Manipulation CRISPR ciblée placentaire in vivo chez la souris

Résumé

Nous décrivons ici une méthode spécifique au temps pour manipuler efficacement les voies de développement critiques dans le placenta de la souris in vivo. Ceci est réalisé par injection et électroporation de plasmides CRISPR dans les placentas des mères gravides au jour embryonnaire 12.5.

Résumé

Le placenta est un organe essentiel qui régule et maintient le développement des mammifères in utero. Le placenta est responsable du transfert des nutriments et des déchets entre la mère et le fœtus et de la production et de l’administration des facteurs de croissance et des hormones. Les manipulations génétiques placentaires chez la souris sont essentielles pour comprendre le rôle spécifique du placenta dans le développement prénatal. Les souris transgéniques exprimant Cre spécifiques au placental ont une efficacité variable, et d’autres méthodes de manipulation du gène placentaire peuvent être des alternatives utiles. Cet article décrit une technique pour modifier directement l’expression des gènes placentaires en utilisant la manipulation du gène CRISPR, qui peut être utilisée pour modifier l’expression des gènes ciblés. En utilisant une approche chirurgicale relativement avancée, les mères enceintes subissent une laparotomie au jour embryonnaire 12.5 (E12.5), et un plasmide CRISPR est délivré par une micropipette en verre dans les placentas individuels. Le plasmide est immédiatement électroporé après chaque injection. Après la récupération de la mère, les placentas et les embryons peuvent continuer à se développer jusqu’à une évaluation ultérieure. L’évaluation du placenta et de la progéniture après l’utilisation de cette technique peut déterminer le rôle de la fonction placentaire spécifique au temps dans le développement. Ce type de manipulation permettra de mieux comprendre l’impact de la génétique et de la fonction placentaires sur la croissance et le développement du fœtus dans de multiples contextes de maladies.

Introduction

Le placenta est un organe essentiel impliqué dans le développement du fœtus. Le rôle principal du placenta est de fournir des facteurs essentiels et de réguler le transfert des nutriments et des déchets vers et depuis le fœtus. Les placentas des mammifères sont composés à la fois de tissus fœtaux et maternels, qui constituent l’interface fœtale-maternelle et, par conséquent, la génétique de la mère et du fœtus a un impact sur la fonction¹. Des anomalies génétiques ou une altération de la fonction du placenta peuvent modifier considérablement le développement du fœtus. Des travaux antérieurs ont montré que la génétique placentaire et le développement sont associés au développement altéré de systèmes d’organes spécifiques chez le fœtus. En particulier, les anomalies du placenta sont liées à des changements dans le cerveau, le cœur et le système vasculaire^du fœtus 2,3,4,5.

Le transport des hormones, des facteurs de croissance et d’autres molécules du placenta au fœtus joue un rôle majeur dans le développement du fœtus⁶. Il a été démontré que la modification de la production placentaire de molécules spécifiques peut altérer le développement neurologique. L’inflammation maternelle peut augmenter la production de sérotonine en modifiant l’expression métabolique du gène du tryptophane (TRP) dans le placenta, ce qui crée par la suite une accumulation de sérotonine dans le cerveau du fœtus⁷. D’autres études ont trouvé des anomalies placentaires ainsi que des malformations cardiaques. On pense que les anomalies du placenta contribuent aux malformations cardiaques congénitales, l’anomalie congénitale la plus fréquente chez l’homme⁸. Une étude récente a identifié plusieurs gènes qui ont des voies cellulaires similaires dans le placenta et le cœur. Si elles sont perturbées, ces voies pourraient causer des défauts dans les deux organes⁹. Les défauts du placenta peuvent exacerber les malformations cardiaques congénitales. Le rôle de la génétique placentaire et de sa fonction sur le développement d’organes fœtaux spécifiques est un domaine d’étude émergent.

