Fare In Vivo Plasental Hedefli CRISPR Manipülasyonu

Özet

Burada, fare plasentasındaki kritik gelişim yollarını in vivo olarak etkili bir şekilde manipüle etmek için zamana özgü bir yöntem açıklıyoruz. Bu, embriyonik gün 12.5'te CRISPR plazmidlerinin hamile barajların plasentalarına enjeksiyonu ve elektroporasyonu yoluyla gerçekleştirilir.

Özet

Plasenta, uterodaki memeli gelişimini düzenleyen ve sürdüren önemli bir organdır. Plasenta, anne ve fetüs arasındaki besin maddelerinin ve atıkların transferinden ve büyüme faktörlerinin ve hormonların üretiminden ve verilmesinden sorumludur. Farelerde plasental genetik manipülasyonlar, plasentanın doğum öncesi gelişimdeki spesifik rolünü anlamak için kritik öneme sahiptir. Plasental spesifik Cre eksprese eden transgenik fareler farklı etkinliklere sahiptir ve plasental gen manipülasyonu için diğer yöntemler yararlı alternatifler olabilir. Bu makalede, hedeflenen genlerin ekspresyonunu değiştirmek için kullanılabilecek CRISPR gen manipülasyonunu kullanarak plasental gen ekspresyonunu doğrudan değiştirmek için bir teknik açıklanmaktadır. Nispeten gelişmiş bir cerrahi yaklaşım kullanarak, hamile barajlar embriyonik gün 12.5'te (E12.5) bir laparotomiye tabi tutulur ve bir CRISPR plazmidi bir cam mikropipet tarafından bireysel plasentalara verilir. Plazmid her enjeksiyondan sonra hemen elektropone edilir. Baraj iyileşmesinden sonra, plasentalar ve embriyolar daha sonraki bir zaman noktasında değerlendirilene kadar gelişime devam edebilir. Bu tekniğin kullanımından sonra plasenta ve yavruların değerlendirilmesi, zamana özgü plasenta fonksiyonunun gelişimdeki rolünü belirleyebilir. Bu tür bir manipülasyon, plasenta genetiğinin ve fonksiyonunun çoklu hastalık bağlamlarında fetal büyüme ve gelişimi nasıl etkilediğinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

Giriş

Plasenta, fetüsün gelişiminde rol oynayan önemli bir organdır. Plasentanın ana rolü, temel faktörleri sağlamak ve besinlerin ve atıkların fetüse ve fetüsten transferini düzenlemektir. Memeli plasentaları, fetal-maternal arayüzü oluşturan hem fetal hem de maternal dokudan oluşur ve bu nedenle hem anne hem de fetüsün genetiği fonksiyon^1'i etkiler. Plasentanın genetik anomalileri veya bozulmuş fonksiyonu fetal gelişimi büyük ölçüde değiştirebilir. Önceki çalışmalar, plasenta genetiği ve gelişiminin fetüste spesifik organ sistemlerinin değişmiş gelişimi ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Özellikle, plasentadaki anormallikler fetal beyin, kalp ve vasküler sistemdeki değişikliklerle bağlantılıdır 2,3,4,5.

Hormonların, büyüme faktörlerinin ve diğer moleküllerin plasentadan fetüse taşınması fetal gelişimde önemli bir rol oynar⁶. Spesifik moleküllerin plasenta üretimini değiştirmenin nörogelişimi değiştirebileceği gösterilmiştir. Maternal inflamasyon, plasentadaki triptofan (TRP) metabolik gen ekspresyonunu değiştirerek serotonin üretimini artırabilir, bu da daha sonra fetal beyinde serotonin birikimi yaratır⁷. Diğer çalışmalar, kalp kusurlarının yanı sıra plasenta anormallikleri de bulmuştur. Plasentada anormalliklerin, insanlarda en sık görülen doğum kusuru olan konjenital kalp kusurlarına katkıda bulunduğu düşünülmektedir⁸. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, hem plasentada hem de kalpte benzer hücresel yollara sahip birkaç gen tanımlamıştır. Bozulursa, bu yollar her iki organda da kusurlara neden olabilir⁹. Plasentadaki kusurlar konjenital kalp kusurlarını şiddetlendirebilir. Plasenta genetiğinin ve fonksiyonunun spesifik fetal organ sistemi gelişimi üzerindeki rolü yeni ortaya çıkan bir çalışma alanıdır.

