungen zu vermeiden. Legen Sie den freiliegenden Uterus auf ein steriles OP-Tuch, das den Bauch des Damms bedeckt, und halten Sie es während der gesamten Operation mit Tropfen steriler Kochsalzlösung feucht, die vor der Anwendung bei Bedarf auf 30 °C erwärmt werden kann (Abbildung 2E, F).
      ANMERKUNG: Die Uterushörner können wie in Wang et ^al.27 beschrieben identifiziert werden.
   4. Sobald die Gebärmutter freigelegt ist, wählen Sie drei Plazentapaare zur Manipulation aus.
      HINWEIS: Die Plazenta können wie von Elmore et ^al.24 beschrieben identifiziert werden. Um das Überleben der Embryonen zu maximieren, sollten nicht mehr als 6 Plazenten behandelt werden. Wenn weniger als 12 Embryonen vorhanden sind, sollten nicht mehr als 4 Plazenten injiziert werden. Wählen Sie zwei benachbarte Plazenten aus, so dass eine eine Kontrollinjektion und die andere das experimentelle Plasmid erhält. Die Verwendung von zwei benachbarten Plazenten ermöglicht einen besseren Vergleich von Plazenten an ähnlichen Stellen in der Gebärmutter und ermöglicht auch eine erhöhte Überlebensrate. Die ausgewählten Plazentapaare werden zufällig ausgewählt und in beiden Uterushörnern verteilt (Abbildung 1B).
   5. Zeichnen Sie die Lage der Plazentamanipulationen und die Organisation der Embryonen in den Uterushörnern auf, damit die Embryonen und Plazenten während der Entnahme identifiziert werden können, da ein Damm sowohl Kontroll- als auch experimentell behandelte Plazenten/Embryonen trägt.
4. Plazentainjektion und Elektroporation des Kontrollplasmids
   Anmerkungen: Um eine aseptische Technik beizubehalten, sterilisieren Sie die Elektroporationspaddel und den Mikroinjektor vor dem Gebrauch mit einem kalten Sterilisationsmittel. Wechseln Sie die Handschuhe, wenn eine unsterile Oberfläche berührt wird.
   1. Laden Sie mit der kalibrierten Mikropipette eine ausreichende Menge des entsprechenden Kontrollplasmids für drei Injektionen. Führen Sie alle Injektionen in einer Tiefe von ~0,5 mm seitlich in die Plazenta zwischen der Dezidua (weiß) und der Verbindungszone (dunkelrot) durch (Abbildung 3A-F).
   2. Führen Sie Injektionen in die drei Kontrollplazenten durch.
      Anmerkungen: Führen Sie alle Kontrollplasmidinjektionen vor den experimentellen Injektionen durch, um eine Kreuzkontamination der Plasmide mit der Mikropipette zu vermeiden. Auf diese Weise kann dieselbe Mikropipette verwendet werden, da der Wechsel der Mikropipetten und der Kalibrierzeit die Operationszeit drastisch verlängert und das Überleben des Muttertiers verringert.
   3. Führen Sie die Elektroporation der mit Kontrollplasmid injizierten Plazenten innerhalb von 2 Minuten nach der Injektion durch.
   4. Verwenden Sie für die Elektroporation ein Paar 3-mm-Paddel, die an einer Elektroporationsmaschine befestigt sind. Um die Effizienz der CRISPR-Inkorporation und die Lebensfähigkeit von Embryonen zu gewährleisten, verwenden Sie die folgenden Elektroporationseinstellungen: 2 Impulse, 30 V, 30 ms Impuls, 970 ms Impuls aus, unipolar.
