Manipulación CRISPR placentaria dirigida a ratones en vivo

Resumen

Aquí describimos un método específico en el tiempo para manipular eficazmente las vías críticas de desarrollo en la placenta del ratón in vivo. Esto se realiza mediante la inyección y electroporación de plásmidos CRISPR en las placentas de madres embarazadas en el día embrionario 12.5.

Resumen

La placenta es un órgano esencial que regula y mantiene el desarrollo de los mamíferos en el útero. La placenta es responsable de la transferencia de nutrientes y desechos entre la madre y el feto y la producción y entrega de factores de crecimiento y hormonas. Las manipulaciones genéticas placentarias en ratones son fundamentales para comprender el papel específico de la placenta en el desarrollo prenatal. Los ratones transgénicos que expresan Cre específicos de la placenta tienen una efectividad variable, y otros métodos para la manipulación de genes placentarios pueden ser alternativas útiles. Este documento describe una técnica para alterar directamente la expresión génica placentaria utilizando la manipulación del gen CRISPR, que se puede utilizar para modificar la expresión de genes específicos. Utilizando un enfoque quirúrgico relativamente avanzado, las madres embarazadas se someten a una laparotomía en el día embrionario 12.5 (E12.5), y un plásmido CRISPR se administra mediante una micropipeta de vidrio en las placentas individuales. El plásmido se electropora inmediatamente después de cada inyección. Después de la recuperación de la madre, las placentas y los embriones pueden continuar el desarrollo hasta la evaluación en un momento posterior. La evaluación de la placenta y la descendencia después del uso de esta técnica puede determinar el papel de la función placentaria específica en el tiempo en el desarrollo. Este tipo de manipulación permitirá una mejor comprensión de cómo la genética placentaria y la función afectan el crecimiento y desarrollo fetal en múltiples contextos de enfermedades.

Introducción

La placenta es un órgano esencial implicado en el desarrollo del feto. El papel principal de la placenta es proporcionar factores esenciales y regular la transferencia de nutrientes y desechos hacia y desde el feto. Las placentas de mamíferos están compuestas por tejido fetal y materno, que constituye la interfaz fetal-materna y, por lo tanto, la genética de la madre y el feto impactan la función¹. Las anomalías genéticas o la función deteriorada de la placenta pueden alterar drásticamente el desarrollo fetal. Trabajos anteriores han demostrado que la genética y el desarrollo de la placenta están asociados con el desarrollo alterado de sistemas de órganos específicos en el feto. En particular, las anomalías en la placenta están relacionadas con cambios en el cerebro, el corazón y el sistema vascular fetales 2,3,4,5.

El transporte de hormonas, factores de crecimiento y otras moléculas de la placenta al feto juega un papel importante en el desarrollo fetal⁶. Se ha demostrado que alterar la producción placentaria de moléculas específicas puede alterar el neurodesarrollo. La inflamación materna puede aumentar la producción de serotonina al alterar la expresión génica metabólica del triptófano (TRP) en la placenta, lo que posteriormente crea una acumulación de serotonina en el cerebro fetal⁷. Otros estudios han encontrado anomalías placentarias junto con defectos cardíacos. Se cree que las anomalías en la placenta contribuyen a los defectos cardíacos congénitos, el defecto congénito más común en los seres humanos⁸. Un estudio reciente ha identificado varios genes que tienen vías celulares similares tanto en la placenta como en el corazón. Si se interrumpen, estas vías podrían causar defectos en ambos órganos⁹. Los defectos en la placenta pueden exacerbar los defectos cardíacos congénitos. El papel de la genética placentaria y la función en el desarrollo de sistemas específicos de órganos fetales es un campo de estudio emergente.

Los ratones tienen placentas hemocoriales y otras características de las placentas humanas, lo que los convierte en modelos muy útiles para estudiar enfermedades humanas¹. A pesar de la importancia de la placenta, actualmente hay una falta de manipulaciones genéticas in vivo dirigidas. Además, actualmente hay más opciones disponibles para knockouts o knockdowns que manipulaciones de sobreexpresión o ganancia de función en la placenta¹⁰. Hay varias líneas transgénicas que expresan Cre para la manipulación placentaria específica, cada una en diferentes linajes de trofoblastos en diferentes puntos de tiempo. Estos incluyen Cyp19-Cre, Ada / Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER y Gcm1-Cre 11,12,13,14. Si bien estos transgenes Cre son eficientes, es posible que no sean capaces de manipular algunos genes en puntos de tiempo específicos. Otro método comúnmente utilizado para noquear o sobreexpresar la expresión génica placentaria es la inserción de vectores lentivirales en el cultivo de blastocisto, lo que causa una manipulación genética específica del trofoblasto^15,16. Esta técnica permite un cambio robusto en la expresión génica placentaria al principio del desarrollo. El uso de la interferencia de ARN in vivo se ha utilizado escasamente en la placenta. La inserción de plásmidos de ARNsh se puede realizar de manera similar a la técnica CRIPSR descrita en este artículo. Esto se ha hecho en E13.5 para disminuir con éxito la expresión de PlGF en la placenta, con impactos en la vasculatura cerebral de la descendencia¹⁷.