Fareler hemokoryal plasentalara ve insan plasentalarının diğer özelliklerine sahiptir, bu da onları insan hastalıklarını incelemek için oldukça yararlı modeller haline getirir¹. Plasentanın önemine rağmen, şu anda hedefli in vivo genetik manipülasyonların eksikliği vardır. Ayrıca, şu anda nakavtlar veya nakavtlar için plasenta^10'daki aşırı ekspresyon veya fonksiyon kazancı manipülasyonlarından daha fazla seçenek bulunmaktadır. Plasentaya özgü manipülasyon için, her biri farklı zaman noktalarında farklı trofoblast soylarında bulunan birkaç transgenik Cre eksprese eden çizgi vardır. Bunlar arasında Cyp19-Cre, Ada / Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER ve Gcm1-Cre^11,12,13,14 bulunur. Bu Cre transgenleri verimli olsa da, belirli zaman noktalarında bazı genleri manipüle edemeyebilirler. Plasental gen ekspresyonunu nakavt etmek veya aşırı eksprese etmek için yaygın olarak kullanılan bir diğer yöntem, lentiviral vektörlerin blastosist kültürüne yerleştirilmesidir ve bu da trofoblasta özgü bir genetik manipülasyona neden olur^15,16. Bu teknik, gelişimin erken dönemlerinde plasental gen ekspresyonunda sağlam bir değişiklik sağlar. RNA girişiminin in vivo kullanımı plasentada seyrek olarak kullanılmıştır. ShRNA plazmidlerinin yerleştirilmesi, bu makalede açıklanan CRIPSR tekniğine benzer şekilde gerçekleştirilebilir. Bu, plasentadaki PlGF ekspresyonunu başarılı bir şekilde azaltmak için E13.5'te yapılmıştır ve yavru beyin vaskülatürü¹⁷ üzerindeki etkileri vardır.

Öncelikle nakavt veya nakavt için kullanılan tekniklere ek olarak, aşırı ekspresyonu indüklemek yaygın olarak adenovirüslerle veya eksojen bir proteinin yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Aşırı ekspresyon için kullanılan teknikler değişen başarı oranlarına sahiptir ve çoğunlukla gebeliğin ilerleyen dönemlerinde uygulanmıştır. İnsülin benzeri büyüme faktörü 1'in (IGF-1) plasenta fonksiyonundaki rolünü araştırmak için, IGF-1 geninin aşırı ekspresyonunu indüklemek için adenoviral aracılı plasental gen transferi yapıldı^18,19. Bu, E18.5'te fare gebeliğinin geç dönemlerinde direkt plasenta enjeksiyonu ile gerçekleştirildi. Ek seçenekler sağlamak ve Cre-Lox kombinasyon başarısızlıkları, adenovirüslerin olası toksisitesi ve shRNA'nın hedef dışı etkileri gibi yerleşik plasental genetik manipülasyonların olası başarısızlıklarını atlatmak için, plasentanın in vivo doğrudan CRISPR manipülasyonu kullanılabilir^20,21,22. Bu model, aşırı ifade modellerinin eksikliğini gidermek ve esnekliğe sahip bir model oluşturmak için geliştirilmiştir.