Les souris ont des placentas hémochoraux et d’autres caractéristiques des placentas humains, ce qui en fait des modèles très utiles pour étudier les maladies humaines¹. Malgré l’importance du placenta, il y a actuellement un manque de manipulations génétiques in vivo ciblées. En outre, il existe actuellement plus d’options disponibles pour les knockouts ou knockdowns que les manipulations de surexpression ou de gain de fonction dans le placenta¹⁰. Il existe plusieurs lignées transgéniques exprimant Cre pour la manipulation spécifique du placentaire, chacune dans différentes lignées trophoblastiques à différents moments de temps. Il s’agit notamment du Cyp19-Cre, de l’Ada/Tpbpa-Cre, du PDGFRα-Creer et du Gcm1-Cre^11,12,13,14. Bien que ces transgènes Cre soient efficaces, ils peuvent ne pas être capables de manipuler certains gènes à des moments spécifiques. Une autre méthode couramment utilisée pour éliminer ou surexprimer l’expression des gènes placentaires est l’insertion de vecteurs lentiviraux dans la culture de blastocystes, ce qui provoque une manipulation génétique spécifique au trophoblaste^15,16. Cette technique permet un changement robuste dans l’expression du gène placentaire au début du développement. L’utilisation de l’interférence ARN in vivo a été peu utilisée dans le placenta. L’insertion de plasmides shRNA peut être réalisée de manière similaire à la technique CRIPSR décrite dans cet article. Cela a été fait à E13.5 pour diminuer avec succès l’expression de PlGF dans le placenta, avec des impacts sur le système vasculaire cérébral de la progéniture¹⁷.

En plus des techniques qui sont principalement utilisées pour knockout ou knockdown, induire une surexpression est couramment réalisée avec des adénovirus ou l’insertion d’une protéine exogène. Les techniques utilisées pour la surexpression ont des taux de réussite variables et ont pour la plupart été effectuées plus tard dans la gestation. Pour étudier le rôle du facteur de croissance analogue à l’insuline 1 (IGF-1) dans la fonction placentaire, un transfert de gène placentaire médié par l’adénovira a été effectué pour induire la surexpression du gène IGF-1 ^18,19. Cela a été réalisé tard dans la gestation de la souris sur E18.5 par injection placentaire directe. Pour fournir des options supplémentaires et contourner les échecs possibles des manipulations génétiques placentaires établies, telles que les échecs de la combinaison Cre-Lox, la toxicité possible des adénovirus et les effets hors cible de shRNA, la manipulation directe CRISPR in vivo du placenta peut être utilisée^20,21,22. Ce modèle a été développé pour remédier au manque de modèles de surexpression et pour créer un modèle flexible.

Cette technique est basée sur les travaux de Lecuyer et al., dans lesquels les plasmides shRNA et CRISPR ont été ciblés directement in vivo sur les placentas de souris pour modifier l’expression de PlGF ¹⁷. Cette technique peut être utilisée pour modifier directement l’expression des gènes placentaires en utilisant la manipulation CRISPR à plusieurs points temporels; pour ce travail, E12.5 a été sélectionné. Le placenta a mûri à ce stade et est assez grand pour être manipulé, ce qui permet l’insertion d’un plasmide CRISPR spécifique sur E12.5, ce qui peut avoir un impact significatif sur le développement du fœtus du milieu à la fin de la grossesse^23,24. Contrairement aux approches transgéniques, mais similaires aux inductions virales ou aux interférences ARN, cette technique permet une surexpression ou un knockout à des moments particuliers en utilisant une approche chirurgicale relativement avancée, évitant ainsi une éventuelle altération de la placentation ou de la létalité embryonnaire due à des changements antérieurs. Comme seuls quelques placentas reçoivent le plasmide expérimental ou témoin dans une portée, l’approche permet deux types de contrôles internes. Ces témoins sont ceux qui sont injectés et électroporés avec le plasmide de contrôle approprié et ceux qui ne reçoivent aucune manipulation directe. Cette technique a été optimisée pour créer une surexpression du gène IGF-1 dans le placenta de souris via un plasmide CRISPR médiateur d’activation synergique (SAM). Le gène IGF-1 a été choisi, car l’IGF-1 est une hormone de croissance essentielle délivrée au fœtus qui est principalement produite dans le placenta avant la naissance^25,26. Cette nouvelle technique CRISPR ciblant le placental permettra une manipulation directe pour aider à définir le lien entre la fonction placentaire et le développement fœtal.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux règlements fédéraux et à la politique de l’Université de l’Iowa et ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux.

1. Animaux et élevage

1. Gardez les animaux dans un cycle de lumière du jour de 12 h avec de la nourriture et de l’eau ad libitum.
2. Utilisez des souris femelles CD-1 âgées de 8 à 15 semaines. Utilisez la présence d’un bouchon copulatoire pour identifier E0.5.
3. Sur E0.5, logez seules les mères enceintes.