   5. Nach der Injektion, aber unmittelbar vor der Elektroporation, beschichten Sie die Kontaktstellen mit steriler Kochsalzlösung und tragen Sie die Kochsalzlösung mit einer Pipette oder Spritze genau auf die drei Stellen der Gebärmutterwand und der Paddel auf.
   6. Drücken Sie die Elektroporationspaddel vorsichtig auf die seitlichen Seiten der Plazenta. Platzieren Sie das Anodenpaddel über der Injektionsstelle und der Kathode direkt gegenüber (Abbildung 4A-C).
   7. Drücken Sie den Impuls an der Elektroporationsmaschine und warten Sie, bis die beiden Impulse abgeschlossen sind, bevor Sie die Elektroporationspaddel entfernen.
      Anmerkungen: Während des Pulses ist oft eine kleine Menge weißer Schaum zwischen den Paddeln und der Plazenta zu sehen. Wenn dies nicht der Fall ist, überprüfen Sie vor dem weiteren Gebrauch die Spannung der Paddel mit einem Voltmeter. Wenn der Messwert auf dem Voltmeter nicht mit der eingestellten Elektroporationsspannung übereinstimmt, sind die Paddel nicht funktionsfähig.
5. Plazentainjektion und Elektroporation des experimentellen Plasmids
   1. Befolgen Sie die gleichen Anweisungen wie in Schritt 3.4.1. zu Schritt 3.4.2. Verwendung des experimentellen Plasmids anstelle des Kontrollplasmids.
   2. Führen Sie die Elektroporation aller drei experimentell injizierten Plazenten innerhalb von 2 Minuten nach der Injektion durch. Dies sollte auf die gleiche Weise durchgeführt werden wie bei denen, die mit den Kontrollplasmiden injiziert werden. Befolgen Sie Schritt 3.4.4. zu Schritt 3.4.7.
6. Abschluss der Operation
   1. Sobald die Plazentamanipulation abgeschlossen ist, massieren Sie die Gebärmutterhörner sanft nur mit den Fingern zurück in die Bauchhöhle (Abbildung 5A).
   2. Führen Sie zunächst doppelt geknotete Einzelnähte auf der Peritoneumschicht mit beschichteten und geflochtenen auflösbaren Nähten von 45 cm Länge mit einer 13 mm 3/8c-Nadellegierung durch. Abstand zwischen den Nähten 2-3 mm (Abbildung 5B).
   3. Nachdem Sie die Bauchfellschicht vernäht haben, vernähen Sie die Haut mit auflösbaren Nähten. Verknoten Sie die einzelnen Nähte im Abstand von 2-3 mm dreifach, um sicherzustellen, dass der Damm die Naht nicht lösen kann (Abbildung 5C).
   4. Sobald die Naht abgeschlossen ist, stellen Sie das Isofluran auf 1 % und den Sauerstoffgehalt auf 3,5 l/min ein und tragen Sie Gewebekleber auf die Nähte auf der Haut auf (Abbildung 5D).
      Anmerkungen: Gewebekleber ist optional, wird aber empfohlen, um ein erneutes Öffnen des Einschnitts durch Kauen des Damms zu verhindern.
   5. Wenn der Gewebekleber getrocknet ist, schalten Sie den Verdampfer aus und entfernen Sie den Damm aus dem Operationsbereich. Legen Sie den Damm in einen stützenden Käfig auf den Rücken.