Bu teknik, shRNA ve CRISPR plazmidlerinin PlGF ekspresyonunu değiştirmek için doğrudan in vivo fare plasentalarına hedeflendiği Lecuyer ve ark.'nın çalışmalarına dayanmaktadır¹⁷. Bu teknik, birden fazla zaman noktasında CRISPR manipülasyonu kullanarak plasenta gen ekspresyonunu doğrudan değiştirmek için kullanılabilir; Bu çalışma için E12.5 seçildi. Plasenta bu noktaya kadar olgunlaşmıştır ve manipüle edilebilecek kadar büyüktür, bu da E12.5 üzerine spesifik bir CRISPR plazmidinin yerleştirilmesine izin verir, bu da gebeliğin ortasından sonuna kadar fetal gelişim üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir^23,24. Transgenik yaklaşımlardan farklı olarak, ancak viral indüksiyonlara veya RNA girişimine benzer şekilde, bu teknik, nispeten gelişmiş bir cerrahi yaklaşım kullanarak belirli zaman noktalarında aşırı ekspresyon veya nakavta izin verir, böylece daha önceki değişikliklerden kaynaklanan olası bozulmuş plasentasyon veya embriyonik ölümcüllükten kaçınır. Sadece birkaç plasenta bir çöp içindeki deneysel veya kontrol plazmidini aldığından, yaklaşım iki tür iç kontrole izin verir. Bu kontroller, uygun kontrol plazmidi ile enjekte edilen ve elektropoize edilen ve doğrudan manipülasyon almayan kontrollerdir. Bu teknik, sinerjik aktivasyon aracısı (SAM) CRISPR plazmidi aracılığıyla fare plasentasındaki IGF-1 geninin aşırı ekspresyonunu oluşturmak için optimize edilmiştir. IGF-1 geni seçildi, çünkü IGF-1, doğumdan önce plasentada öncelikle üretilen fetüse verilen önemli bir büyüme hormonudur^25,26. Bu yeni plasenta hedefli CRISPR tekniği, plasenta fonksiyonu ile fetal gelişim arasındaki bağlantıyı tanımlamaya yardımcı olmak için doğrudan manipülasyona izin verecektir.

Protokol

Tüm prosedürler federal düzenlemelere ve Iowa Üniversitesi politikasına uygun ve uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvanlar ve hayvancılık

1. Hayvanları yiyecek ve su ad libitum ile 12 saatlik bir gün ışığı döngüsünde tutun.
2. 8-15 haftalık CD-1 dişi fareleri kullanın. E0.5'i tanımlamak için bir çiftleşme fişinin varlığını kullanın.
3. E0.5'te, hamile barajları tek başına barındırın.

2. Mikropipetin kalibrasyonu

NOT: Mikropipetin kalibrasyonu mümkünse ameliyattan önce yapılmalıdır.

1. Mikropipeti yapmadan ve kalibre etmeden önce, tüm plazmidleri DNaz içermeyen suda önerilen konsantrasyona (0,1 μg/μL) kadar seyreltin. Plazmidi uygun şekilde seyreltilmiş Hızlı Yeşil boya (PBS'de 1 μg / μL) ile karıştırın (nihai plazmid konsantrasyonu: 0.06 μg / μL).
2. Dış çapı 1,5 mm ve iç çapı 0,86 mm olan 10 cm'lik cam kılcal damarları kullanarak mikropipetleri mikropipet çektirme makinesi ile çekin.
3. Bir mikropipetin ucunu (2-3 mm) steril forseps ile dikkatlice kırın.
4. Mikropipeti bir mikroenjektöre bağlı bir mikro kılcal uca yükleyin. Mikroenjektörün mikroenjeksiyon makinesine takılı olduğundan ve mikropipeti kalibre etmek için yeterli azot seviyeleri olduğundan emin olun.
5. Mikropipet mikro enjektöre bağlandıktan sonra, kalibrasyonu gerçekleştirmek için Hızlı Yeşil boya çözeltisi ile yükleyin (PBS'de 1 μg / μL). Mikropipeti, yaklaşık 3,5 μL'lik bir hacim enjekte edecek şekilde kalibre edin.
   NOT: Her mikropipet biraz farklı olacaktır. Enjeksiyon sırasında plasentaya zarar vermemek için, enjeksiyon süresi 0.5-1.5 s arasında ayarlanmalıdır. Basınç 1-8.5 psi arasında ayarlanmalıdır. Her mikropipeti ayrı ayrı kalibre edin; Mikropipet bu parametreler dahilinde kalibre edilemiyorsa, kullanılmamalıdır.

3. Cerrahi (Şekil 1A)

NOT: Hazırlamak için, hem preparat hem de cerrahi alanların yüzeylerini% 70 etanol ile temizleyin. Hazırlık alanına emici bir alt ped yerleştirin. Ameliyat alanında, bir ısıtma yastığı yerleştirin ve ardından bunun üzerine emici bir alt ped yerleştirin. Ameliyattan önce tüm aletleri sterilize edin. Barajın anestezi altında kaldığı süre 1 saatin altında olmalıdır.