2. Étalonnage de la micropipette

REMARQUE: L’étalonnage de la micropipette doit être effectué avant la chirurgie lorsque cela est possible.

1. Avant de fabriquer et d’étalonner la micropipette, diluer tous les plasmides à la concentration recommandée (0,1 μg/μL) dans de l’eau sans DNase. Mélanger le plasmide avec un colorant vert rapide dilué de manière appropriée (1 μg/μL dans du PBS) (concentration plasmidique finale : 0,06 μg/μL).
2. Tirer des micropipettes à l’aide de capillaires en verre de 10 cm d’un diamètre extérieur de 1,5 mm et d’un diamètre intérieur de 0,86 mm avec un extracteur de micropipettes.
3. Casser délicatement l’extrémité d’une micropipette (2-3 mm) avec une pince stérile.
4. Chargez la micropipette dans une pointe microcapillaire fixée à un microinjecteur. Assurez-vous que le micro-injecteur est fixé à la machine de micro-injection et qu’il y a suffisamment d’azote pour étalonner la micropipette.
5. Une fois la micropipette fixée au micro-injecteur, chargez-la avec la solution de colorant Fast Green pour effectuer l’étalonnage (1 μg/μL dans PBS). Calibrer la micropipette pour injecter un volume d’environ 3,5 μL. Vider (« nettoyer ») la micropipette en vue du chargement des solutions plasmidiques comme ci-dessous.
   REMARQUE: Chaque micropipette sera légèrement différente. Pour éviter d’endommager le placenta pendant l’injection, le temps d’injection doit être réglé entre 0,5 et 1,5 s. La pression doit être réglée entre 1-8,5 psi. Calibrer chaque micropipette séparément; Si la micropipette ne peut pas être étalonnée dans ces paramètres, elle ne doit pas être utilisée.

3. Chirurgie (figure 1A)

REMARQUE: Pour préparer, nettoyez les surfaces de la préparation et des zones chirurgicales avec de l’éthanol à 70%. Placez un sous-tampon absorbant dans la zone de préparation. Dans la zone de chirurgie, placez un coussin chauffant, puis placez un sous-coussin absorbant par-dessus. Stérilisez tous les outils avant la chirurgie. Le temps que la mère est sous anesthésie devrait être inférieure à 1 h.