4. Nachsorge und Überwachung

1. Lassen Sie die trächtige Mutter mindestens 30 Minuten lang in einem sauberen Käfig unter Aufsicht genesen, um sicherzustellen, dass keine unmittelbaren Komplikationen der Operation auftreten. Beobachten Sie, bis es vollständig gehfähig ist und ohne Hilfe auf die Füße springen kann. Einzelne Unterbringung des Damms nach der Operation.
2. Verfolgen Sie die institutionelle postoperative Betreuung und Überwachung bis zur Embryonenentnahme. Notieren Sie das Gewicht des Damms und überwachen Sie täglich die Nähte und die Inzisionsstelle.

5. E14.5 Plazentaentnahme

1. Bei E14.5 wird der Damm mit einem Ketamin/Xylazin-Cocktail (1 mg/ml Ketamin und 0,1 mg/ml Xylazin) tief betäubt und anschließend zervikal disloziert.
2. Machen Sie mit einer Schere einen V-förmigen Schnitt in den Bauch des Damms und entfernen Sie die Gebärmutter. Sofort auf eine 5 cm Petrischale auf Eis stellen. Mit einer Pinzette wird der Embryo und die dazugehörige Plazenta vorsichtig aus der Gebärmutter entfernt.
   HINWEIS: Zeichnen Sie die Position des Embryos und die entsprechende Plazenta in den Gebärmutterhörnern auf, um festzustellen, welcher Embryo während der Operation direkt manipuliert wurde.
3. Notieren Sie die Plazentagewichte. Schneiden Sie die Plazenta mit einer RNAse-freien Pinzette und einem Rasierer entlang der Mittellinie in zwei Hälften. Eine Hälfte in 4%iges PFA bei 4 °C geben. Schneiden Sie die restliche Hälfte wieder in zwei Hälften und lagern Sie die restlichen zwei Viertel bei −80 °C in zwei Röhrchen, eines davon mit RNA-Speicherreagenz.
   HINWEIS: Embryonen und anderes mütterliches Gewebe können aus der Sammlung bei −80 °C für die zukünftige Verwendung gelagert werden.

6. Analyse der Genexpression der Plazenta

1. Verwenden Sie das Viertel der Plazenta, das bei −80 °C in einem RNA-Speicherreagenz gelagert wird.
2. Verarbeiten Sie die Plazenten für die qPCR, wie in Elser et al. beschrieben, unter Verwendung der Trizol-Methode zur RNA-Isolierung, eines Spektralphotometers für die RNA-Konzentration, eines cDNA-Synthesekits und der qPCR mit SYBR Green Master Mix²⁸. Verwenden Sie anstelle der Turbo-DNAfree-Kit-DNAse, auf die in Elser et al. verwiesen wird, nach der Trizol-RNA-Isolierung ein RNAcleanup-Kit, um sicherzustellen, dass die Proben keine Verunreinigungen^{enthalten 28}.
   HINWEIS: Lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt (MSDS) für Trizol und verwenden Sie es in einem chemischen Abzug.
3. Beurteilen Sie die Plasmidinsertion des Kontrollplasmids mit GFP-Primern und des experimentellen Plasmids mit BLAST-Primern (Primer in Ergänzungstabelle 1). Verwenden Sie den CT-Wert, um das Vorhandensein des Plasmids zu bestimmen.
   HINWEIS: CT-Werte über 35 sind falsch positive Ergebnisse, und nur solche unter 35 sollten als positiver Indikator dafür angesehen werden, dass das Plasmid erfolgreich eingesetzt wurde.
4. Die IGF-1-Plazentaexpression, die auf das Housekeeping-Gen 18s normalisiert ist, wird beurteilt (Primer sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt). Verwenden Sie die ddCT-Methode, um die Faltungsänderung zu berechnen, und berechnen Sie dann die normalisierte Faltungsänderung der experimentellen Stichproben auf die mittlere Faltungsänderung der Kontrollstichproben.

7. Analyse des Plazentaproteinspiegels

1. Verwenden Sie das Viertel der Plazenta, das bei −80 °C gelagert wurde. Das Gewebe wird in einer Pufferlösung aus 11,5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl2 und 10 mM Proteaseinhibitor in_diH2O mit einem End-pH-Wert von7,4 homogenisiert. Verwenden Sie einen Handhomogenisator und einen Stößel, um das Gewebe aufzubrechen.
   Anmerkungen: Die Probe sollte 10 % des Volumens des Puffers nicht überschreiten.
2. Verdünnen Sie die homogenisierten Proben im Puffer im Verhältnis 1:12, so dass sie sich im nachweisbaren Bereich eines Bicinchoninsäure-Assay-Kits (BCA) befinden. Führen Sie den BCA-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und quantifizieren Sie das Gesamtprotein mit einem Plattenlesegerät.
3. Nach der Durchführung des BCA-Assays werden alle Proben für den IGF-1-ELISA auf die gleiche Gesamtproteinkonzentration von 2 mg/ml normalisiert, wie dies in Gumusoglu et ^al.29 der Fall war.
4. Führen Sie den IGF-1-ELISA gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und quantifizieren Sie die IGF-1-Proteinspiegel mit einem Plattenlesegerät unter Verwendung einer Standardkonzentrationskurve.