1. Anestezi
   1. Ameliyattan 30 dakika ila 1 saat önce gebe barajına 5 mg / kg NSAID (meloksikam) veya başka bir onaylanmış analjezik uygulayın.
   2. Hamile barajı bir izofluran buharlaştırıcısına bağlı bir indüksiyon odasına yerleştirin.
   3. Buharlaştırıcıyı %4 izofluran ve 3,5 L/dak oksijene ayarlayın.
   4. Anestezi, bir ayak parmağı sıkışmasına yanıt verilmemesi ve solunum hızının azalması ile doğrulandıktan sonra, barajı indüksiyon odasından hazırlık alanına çıkarın.
2. Ameliyat hazırlığı
   1. Hazırlık alanında, barajı sırtüstü bir burun konisi ile yerleştirin.
   2. Baraj burun konisindeyken buharlaştırıcıyı %2 izofluran ve 3,5 L/dak oksijene düşürün.
   3. Barajın karnını iyice tıraş edin ve fazla kürkü çıkarın. Tıraş edilmiş karın bölgesini povidon çözeltisi ve% 70 etanol ile steril pamuk uçlu aplikatörler kullanarak üç kez alternatif olarak kaplayın. Povidon çözeltisinin son katını uygulayın. Kornea kurumasını önlemek için, barajın her iki gözünün üzerine yapay gözyaşı jeli yerleştirin (Şekil 2A, B).
   4. Hazırlık yaptıktan sonra, burun konisi ile barajı belirlenen ameliyat alanına taşıyın.
3. Uterin laparotomi
   NOT: Cerrahi işlem boyunca steril eldiven kullanın. Steril olmayan herhangi bir yüzeye temas ederse eldivenleri değiştirin.
   1. Ameliyat alanında, baraj sırtını yerleştirin ve burun konisini bantla yerine sabitleyin. Emici pedin altındaki ısıtma yastığını 45 °C'ye ayarlayın.
   2. Forseps ve makas kullanarak, cilt boyunca yaklaşık 2 cm'lik bir orta hat kesisi yapın. Cildi çadırlamak için forseps kullanın ve cilde dikey bir kesi yapın. Bundan sonra, uterus boynuzlarını ortaya çıkarmak için peritondan benzer büyüklükte bir kesi daha yapın. Forseps kullanarak, dikey insizyonu yaparken peritona çadır uygulayın (Şekil 2C, D).
      NOT: Peritonun kesilmesi sırasında düzgün bir şekilde çadır kurulmaması, bağırsakların ölümcül bir insizyonuna yol açabilir.
   3. Karın yanlarına bastırarak uterus boynuzlarına kesiden hafifçe masaj yapın. Bunu, uterusu alet kullanmadan dikkatlice yönlendirerek, kazara yaralanmayı önlemek için sadece parmaklarınızı kullanarak yapın. Açıkta kalan uterusu, barajın karnını kaplayan steril bir cerrahi örtünün üzerine yerleştirin ve gerektiğinde kullanımdan önce 30 ° C'ye ısıtılabilen steril salin damlaları ile ameliyat boyunca nemli tutun (Şekil 2E, F).
      NOT: Rahim boynuzları Wang ve ^ark.27'de tarif edildiği gibi tanımlanabilir.
   4. Rahim açığa çıktıktan sonra, manipülasyon için üç çift plasenta seçin.
      NOT: Plasentalar Elmore ve ^ark.24 tarafından tanımlandığı gibi tanımlanabilir. Embriyoların hayatta kalmasını en üst düzeye çıkarmak için, 6'dan fazla plasenta tedavi edilmemelidir. 12'den az embriyo varsa, 4'ten fazla plasenta enjekte edilmemelidir. İki bitişik plasenta seçin, böylece biri bir kontrol enjeksiyonu ve diğeri deneysel plazmid alır. İki bitişik plasentanın kullanılması, uterustaki benzer yerlerdeki plasentaların daha iyi karşılaştırılmasını sağlar ve ayrıca hayatta kalma oranının artmasını sağlar. Seçilen plasental çiftler rastgele seçilir ve her iki uterus boynuzu boyunca aralıklı olarak yerleştirilir (Şekil 1B).
   5. Plasenta manipülasyonlarının yerini ve embriyoların uterus boynuzları içindeki organizasyonunu kaydedin, böylece embriyolar ve plasentalar toplama sırasında tanımlanabilir, çünkü bir baraj hem kontrol hem de deneysel olarak tedavi edilen plasenta / embriyoları taşıyacaktır.
4. Plasental enjeksiyon ve kontrol plazmidinin elektroporasyonu