1. Anesthésiation
   1. Administrer 5 mg/kg d’AINS (méloxicam) ou un autre analgésique approuvé à la mère enceinte 30 min à 1 h avant la chirurgie.
   2. Placez la mère enceinte dans une chambre à induction fixée à un vaporisateur d’isoflurane.
   3. Réglez le vaporisateur à 4% d’isoflurane et 3,5 L/min d’oxygène.
   4. Une fois que l’anesthésie a été confirmée par l’absence de réponse à un pincement de l’orteil et une réduction du rythme respiratoire, retirez la digue de la chambre d’induction à la zone de préparation.
2. Préparation à la chirurgie
   1. Dans la zone de préparation, placez la mère en décubitus dorsal avec un cône nasal.
   2. Réduire le vaporisateur à 2 % d’isoflurane et 3,5 L/min d’oxygène pendant que le barrage est dans le cône de nez.
   3. Rasez soigneusement l’abdomen de la digue et enlevez l’excès de fourrure. Alterner l’abdomen rasé avec une solution de povidone et de l’éthanol à 70% trois fois à l’aide d’applicateurs stériles à embout de coton. Appliquer la couche finale de la solution de povidone. Pour éviter le dessèchement de la cornée, placez du gel lacrymal artificiel sur les deux yeux de la digue (Figure 2A, B).
   4. Après la préparation, déplacez la digue avec le cône nasal vers la zone de chirurgie désignée.
3. Laparotomie utérine
   REMARQUE: Utilisez des gants stériles tout au long de l’intervention chirurgicale. Changez les gants si une surface non stérile est en contact.
   1. Dans la zone de chirurgie, placez le barrage en décubitus dorsal et fixez le cône nasal en place avec du ruban adhésif. Placez le coussin chauffant sous le tampon absorbant à 45 °C.
   2. À l’aide d’une pince et de ciseaux, faites une incision médiane d’environ 2 cm à travers la peau. Utilisez des pinces pour tenter la peau et faites une incision verticale dans la peau. Après cela, faites une autre incision de taille similaire à travers le péritoine pour exposer les cornes utérines. À l’aide d’une pince, tentez le péritoine tout en faisant l’incision verticale (Figure 2C, D).
      REMARQUE: Ne pas se préparer correctement lors de l’incision du péritoine peut entraîner une incision mortelle des intestins.
   3. Massez doucement les cornes utérines à travers l’incision en appuyant sur les côtés de l’abdomen. Pour ce faire, guidez soigneusement l’utérus sans outils, en utilisant uniquement les doigts pour éviter les blessures accidentelles. Placez l’utérus exposé sur un champ chirurgical stérile recouvrant l’abdomen de la digue et maintenez-le humide tout au long de la chirurgie avec des gouttes de solution saline stérile, qui peut être chauffée à 30 °C avant d’être utilisée au besoin (Figure 2E, F).
      REMARQUE : Les cornes utérines peuvent être identifiées comme décrit dans Wang et ^al.27.
   4. Une fois l’utérus exposé, sélectionnez trois paires de placentas pour la manipulation.
      REMARQUE : Les placentas peuvent être identifiés comme décrit par Elmore et ^coll.24. Pour maximiser la survie des embryons, pas plus de 6 placentas doivent être traités. S’il y a moins de 12 embryons présents, pas plus de 4 placentas doivent être injectés. Sélectionnez deux placentas adjacents de sorte que l’un reçoive une injection de contrôle et l’autre le plasmide expérimental. L’utilisation de deux placentas adjacents permet une meilleure comparaison des placentas à des endroits similaires dans l’utérus et permet également une augmentation du taux de survie. Les paires placentaires sélectionnées sont choisies au hasard et espacées dans les deux cornes utérines (Figure 1B).
   5. Enregistrer l’emplacement des manipulations placentaires et l’organisation des embryons dans les cornes utérines afin que les embryons et les placentas puissent être identifiés pendant la collecte, car une mère transportera à la fois des placentas / embryons contrôlés et traités expérimentalement.
4. Injection placentaire et électroporation du plasmide témoin
   NOTE: Pour maintenir une technique aseptique, stériliser les palettes d’électroporation et le micro-injecteur avec un stérilisant froid avant utilisation. Changez de gants si une surface non stérile est en contact.
   1. À l’aide de la micropipette étalonnée, charger une quantité suffisante du plasmide témoin approprié pour trois injections. Effectuer toutes les injections à une profondeur de ~0,5 mm latéralement dans le placenta entre la décidua (blanc) et la zone jonctionnelle (rouge foncé) (Figure 3A-F).
   2. Effectuer des injections dans les trois placentas témoins.
      NOTE: Effectuer toutes les injections de plasmides de contrôle avant les injections expérimentales pour éviter la contamination croisée des plasmides avec la micropipette. Cela permettra d’utiliser la même micropipette, car le changement de micropipettes et de temps d’étalonnage augmente considérablement le temps de chirurgie et diminue la survie de la mère.
   3. Effectuer l’électroporation des placentas injectés par le plasmide de contrôle dans les 2 minutes suivant l’injection.
   4. Pour l’électroporation, utilisez une paire de palettes de 3 mm fixées à une machine d’électroporation. Pour assurer l’efficacité de l’incorporation de CRISPR et la viabilité des embryons, utilisez les paramètres d’électroporation suivants : 2 impulsions, 30 V, impulsion de 30 ms, impulsion de 970 ms, unipolaire.
   5. Après l’injection mais immédiatement avant l’électroporation, enduisez les lieux de contact avec une solution saline stérile, en appliquant la solution saline précisément sur les trois sites de la paroi utérine et les palettes avec un compte-gouttes ou une seringue.
   6. Appuyez doucement sur les palettes d’électroporation sur les côtés latéraux du placenta. Placer la palette anodique sur le site d’injection et la cathode directement en face (figure 4A-C).
   7. Appuyez sur l’impulsion de la machine d’électroporation et attendez que les deux impulsions soient terminées avant de retirer les palettes d’électroporation.
      REMARQUE: Une petite quantité de mousse blanche est souvent observée entre les palettes et le placenta pendant les impulsions. Si cela ne se produit pas, vérifiez la tension des palettes avec un voltmètre avant de les utiliser ultérieurement. Si la lecture sur le voltmètre ne correspond pas au réglage de la tension d’électroporation, les palettes ne fonctionnent pas.
5. Injection placentaire et électroporation du plasmide expérimental
   1. Suivez les mêmes instructions de l’étape 3.4.1. à l’étape 3.4.2. en utilisant le plasmide expérimental au lieu du plasmide témoin.
   2. Effectuer l’électroporation des trois placentas injectés expérimentaux dans les 2 minutes suivant l’injection. Cela doit être effectué de la même manière que pour ceux injectés avec les plasmides témoins. Suivez l’étape 3.4.4. à l’étape 3.4.7.
6. Achèvement de la chirurgie
   1. Une fois la manipulation placentaire terminée, massez doucement les cornes utérines à l’intérieur de la cavité abdominale en utilisant uniquement les doigts (Figure 5A).
   2. Tout d’abord, effectuez des sutures simples à double nœud sur la couche péritonéale à l’aide de sutures solubles enduites et tressées de 45 cm de long avec un alliage d’aiguilles 3/8c de 13 mm. Espacez les sutures de 2 à 3 mm (figure 5B).
   3. Après avoir suturé la couche péritoine, suturer la peau avec des sutures solubles. Nouer trois nœuds les sutures simples à 2-3 mm l’une de l’autre pour s’assurer que le barrage ne peut pas défaire la suture (figure 5C).
   4. Une fois la suture terminée, régler l’isoflurane à 1 % et l’oxygène à 3,5 L/min, et appliquer de l’adhésif tissulaire sur les sutures de la peau (figure 5D).
      REMARQUE: L’adhésif tissulaire est facultatif mais recommandé pour empêcher la réouverture de l’incision due à la mastication de la mère.
   5. Lorsque l’adhésif tissulaire a séché, éteignez le vaporisateur et retirez la digue de la zone de chirurgie. Placez le barrage dans une cage de soutien sur son dos.