8. Räumliche CRIPSR-Verifikation mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmarkierung

1. Nachdem die Plazentahälften 1-3 Tage lang in 4%igem PFA bei 4 °C fixiert wurden, werden sie in 20%ige Saccharose bei 4 °C eingeschoben, bevor sie in optimaler Schnitttemperatur (OCT) eingefroren werden.
2. Die in OCT eingebetteten Plazentahälften werden in einem −20 °C-Kryostaten seriell in 10-μm-Schnitte geschnitten und auf Objektträger gelegt, um sie zu beschriften. Schneiden Sie die Plazentahälften so, dass alle drei Teilregionen sichtbar sind. Lagern Sie die Objektträger bei −80 °C, bis sie für die In-situ-Hybridisierung verwendet werden.
3. Führen Sie eine Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmarkierung (FISH) gemäß den Protokollen des Herstellers durch. Hybridisieren Sie einen Objektträger mit einer dCas9-3xNLS-VP64-Sonde und einen zweiten "Schwester"-Objektträger der gleichen Plazenta mit einer Prl8a8-Sonde.
   HINWEIS: Die Sonde dCas9-3xNLS-VP64 detektiert das Vorhandensein des Überexpressionsplasmids. Die Prl8a8-Sonde hebt Spongiotrophoblasten der Junktionszone hervor, wodurch die Subregionen der Plazenta identifiziert werden können. Diese beiden Sonden sind auf separaten "Schwester"-Objektträgern beschriftet, um eine Interferenz der Mehrkanalfluoreszenz mit der grünen Autofluoreszenz in der Plazenta zu vermeiden.
4. Beschriften Sie beide Sonden mit dem Detektionsfarbstoff (Opal 620). Nachdem Sie das Protokoll des Herstellers für FISH ausgefüllt haben, tragen Sie DAPI-Eindeckmedium auf und legen Sie ein Deckglas auf den Objektträger. Versiegeln Sie das Deckglas mit klarem Nagellack.
5. Stellen Sie die Objektträger auf einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop dar und verarbeiten Sie sie mit einer geeigneten Bildverarbeitungssoftware. Hier kam die Software CellSens zum Einsatz.

Ergebnisse

Allgemeine Behandlungsergebnisse (Abbildung 6)
In der Studie gab es drei manipulierte Gruppen. Dazu gehörten Plazenten, die mit einem allgemeinen CRISPR-Cas9-Kontrollplasmid (Cas9-Kontrolle), einem CRISPR-Plasmid zur Aktivierungskontrolle (Act Control) oder einem IGF-1-SAM-Aktivierungsplasmid (Igf1-OE) injiziert wurden. Die Cas9-Kontrolle ist besser für Knockout-Plasmide geeignet, und die Aktivierungskontrolle ist besser für Überexpressions-/...