   NOT: Aseptik bir tekniği sürdürmek için, kullanmadan önce elektroporasyon küreklerini ve mikro enjektörünü soğuk bir sterilant ile sterilize edin. Steril olmayan herhangi bir yüzeye temas ederse eldivenleri değiştirin.
   1. Kalibre edilmiş mikropipeti kullanarak, üç enjeksiyon için yeterli miktarda uygun kontrol plazmidini yükleyin. Tüm enjeksiyonları, desidua (beyaz) ve kavşak bölgesi (koyu kırmızı) arasındaki plasentaya lateral olarak ~ 0.5 mm derinlikte gerçekleştirin (Şekil 3A-F).
   2. Üç kontrol plasentanına enjeksiyon yapın.
      NOT: Plazmidlerin mikropipet ile çapraz kontaminasyonunu önlemek için deneysel enjeksiyonlardan önce tüm kontrol plazmid enjeksiyonlarını gerçekleştirin. Bu, aynı mikropipetin kullanılmasına izin verecektir, çünkü mikropipetlerin ve kalibrasyon süresinin değiştirilmesi ameliyat süresini önemli ölçüde artırır ve barajın sağkalımını azaltır.
   3. Kontrol plazmid enjekte edilen plasentaların elektroporasyonunu enjeksiyondan sonraki 2 dakika içinde gerçekleştirin.
   4. Elektroporasyon için, bir elektroporasyon makinesine bağlı bir çift 3 mm'lik kürek kullanın. CRISPR birleştirme verimliliğini ve embriyoların yaşayabilirliğini sağlamak için aşağıdaki elektroporasyon ayarlarını kullanın: 2 darbe, 30 V, 30 ms darbe, 970 ms darbe kapalı, tek kutuplu.
   5. Enjeksiyondan sonra, ancak elektroporasyondan hemen önce, salini uterus duvarındaki üç bölgeye ve küreklere bir damlalık veya şırınga ile tam olarak uygulayarak, steril salin ile temas yerlerini kaplayın.
   6. Plasentanın lateral taraflarındaki elektroporasyon küreklerini yavaşça bastırın. Anot küreğini enjeksiyon bölgesine ve katotu tam karşısına yerleştirin (Şekil 4A-C).
   7. Elektroporasyon makinesindeki darbeye basın ve elektroporasyon küreklerini çıkarmadan önce iki darbenin tamamlanmasını bekleyin.
      NOT: Nabızlar sırasında kürekler ve plasenta arasında genellikle az miktarda beyaz köpük görülür. Bu gerçekleşmezse, daha fazla kullanmadan önce pedallardan gelen voltajı bir voltmetre ile kontrol edin. Voltmetre üzerindeki okuma elektroporasyon voltajı ayarına uymuyorsa, kürekler işlevsizdir.
5. Plasental enjeksiyon ve deneysel plazmidin elektroporasyonu
   1. Adım 3.4.1'deki aynı talimatları izleyin. Adım 3.4.2'ye gidin. Kontrol plazmidi yerine deneysel plazmid kullanımı.
   2. Enjeksiyondan sonraki 2 dakika içinde üç deneysel enjekte plasentanın hepsinin elektroporasyonunu gerçekleştirin. Bu, kontrol plazmidleri ile enjekte edilenlerle aynı şekilde yapılmalıdır. 3.4.4 adımını izleyin. adım 3.4.7'ye gidin.
6. Ameliyatın tamamlanması
   1. Plasental manipülasyon tamamlandıktan sonra, uterus boynuzlarına sadece parmaklarınızı kullanarak karın boşluğunun içine nazikçe masaj yapın (Şekil 5A).
   2. İlk olarak, 13 mm 3/8c iğne alaşımı ile 45 cm uzunluğunda kaplamalı ve örgülü çözünebilir dikişler kullanarak periton tabakası üzerinde çift düğümlü tek dikişler uygulayın. Dikişleri birbirinden 2-3 mm aralıklarla yerleştirin (Şekil 5B).
   3. Periton tabakasını diktikten sonra, cildi çözülebilir dikişlerle dikin. Barajın dikişi geri alamamasını sağlamak için tek dikişleri 2-3 mm arayla üçlü düğümleyin (Şekil 5C).
   4. Dikiş tamamlandıktan sonra, izofluran'ı% 1'e ve oksijeni 3.5 L / dak'ya ayarlayın ve ciltteki dikişlere doku yapıştırıcısı uygulayın (Şekil 5D).
      NOT: Doku yapıştırıcısı isteğe bağlıdır, ancak baraj çiğneme nedeniyle insizyonun tekrar açılmasını önlemek için önerilir.
   5. Doku yapıştırıcısı kuruduğunda, buharlaştırıcıyı kapatın ve barajı ameliyat alanından çıkarın. Barajı sırtındaki destekleyici bir kafese yerleştirin.