4. Soins postopératoires et surveillance

1. Laissez la mère enceinte récupérer dans une cage propre sous surveillance pendant au moins 30 minutes pour éviter les complications immédiates de la chirurgie. Observez jusqu’à ce qu’il soit complètement ambulatoire et puisse basculer sur ses pieds sans assistance. Abriter seul le barrage après la chirurgie.
2. Suivre les soins postopératoires institutionnels et le suivi jusqu’au prélèvement d’embryons. Enregistrez le poids de la mère et surveillez quotidiennement les sutures et le site d’incision.

5. Collection placentaire E14.5

1. Sur E14.5, anesthésier profondément la mère avec un cocktail kétamine/xylazine (1 mg/mL de kétamine et 0,1 mg/mL de xylazine), puis disloquer cerviquement la mère.
2. Faites une incision en forme de V dans l’abdomen de la digue avec des ciseaux et retirez l’utérus. Placer immédiatement sur une boîte de Petri de 5 cm sur de la glace. À l’aide de forceps, retirez soigneusement l’embryon et le placenta correspondant de l’utérus.
   REMARQUE: Conservez un registre de l’emplacement de l’embryon et du placenta correspondant dans les cornes utérines pour déterminer lequel a reçu la manipulation directe pendant la chirurgie.
3. Notez les poids placentaires. À l’aide de forceps et de rasoirs sans ARNase, coupez le placenta en deux le long de la ligne médiane. Mettre la moitié dans 4% PFA à 4 ° C. Couper à nouveau la moitié restante en deux et conserver les deux quartiers restants à −80 °C dans deux tubes, dont un avec un réactif de stockage d’ARN.
   REMARQUE : Les embryons et autres tissus maternels peuvent être conservés à partir de la collection à −80 °C pour une utilisation ultérieure.

6. Analyse de l’expression génique placentaire

1. Utiliser le quart du placenta stocké à −80 °C dans un réactif de stockage d’ARN.
2. Traiter les placentas pour la qPCR comme décrit dans Elser et al. en utilisant la méthode Trizol pour l’isolement de l’ARN, un spectrophotomètre pour la concentration d’ARN, un kit de synthèse d’ADNc et qPCR avec SYBR Green Master Mix²⁸. Au lieu de la DNAse Turbo DNAfree kit référencée dans Elser et al., utiliser une trousse de nettoyage de l’ARN après l’isolement de l’ARN Trizol pour s’assurer que les échantillons ne contiennent pas de contaminants²⁸.
   NOTE: Lisez la fiche signalétique (FS) de Trizol et utilisez-la dans une hotte chimique.
3. Évaluer l’insertion plasmidique du plasmide témoin avec les amorces GFP et du plasmide expérimental avec les amorces BLAST (amorces énumérées dans le tableau supplémentaire 1). Utilisez la valeur CT pour déterminer la présence du plasmide.
   REMARQUE: Les valeurs CT supérieures à 35 sont des faux positifs, et seules celles inférieures à 35 doivent être considérées comme un indicateur positif que le plasmide a été inséré avec succès.
4. Évaluer l’expression placentaire de l’IGF-1 normalisée au gène 18s (amorces énumérées dans le tableau supplémentaire 1). Utilisez la méthode ddCT pour calculer le changement de pli, puis calculez le changement de pli normalisé des échantillons expérimentaux au changement de pli moyen des échantillons témoins.