Además de las técnicas que se utilizan principalmente para knockout o knockdown, la inducción de la sobreexpresión se realiza comúnmente con adenovirus o la inserción de una proteína exógena. Las técnicas utilizadas para la sobreexpresión tienen diferentes tasas de éxito y en su mayoría se han realizado más tarde en la gestación. Para investigar el papel del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) en la función placentaria, se realizó una transferencia génica placentaria mediada por adenovirus para inducir la sobreexpresión del gen IGF-1 ^18,19. Esto se realizó al final de la gestación del ratón en E18.5 mediante inyección placentaria directa. Para proporcionar opciones adicionales y eludir posibles fallos de manipulaciones genéticas placentarias establecidas, como fallos de combinación Cre-Lox, la posible toxicidad de adenovirus y los efectos fuera del objetivo del ARNsh, se puede utilizar la manipulación directa in vivo de CRISPR de la placenta^20,21,22. Este modelo fue desarrollado para abordar la falta de modelos de sobreexpresión y para crear un modelo con flexibilidad.

Esta técnica se basa en el trabajo de Lecuyer et al., en el que los plásmidos shRNA y CRISPR fueron dirigidos directamente in vivo a placentas de ratón para alterar la expresión de PlGF ¹⁷. Esta técnica se puede utilizar para alterar directamente la expresión génica placentaria mediante la manipulación CRISPR en múltiples puntos de tiempo; para este trabajo, se seleccionó E12.5. La placenta ha madurado en este punto y es lo suficientemente grande como para manipularla, lo que permite la inserción de un plásmido CRISPR específico en E12.5, que puede tener un impacto significativo en el desarrollo fetal desde mediados hasta finales del embarazo^23,24. A diferencia de los enfoques transgénicos, pero similares a las inducciones virales o la interferencia de ARN, esta técnica permite la sobreexpresión o el knockout en puntos de tiempo particulares utilizando un enfoque quirúrgico relativamente avanzado, evitando así posibles alteraciones de la placenta o letalidad embrionaria de cambios anteriores. Como solo unas pocas placentas reciben el plásmido experimental o de control dentro de una camada, el enfoque permite dos tipos de controles internos. Estos controles son los inyectados y electroporados con el plásmido de control adecuado y los que no reciben manipulación directa. Esta técnica se optimizó para crear una sobreexpresión del gen IGF-1 en la placenta del ratón a través de un plásmido CRISPR mediador de activación sinérgico (SAM). Se eligió el gen IGF-1, ya que el IGF-1 es una hormona de crecimiento esencial entregada al feto que se produce principalmente en la placenta antes del nacimiento^25,26. Esta nueva técnica CRISPR dirigida a la placenta permitirá la manipulación directa para ayudar a definir la conexión entre la función placentaria y el desarrollo fetal.

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo y cumplimiento con las regulaciones federales y la política de la Universidad de Iowa y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.

1. Animales y cría

1. Mantener a los animales en un ciclo de luz diurna de 12 h con comida y agua ad libitum.
2. Use ratones hembra CD-1 de 8 a 15 semanas. Utilice la presencia de un tapón copulatorio para identificar E0.5.
3. En E0.5, casa sola las presas preñadas.

2. Calibración de la micropipeta

NOTA: La calibración de la micropipeta debe realizarse antes de la cirugía cuando sea posible.