4. Ameliyat sonrası bakım ve izleme

1. Ameliyatın acil komplikasyonlarını önlemek için hamile barajının gözetim altında temiz bir kafeste en az 30 dakika iyileşmesine izin verin. Tamamen ambulatuvar olana ve yardım almadan ayaklarının üzerine dönene kadar gözlemleyin. Ameliyat sonrası barajı tek başına barındırın.
2. Embriyo toplanmasına kadar kurumsal postoperatif bakım ve takibi takip edin. Baraj ağırlığını kaydedin ve dikişleri ve kesi yerini günlük olarak izleyin.

5. E14.5 plasenta toplanması

1. E14.5'te, barajı bir ketamin / ksilazin kokteyli (1 mg / mL ketamin ve 0.1 mg / mL ksilazin) ile derinlemesine uyuşturun ve ardından barajı servikal olarak yerinden çıkarın.
2. Barajın karnına makasla V şeklinde bir kesi yapın ve uterusu çıkarın. Hemen buz üzerinde 5 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Forseps kullanarak, embriyoyu ve ilgili plasentayı uterustan dikkatlice çıkarın.
   NOT: Ameliyat sırasında hangisinin doğrudan manipülasyon aldığını belirlemek için embriyonun yerinin ve uterus boynuzlarındaki ilgili plasentanın kaydını tutun.
3. Plasenta ağırlıklarını kaydedin. RNAse içermeyen forseps ve tıraş bıçağı kullanarak, plasentayı orta çizginin yarısına kadar kesin. Bir yarısını 4 ° C'de% 4 PFA'ya koyun. Kalan yarısını tekrar ikiye bölün ve kalan iki çeyreği -80 ° C'de, biri RNA depolama reaktifi olan iki tüpte saklayın.
   NOT: Embriyolar ve diğer maternal dokular, gelecekte kullanılmak üzere koleksiyondan -80 ° C'de saklanabilir.

6. Plasental gen ekspresyon analizi

1. RNA depolama reaktifinde -80 ° C'de depolanan plasentanın çeyreğini kullanın.
2. RNA izolasyonu için Trizol yöntemini, RNA konsantrasyonu için bir spektrofotometreyi, bir cDNA sentez kitini ve SYBR Green Master Mix²⁸ ile qPCR'yi kullanarak Elser ve ark.'da açıklandığı gibi qPCR için plasentaları işleyin. Elser ve ark.'da atıfta bulunulan Turbo DNAfree kiti DNAse yerine, numunelerin kirletici madde içermediğinden emin olmak için Trizol RNA izolasyonundan sonra bir RNAcleanup kiti kullanın²⁸.
   NOT: Trizol için malzeme güvenlik bilgi formunu (MSDS) okuyun ve kimyasal bir duman davlumbazında kullanın.
3. Kontrol plazmidinin GFP primerleri ile ve deneysel plazmidin BLAST primerleri ile plazmid yerleştirilmesini değerlendirin ( Ek Tablo 1'de listelenen primerler). Plazmidin varlığını belirlemek için BT değerini kullanın.
   NOT: 35'in üzerindeki BT değerleri yanlış pozitiftir ve sadece 35'in altındakiler plazmidin başarıyla yerleştirildiğinin pozitif bir göstergesi olarak düşünülmelidir.
4. Temizlik geni 18'lere normalleştirilmiş IGF-1 plasental ekspresyonunu değerlendirin (Ek Tablo 1'de listelenen primerler). Katlama değişimini hesaplamak için ddCT yöntemini kullanın ve ardından deneysel numunelerin normalleştirilmiş kıvrım değişimini kontrol numunelerinin ortalama kıvrım değişimine hesaplayın.