7. Analyse du niveau de protéine placentaire

1. Utilisez le quart du placenta qui a été conservé à −80 °C. Homogénéiser le tissu dans une solution tampon composée de 11,5 mM de Tris HCl, 5 mM de MgCl₂ et 10 mM d’inhibiteur de protéase dans_diH2Oavec un pH final de 7,4. Utilisez un homogénéisateur portatif et un pilon pour briser le tissu.
   REMARQUE : L’échantillon ne doit pas dépasser 10 % du volume du tampon.
2. Diluer les échantillons homogénéisés dans le tampon à 1:12, de sorte qu’ils se situent dans la plage détectable d’une trousse de dosage de l’acide bicinchoninique (BCA). Effectuez le dosage BCA conformément aux instructions du fabricant et quantifiez la protéine totale à l’aide d’un lecteur de plaques.
3. Après avoir effectué le test BCA, normaliser tous les échantillons à la même concentration totale de protéines de 2 mg/mL pour l’ELISA IGF-1, comme cela a été fait dans Gumusoglu et ^coll.29.
4. Effectuer le test ELISA IGF-1 conformément aux instructions du fabricant et quantifier les niveaux de protéines IGF-1 à l’aide d’un lecteur de plaque à l’aide d’une courbe de concentration standard.

8. Vérification spatiale CRIPSR par hybridation fluorescente in situ

1. Une fois que les moitiés placentaires ont été fixées de manière appropriée dans du PFA à 4 % à 4 °C pendant 1 à 3 jours, les déplacer dans du saccharose à 20 % à 4 °C avant de les congeler dans un composé à température de coupe optimale (OCT).
2. Couper en série les moitiés placentaires intégrées dans un cryostat à −20 °C en sections de 10 μm et les placer sur des lames à étiqueter. Couper les moitiés du placenta de manière à ce que les trois sous-régions soient visibles. Conserver les lames à −80 °C jusqu’à leur utilisation pour l’hybridation in situ .
3. Effectuer l’étiquetage par hybridation in situ par fluorescence (FISH) en suivant les protocoles du fabricant. Hybridez une lame avec une sonde dCas9-3xNLS-VP64 et une deuxième lame « sœur » du même placenta avec une sonde Prl8a8.
   REMARQUE: La sonde dCas9-3xNLS-VP64 détecte la présence du plasmide de surexpression. La sonde Prl8a8 met en évidence les spongiotrophoblastes de la zone jonctionnelle, ce qui permet d’identifier les sous-régions du placenta. Ces deux sondes sont étiquetées sur des lames « sœurs » séparées pour éviter l’interférence de la fluorescence multicanal avec l’autofluorescence verte dans les placentas.
4. Étiquetez les deux sondes avec le colorant de détection (Opal 620). Après avoir terminé le protocole du fabricant pour FISH, appliquez le support de montage DAPI et placez une lamelle de couverture sur la glissière. Scellez le couvercle avec du vernis à ongles transparent.
5. Imagez les lames sur un microscope à fluorescence composé vertical et traitez-les à l’aide d’un logiciel de traitement d’image approprié. Ici, le logiciel CellSens a été utilisé.

Résultats

Résultats de la procédure générale (Figure 6)
Dans l’étude, il y avait trois groupes manipulés. Ceux-ci comprenaient des placentas injectés avec un plasmide de contrôle général CRISPR Cas9 (Cas9 Control), un plasmide CRISPR de contrôle d’activation (Act Control) ou un plasmide d’activation IGF-1 SAM (Igf1-OE). Le Cas9 Control est mieux adapté aux plasmides knock-out, et le contrôle d’activation est mieux adapté aux plasmides...