Diskussion

Die Plazenta ist ein primärer Regulator des fetalen Wachstums, und wie bereits erwähnt, können Veränderungen in der Genexpression oder -funktion der Plazenta die Entwicklung des Fötus erheblich beeinflussen⁶. Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um eine gezielte in vivo CRISPR-Manipulation der Mausplazenta mit einem relativ fortschrittlichen chirurgischen Ansatz durchzuführen. Diese Technik ermöglicht eine signifikante Ausbeute an lebensfähigen Embryonen und den ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml Tubes	USA Scientific Inc	1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS	Thermo Fisher Scientific	J61899.AP
96 Well plate	Cornings	3598	For BCA kit
Absorbent Underpads	Fisher Scientific	14-206-62
Activation Control Plasmid	Santa Cruz Biotechnology	sc-437275	Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0277L	Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor	Vetamac	VAD-601TT	VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel	Akorn	NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Protein quantification
Biovortexer	Bellco Glass, Inc.	198050000	Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software	Olympus	V4.1.1	Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810	Eppendorf	EP022628168	Plate centrifuge
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	J67241-AP	RNA isolation
Cotton Tipped Applicators	ProAdvantage	77100	Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid	Santa Cruz Biotechnology	sc-418922	Dnase-free water provided for dilution
CryoStat	Leica	CM1950
Dissection Microscope	Leica	M125 C	Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures	Med Vet International	J385H
Distilled Water	Gibco	15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Thermo fisher Scientific	14190144	(-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine)	BTX Harvard Apparatus	45-0662	Generator only
Electric Razor	Wahl	CL9990	Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0487	3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK	Grainger	21RK94	Placenta embedding cassettes
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	268280010
F-Air Canisters	Penn Veterinary Supply Inc	BIC80120	Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF	Sigma	F7252-5G	Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader)	Fisher Scientific	14377576	Can be used for BCA and ELISA
Forceps	VWR	82027-386	Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma Aldrich	HT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette)	Sutter Instrument	B150-86-10	O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x)	Thermo Scientific	1861281	Protein homogenization buffer
Heating Pad	Thermotech	S766D	Digitial Moist Heating Pad
Hemostats	VWR	10806-188	Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath	Fisher Scientific	20253	Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1)	Santa Cruz Biotechnology	sc-421056-ACT	Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber	Vetamac	941443	No specific liter size required
Isoflurane	Piramal Pharma Limited	NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal	Fisher Scientific	A451-4	RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml	Akorn	NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride	Sigma Aldrich	63069-100ML	1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode	Fisher Scientific	4309849	Barcoded plates not required
Microcapillary Tip	Eppendorf	5196082001	Attached to BTX Microinjector
Microinjector	BTX Harvard Apparatus	45-0766	Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine)	BTX Harvard Apparatus	45-0751	MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97	Sutter Instrument	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker)	scilogex	822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit	R & D Systems	MG100
Needles	BD - Becton, Dickson, and Company	305106	30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank	Linde	7727-37-9	Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID)	Norbrook Laboratories Limited	NDC 55529-040-10	Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone	Vetamac	921609	9-14 mm
Opal 620 detection dye	Akoya Biosciences	SKU FP1495001KT	Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound	Sakura	4583
Oxygen Tank	Linde	7782 - 44 - 7	Medical grade oxygen
Pestles	USA Scientific Inc	14155390
Povidone-Iodine Solution, 5%	Avrio Health L.P.	NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4367659	Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers)	New England Biolabs	S1330S	Use for cDNA synthesis
Razor Blade	Grainger	26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator	Zymo Research	R1013
RNALater	Thermo Fisher Scientific	AM7021
RNAscope kit v.2.5	Advanced Cells Diagnostics	323100	Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2	Advanced Cells Diagnostics	528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64	Advanced Cells Diagnostics	527421
Roto-Therm Mini	Benchmark	R2020	Dry oven for in situ hybridization
Scissors	VWR	82027-578	Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline)	Hospra	NDC 0409-4888-03	Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate]	Research Product International	03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical	Fisher Scientific	SS277	Protein homogenization buffer
Steamer	Bella	B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape	Busse	696	Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60	Leica	3800160
Syringes	BD - Becton, Dickson, and Company	309659	BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer	Fisher Scientific	13-400-525	This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive	3M	1469SB	VetBond
Tris HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025	1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018	RNA isolation
TSA Buffer Pack	Advanced Cells Diagnostics	322810	Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit	Vetamac	40200	Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope	Olympus	BX61VS	Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block	Thermo Fisher Scientific	4453536	This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color	Amazon	C450B
Xylazine 20mg/ml	Anased	343730_RX