7. Plasental protein seviyesi analizi

1. Plasentanın -80 ° C'de depolanan çeyreğini kullanın. Dokuyu, son pH'ı 7.4 olan diH 2 O'da 11.5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl₂ ve 10 mM proteaz inhibitöründen yapılmış bir tampon çözeltisinde homojenizeedin. Dokuyu parçalamak için elde taşınan bir homojenizatör ve havane kullanın.
   NOT: Numune, tampon hacminin %10'unu geçmemelidir.
2. Homojenize numuneleri tamponda 1:12'de seyreltin, böylece bir bisinkoninik asit testi (BCA) kitinin tespit edilebilir aralığında olurlar. BCA testini üreticinin talimatlarına göre yapın ve bir plaka okuyucu kullanarak toplam proteini ölçün.
3. BCA testini yaptıktan sonra, tüm numuneleri, Gümüşoğlu ve ^ark.29'da yapıldığı gibi, IGF-1 ELISA için aynı toplam protein konsantrasyonu olan 2 mg / mL'ye normalleştirin.
4. IGF-1 ELISA'yı üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin ve standart bir konsantrasyon eğrisi kullanarak IGF-1 protein seviyelerini bir plaka okuyucu ile ölçün.

8. Floresan in situ hibridizasyon etiketlemesi kullanarak mekansal CRIPSR doğrulaması

1. Plasenta yarımları 1-3 gün boyunca 4 ° C'de% 4 PFA'da uygun şekilde sabitlendikten sonra, optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğinde dondurmadan önce 4 ° C'de% 20 sakaroza taşıyın.
2. OCT'ye gömülü plasenta yarımlarını -20 ° C'lik bir kriyostatta seri olarak 10 μm bölümlere ayırın ve etiketlenecek slaytlara yerleştirin. Plasenta yarımlarını, üç alt bölgenin tümü görünecek şekilde bölümlere ayırın. Slaytları yerinde hibridizasyon için kullanılana kadar -80 ° C'de saklayın.
3. Üreticinin protokollerini izleyerek floresan in situ hibridizasyon (FISH) etiketlemesi gerçekleştirin. Bir slaydı bir dCas9-3xNLS-VP64 probu ve aynı plasentanın ikinci bir "kardeş" slaydını bir Prl8a8 probu ile melezleştirin.
   NOT: dCas9-3xNLS-VP64 probu, aşırı ekspresyon plazmidinin varlığını algılar. Prl8a8 probu, plasentanın alt bölgelerinin tanımlanabilir olmasını sağlayan kavşak bölgesinin spongiotrofoblastlarını vurgular. Bu iki prob, çok kanallı floresanın plasentalardaki yeşil otofloresan ile karışmasını önlemek için ayrı "kardeş" slaytlarda etiketlenmiştir.
4. Her iki probu da algılama boyası (Opal 620) ile etiketleyin. Üreticinin FISH protokolünü tamamladıktan sonra, DAPI montaj ortamını uygulayın ve slayta bir kapak fişi yerleştirin. Kapak kapağını şeffaf oje ile kapatın.
5. Slaytları dik bileşik floresan mikroskobunda görüntüleyin ve uygun bir görüntü işleme yazılımı kullanarak işleyin. Burada CellSens yazılımı kullanıldı.

Sonuçlar

Genel prosedür sonuçları (Şekil 6)
Çalışmada, manipüle edilmiş üç grup vardı. Bunlar arasında genel bir CRISPR Cas9 kontrol plazmidi (Cas9 Kontrolü), bir aktivasyon kontrolü CRISPR plazmidi (Act Control) veya bir IGF-1 SAM aktivasyon plazmidi (Igf1-OE) ile enjekte edilen plasentalar vardı. Cas9 Kontrolü nakavt plazmidler için daha uygundur ve aktivasyon kontrolü aşırı ekspresyon/aktivasyon plazmidleri için daha uygundur. Pl...