Discussion

Le placenta est un régulateur primaire de la croissance fœtale et, comme indiqué précédemment, les changements dans l’expression ou la fonction des gènes placentaires peuvent avoir un impact significatif sur le développement du fœtus⁶. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour effectuer une manipulation CRISPR in vivo ciblée du placenta de souris en utilisant une approche chirurgicale relativement avancée. Cette technique permet un rendement significatif d’embryons v...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml Tubes	USA Scientific Inc	1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS	Thermo Fisher Scientific	J61899.AP
96 Well plate	Cornings	3598	For BCA kit
Absorbent Underpads	Fisher Scientific	14-206-62
Activation Control Plasmid	Santa Cruz Biotechnology	sc-437275	Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0277L	Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor	Vetamac	VAD-601TT	VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel	Akorn	NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Protein quantification
Biovortexer	Bellco Glass, Inc.	198050000	Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software	Olympus	V4.1.1	Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810	Eppendorf	EP022628168	Plate centrifuge
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	J67241-AP	RNA isolation
Cotton Tipped Applicators	ProAdvantage	77100	Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid	Santa Cruz Biotechnology	sc-418922	Dnase-free water provided for dilution
CryoStat	Leica	CM1950
Dissection Microscope	Leica	M125 C	Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures	Med Vet International	J385H
Distilled Water	Gibco	15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Thermo fisher Scientific	14190144	(-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine)	BTX Harvard Apparatus	45-0662	Generator only
Electric Razor	Wahl	CL9990	Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0487	3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK	Grainger	21RK94	Placenta embedding cassettes
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	268280010
F-Air Canisters	Penn Veterinary Supply Inc	BIC80120	Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF	Sigma	F7252-5G	Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader)	Fisher Scientific	14377576	Can be used for BCA and ELISA
Forceps	VWR	82027-386	Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma Aldrich	HT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette)	Sutter Instrument	B150-86-10	O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x)	Thermo Scientific	1861281	Protein homogenization buffer
Heating Pad	Thermotech	S766D	Digitial Moist Heating Pad
Hemostats	VWR	10806-188	Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath	Fisher Scientific	20253	Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1)	Santa Cruz Biotechnology	sc-421056-ACT	Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber	Vetamac	941443	No specific liter size required
Isoflurane	Piramal Pharma Limited	NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal	Fisher Scientific	A451-4	RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml	Akorn	NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride	Sigma Aldrich	63069-100ML	1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode	Fisher Scientific	4309849	Barcoded plates not required
Microcapillary Tip	Eppendorf	5196082001	Attached to BTX Microinjector
Microinjector	BTX Harvard Apparatus	45-0766	Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine)	BTX Harvard Apparatus	45-0751	MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97	Sutter Instrument	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker)	scilogex	822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit	R & D Systems	MG100
Needles	BD - Becton, Dickson, and Company	305106	30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank	Linde	7727-37-9	Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID)	Norbrook Laboratories Limited	NDC 55529-040-10	Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone	Vetamac	921609	9-14 mm
Opal 620 detection dye	Akoya Biosciences	SKU FP1495001KT	Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound	Sakura	4583
Oxygen Tank	Linde	7782 - 44 - 7	Medical grade oxygen
Pestles	USA Scientific Inc	14155390
Povidone-Iodine Solution, 5%	Avrio Health L.P.	NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4367659	Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers)	New England Biolabs	S1330S	Use for cDNA synthesis
Razor Blade	Grainger	26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator	Zymo Research	R1013
RNALater	Thermo Fisher Scientific	AM7021
RNAscope kit v.2.5	Advanced Cells Diagnostics	323100	Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2	Advanced Cells Diagnostics	528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64	Advanced Cells Diagnostics	527421
Roto-Therm Mini	Benchmark	R2020	Dry oven for in situ hybridization
Scissors	VWR	82027-578	Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline)	Hospra	NDC 0409-4888-03	Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate]	Research Product International	03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical	Fisher Scientific	SS277	Protein homogenization buffer
Steamer	Bella	B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape	Busse	696	Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60	Leica	3800160
Syringes	BD - Becton, Dickson, and Company	309659	BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer	Fisher Scientific	13-400-525	This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive	3M	1469SB	VetBond
Tris HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025	1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018	RNA isolation
TSA Buffer Pack	Advanced Cells Diagnostics	322810	Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit	Vetamac	40200	Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope	Olympus	BX61VS	Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block	Thermo Fisher Scientific	4453536	This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color	Amazon	C450B
Xylazine 20mg/ml	Anased	343730_RX