1. Antes de hacer y calibrar la micropipeta, diluir todos los plásmidos a la concentración recomendada (0,1 μg/μL) en agua libre de DNasa. Mezclar el plásmido con el colorante verde rápido adecuadamente diluido (1 μg/μL en PBS) (concentración final del plásmido: 0,06 μg/μL).
2. Tire de micropipetas utilizando capilares de vidrio de 10 cm con un diámetro exterior de 1,5 mm y un diámetro interior de 0,86 mm con un extractor de micropipetas.
3. Rompa con cuidado la punta de una micropipeta (2-3 mm) con pinzas estériles.
4. Cargue la micropipeta en una punta microcapilar conectada a un microinyector. Asegúrese de que el microinyector esté conectado a la máquina de microinyección y que haya niveles suficientes de nitrógeno para calibrar la micropipeta.
5. Una vez que la micropipeta esté conectada al microinyector, cárguela con la solución de colorante Fast Green para realizar la calibración (1 μg/μL en PBS). Calibrar la micropipeta para inyectar un volumen de aproximadamente 3,5 μL. Vacíe ("limpie") la micropipeta en preparación para cargar las soluciones plásmidas como se muestra a continuación.
   NOTA: Cada micropipeta será ligeramente diferente. Para evitar dañar la placenta durante la inyección, el tiempo de inyección debe establecerse entre 0,5-1,5 s. La presión debe establecerse entre 1-8.5 psi. Calibrar cada micropipeta por separado; Si la micropipeta no se puede calibrar dentro de estos parámetros, entonces no debe utilizarse.

3. Cirugía (Figura 1A)

NOTA: Para preparar, limpie las superficies de las áreas de preparación y quirúrgicas con etanol al 70%. Coloque una almohadilla absorbente en el área de preparación. En el área de la cirugía, coloque una almohadilla térmica hacia abajo y luego coloque una almohadilla interna absorbente encima de esta. Esterilice todas las herramientas antes de la cirugía. El tiempo que la presa está bajo anestesia debe ser inferior a 1 h.