Tartışmalar

Plasenta fetal büyümenin birincil düzenleyicisidir ve daha önce de belirtildiği gibi, plasental gen ekspresyonundaki veya fonksiyonundaki değişiklikler fetal gelişimi önemli ölçüde etkileyebilir⁶. Burada özetlenen protokol, nispeten gelişmiş bir cerrahi yaklaşım kullanarak fare plasentasının hedefli bir in vivo CRISPR manipülasyonunu gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu teknik, daha ileri çalışmalar için kullanılabilecek canlı embriyoların ve bunlara kar?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml Tubes	USA Scientific Inc	1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS	Thermo Fisher Scientific	J61899.AP
96 Well plate	Cornings	3598	For BCA kit
Absorbent Underpads	Fisher Scientific	14-206-62
Activation Control Plasmid	Santa Cruz Biotechnology	sc-437275	Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0277L	Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor	Vetamac	VAD-601TT	VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel	Akorn	NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Protein quantification
Biovortexer	Bellco Glass, Inc.	198050000	Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software	Olympus	V4.1.1	Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810	Eppendorf	EP022628168	Plate centrifuge
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	J67241-AP	RNA isolation
Cotton Tipped Applicators	ProAdvantage	77100	Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid	Santa Cruz Biotechnology	sc-418922	Dnase-free water provided for dilution
CryoStat	Leica	CM1950
Dissection Microscope	Leica	M125 C	Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures	Med Vet International	J385H
Distilled Water	Gibco	15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Thermo fisher Scientific	14190144	(-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine)	BTX Harvard Apparatus	45-0662	Generator only
Electric Razor	Wahl	CL9990	Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0487	3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK	Grainger	21RK94	Placenta embedding cassettes
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	268280010
F-Air Canisters	Penn Veterinary Supply Inc	BIC80120	Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF	Sigma	F7252-5G	Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader)	Fisher Scientific	14377576	Can be used for BCA and ELISA
Forceps	VWR	82027-386	Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma Aldrich	HT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette)	Sutter Instrument	B150-86-10	O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x)	Thermo Scientific	1861281	Protein homogenization buffer
Heating Pad	Thermotech	S766D	Digitial Moist Heating Pad
Hemostats	VWR	10806-188	Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath	Fisher Scientific	20253	Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1)	Santa Cruz Biotechnology	sc-421056-ACT	Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber	Vetamac	941443	No specific liter size required
Isoflurane	Piramal Pharma Limited	NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal	Fisher Scientific	A451-4	RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml	Akorn	NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride	Sigma Aldrich	63069-100ML	1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode	Fisher Scientific	4309849	Barcoded plates not required
Microcapillary Tip	Eppendorf	5196082001	Attached to BTX Microinjector
Microinjector	BTX Harvard Apparatus	45-0766	Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine)	BTX Harvard Apparatus	45-0751	MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97	Sutter Instrument	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker)	scilogex	822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit	R & D Systems	MG100
Needles	BD - Becton, Dickson, and Company	305106	30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank	Linde	7727-37-9	Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID)	Norbrook Laboratories Limited	NDC 55529-040-10	Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone	Vetamac	921609	9-14 mm
Opal 620 detection dye	Akoya Biosciences	SKU FP1495001KT	Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound	Sakura	4583
Oxygen Tank	Linde	7782 - 44 - 7	Medical grade oxygen
Pestles	USA Scientific Inc	14155390
Povidone-Iodine Solution, 5%	Avrio Health L.P.	NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4367659	Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers)	New England Biolabs	S1330S	Use for cDNA synthesis
Razor Blade	Grainger	26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator	Zymo Research	R1013
RNALater	Thermo Fisher Scientific	AM7021
RNAscope kit v.2.5	Advanced Cells Diagnostics	323100	Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2	Advanced Cells Diagnostics	528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64	Advanced Cells Diagnostics	527421
Roto-Therm Mini	Benchmark	R2020	Dry oven for in situ hybridization
Scissors	VWR	82027-578	Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline)	Hospra	NDC 0409-4888-03	Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate]	Research Product International	03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical	Fisher Scientific	SS277	Protein homogenization buffer
Steamer	Bella	B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape	Busse	696	Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60	Leica	3800160
Syringes	BD - Becton, Dickson, and Company	309659	BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer	Fisher Scientific	13-400-525	This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive	3M	1469SB	VetBond
Tris HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025	1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018	RNA isolation
TSA Buffer Pack	Advanced Cells Diagnostics	322810	Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit	Vetamac	40200	Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope	Olympus	BX61VS	Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block	Thermo Fisher Scientific	4453536	This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color	Amazon	C450B
Xylazine 20mg/ml	Anased	343730_RX