1. Anestesia
   1. Administrar 5 mg/kg de AINE (meloxicam) u otro analgésico aprobado a la madre embarazada de 30 min a 1 h antes de la cirugía.
   2. Coloque la madre embarazada en una cámara de inducción conectada a un vaporizador de isoflurano.
   3. Ajuste el vaporizador al 4% de isoflurano y 3,5 L/min de oxígeno.
   4. Una vez que la anestesia ha sido confirmada por la falta de respuesta a un pellizco en el dedo del pie y una frecuencia respiratoria reducida, retire la presa de la cámara de inducción al área de preparación.
2. Preparación quirúrgica
   1. En el área de preparación, coloque la presa supina con un cono nasal.
   2. Reduzca el vaporizador al 2% de isoflurano y 3,5 L/min de oxígeno mientras la presa está en el cono de la nariz.
   3. Afeite bien el abdomen de la presa y elimine el exceso de pelaje. Alterne el recubrimiento del abdomen afeitado con solución de povidona y etanol al 70% tres veces usando aplicadores estériles con punta de algodón. Aplique la capa final de la solución de povidona. Para evitar el secado de la córnea, coloque gel lagrimal artificial sobre ambos ojos de la presa (Figura 2A, B).
   4. Después de la preparación, mueva la presa con el cono de la nariz al área de cirugía designada.
3. Laparotomía uterina
   NOTA: Use guantes estériles durante todo el procedimiento quirúrgico. Cambie los guantes si entra en contacto alguna superficie no estéril.
   1. En el área de la cirugía, coloque la madre supina y asegure el cono nasal en su lugar con cinta adhesiva. Ajuste la almohadilla térmica debajo de la almohadilla absorbente a 45 °C.
   2. Usando fórceps y tijeras, haga una incisión de aproximadamente 2 cm en la línea media a través de la piel. Use fórceps para colocar la piel en la carpa y haga una incisión vertical en la piel. Después de esto, haga otra incisión de tamaño similar a través del peritoneo para exponer los cuernos uterinos. Con fórceps, coloque el peritoneo mientras realiza la incisión vertical (Figura 2C, D).
      NOTA: Si no se coloca correctamente la tienda de campaña mientras se incide el peritoneo, puede provocar una incisión fatal en los intestinos.
   3. Masajee suavemente los cuernos uterinos a través de la incisión presionando los lados del abdomen. Haga esto guiando cuidadosamente el útero sin herramientas, usando solo los dedos para evitar lesiones accidentales. Coloque el útero expuesto encima de una cortina quirúrgica estéril que cubra el abdomen de la presa y manténgalo húmedo durante toda la cirugía con gotas de solución salina estéril, que se puede calentar a 30 ° C antes de usar según sea necesario (Figura 2E, F).
      NOTA: Los cuernos uterinos pueden ser identificados como se describe en Wang et ^al.27.
   4. Una vez que el útero está expuesto, seleccione tres pares de placentas para su manipulación.
      NOTA: Las placentas pueden ser identificadas como lo describen Elmore et ^al.24. Para maximizar la supervivencia de los embriones, no se deben tratar más de 6 placentas. Si hay menos de 12 embriones presentes, no se deben inyectar más de 4 placentas. Seleccione dos placentas adyacentes para que una reciba una inyección de control y la otra reciba el plásmido experimental. El uso de dos placentas adyacentes permite una mejor comparación de placentas en lugares similares en el útero y también permite una mayor tasa de supervivencia. Los pares placentarios seleccionados se eligen al azar y se espacian a lo largo de ambos cuernos uterinos (Figura 1B).
   5. Registre la ubicación de las manipulaciones placentarias y la organización de los embriones dentro de los cuernos uterinos para que los embriones y las placentas puedan identificarse durante la recolección, ya que una madre llevará placentas / embriones controlados y tratados experimentalmente.
4. Inyección placentaria y electroporación del plásmido control
   NOTA: Para mantener una técnica aséptica, esterilice las paletas de electroporación y el microinyector con un esterilizante frío antes de su uso. Cambie los guantes si entra en contacto con alguna superficie no estéril.
   1. Utilizando la micropipeta calibrada, cargar una cantidad suficiente del plásmido de control adecuado para tres inyecciones. Realice todas las inyecciones a una profundidad de ~0.5 mm lateralmente en la placenta entre la decidua (blanco) y la zona de unión (rojo oscuro) (Figura 3A-F).
   2. Realizar inyecciones en las tres placentas de control.
      NOTA: Realice todas las inyecciones de plásmidos de control antes de las inyecciones experimentales para evitar la contaminación cruzada de los plásmidos con la micropipeta. Esto permitirá utilizar la misma micropipeta, ya que cambiar las micropipetas y el tiempo de calibración aumenta drásticamente el tiempo de cirugía y disminuye la supervivencia de la madre.
   3. Realizar la electroporación de las placentas inyectadas con plásmidos de control dentro de los 2 minutos posteriores a la inyección.
   4. Para la electroporación, utilice un par de paletas de 3 mm conectadas a una máquina de electroporación. Para garantizar la eficiencia de incorporación de CRISPR y la viabilidad de los embriones, utilice los siguientes ajustes de electroporación: 2 pulsos, 30 V, pulso de 30 ms, pulso de 970 ms apagado, unipolar.
   5. Después de la inyección, pero inmediatamente antes de la electroporación, cubra los lugares de contacto con solución salina estéril, aplicando la solución salina con precisión en los tres sitios de la pared uterina y las paletas con un gotero o jeringa.
   6. Presione suavemente las paletas de electroporación en los lados laterales de la placenta. Coloque la paleta del ánodo sobre el lugar de inyección y el cátodo directamente opuesto (Figura 4A-C).
   7. Presione el pulso en la máquina de electroporación y espere a que se completen los dos pulsos antes de retirar las paletas de electroporación.
      NOTA: A menudo se ve una pequeña cantidad de espuma blanca entre las paletas y la placenta durante los pulsos. Si esto no ocurre, verifique el voltaje de las paletas con un voltímetro antes de seguir usándolo. Si la lectura en el voltímetro no coincide con la configuración de voltaje de electroporación, las paletas no funcionan.
5. Inyección placentaria y electroporación del plásmido experimental
   1. Siga las mismas instrucciones del paso 3.4.1. al paso 3.4.2. utilizando el plásmido experimental en lugar del plásmido de control.
   2. Realizar la electroporación de las tres placentas inyectadas experimentales dentro de los 2 minutos posteriores a la inyección. Esto debe realizarse de la misma manera que para aquellos inyectados con los plásmidos de control. Siga el paso 3.4.4. al paso 3.4.7.
6. Finalización de la cirugía
   1. Una vez que se complete la manipulación placentaria, masajee suavemente los cuernos uterinos dentro de la cavidad abdominal usando solo los dedos (Figura 5A).
   2. Primero, realice suturas simples de doble nudo en la capa de peritoneo utilizando suturas solubles recubiertas y trenzadas que tengan 45 cm de largo con una aleación de aguja de 13 mm 3/8c. Espaciar las suturas a 2-3 mm de distancia (Figura 5B).
   3. Después de suturar la capa de peritoneo, suture la piel con suturas solubles. Anude tres veces las suturas simples separadas por 2-3 mm para garantizar que la presa no pueda deshacer la sutura (Figura 5C).
   4. Una vez completada la sutura, ajustar el isoflurano al 1% y el oxígeno a 3,5 L/min, y aplicar adhesivo tisular a las suturas sobre la piel (Figura 5D).
      NOTA: El adhesivo tisular es opcional, pero se recomienda para evitar la reapertura de la incisión debido a la masticación de la presa.
   5. Cuando el adhesivo tisular se haya secado, apague el vaporizador y retire la presa del área de la cirugía. Coloque la presa en una jaula de apoyo sobre su espalda.

4. Atención y seguimiento postoperatorio

1. Permita que la madre preñada se recupere en una jaula limpia bajo supervisión durante un mínimo de 30 minutos para garantizar que no haya complicaciones inmediatas de la cirugía. Observe hasta que esté completamente ambulatorio y pueda voltearse sobre sus pies sin ayuda. Individualmente casa la presa post-cirugía.
2. Seguir el cuidado postoperatorio institucional y el seguimiento hasta la recolección de embriones. Registre el peso de la presa y controle las suturas y el sitio de la incisión diariamente.

5. Recolección placentaria E14.5

1. En E14.5, anestesiar profundamente la presa con un cóctel de ketamina/xilazina (1 mg/ml de ketamina y 0,1 mg/ml de xilazina), y luego dislocar cervicamente la presa.
2. Haga una incisión en forma de V en el abdomen de la presa con tijeras y retire el útero. Colocar inmediatamente sobre una placa de Petri de 5 cm sobre hielo. Con fórceps, retire cuidadosamente el embrión y la placenta correspondiente del útero.
   NOTA: Mantenga un registro de la ubicación del embrión y la placenta correspondiente en los cuernos uterinos para determinar cuál recibió la manipulación directa durante la cirugía.
3. Registre los pesos de la placenta. Usando fórceps y cuchillas de afeitar sin ARNasa, corte la placenta por la mitad en la línea media. Poner la mitad en PFA al 4% a 4 °C. Cortar la mitad restante por la mitad de nuevo, y almacenar los dos cuartos restantes a -80 °C en dos tubos, uno con reactivo de almacenamiento de ARN.
   NOTA: Los embriones y otros tejidos maternos pueden almacenarse de la colección a -80 °C para su uso futuro.

6. Análisis de expresión génica placentaria

1. Utilice la cuarta parte de la placenta almacenada a -80 °C en un reactivo de almacenamiento de ARN.
2. Procesar las placentas para qPCR como se describe en Elser et al. utilizando el método Trizol para el aislamiento de ARN, un espectrofotómetro para la concentración de ARN, un kit de síntesis de ADNc y qPCR con SYBR Green Master Mix²⁸. En lugar de la DNAsa del kit Turbo DNAfree a la que se hace referencia en Elser et al., use un kit RNAcleanup después del aislamiento de ARN Trizol para asegurarse de que las muestras no contengan contaminantes²⁸.
   NOTA: Lea la hoja de datos de seguridad de materiales (MSDS) de Trizol y úsela en una campana extractora de humos químicos.
3. Evaluar la inserción del plásmido control con cebadores GFP y del plásmido experimental con cebadores BLAST (cebadores enumerados en la Tabla suplementaria 1). Utilice el valor de TC para determinar la presencia del plásmido.
   NOTA: Los valores de TC superiores a 35 son falsos positivos, y solo los inferiores a 35 deben considerarse un indicador positivo de que el plásmido se insertó correctamente.
4. Evaluar la expresión placentaria de IGF-1 normalizada al gen de mantenimiento 18s (cebadores enumerados en la Tabla suplementaria 1). Utilice el método ddCT para calcular el cambio de pliegue y, a continuación, calcule el cambio de pliegue normalizado de las muestras experimentales al cambio medio de pliegue de las muestras de control.

7. Análisis del nivel de proteína placentaria

1. Utilice el cuarto de la placenta que se ha almacenado a -80 °C. Homogeneizar el tejido en una solución tampón hecha de 11,5 mM de Tris HCl, 5 mM de MgCl₂ y 10 mM de inhibidor de la proteasa en_diH2Ocon un pH final de 7,4. Use un homogeneizador de mano y un mortero para romper el tejido.
   NOTA: La muestra no debe exceder el 10% del volumen del tampón.
2. Diluir las muestras homogeneizadas en el tampón a 1:12, de modo que estén dentro del rango detectable de un kit de ensayo de ácido bicinchonínico (BCA). Realice el ensayo de BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cuantifique la proteína total utilizando un lector de placas.
3. Después de realizar el ensayo de BCA, normalizar todas las muestras a la misma concentración total de proteína de 2 mg/mL para el ELISA de IGF-1, como se hizo en Gumusoglu et ^al.29.
4. Realice el ELISA IGF-1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cuantifique los niveles de proteína IGF-1 con un lector de placas utilizando una curva de concentración estándar.

8. Verificación espacial de CRIPSR mediante etiquetado fluorescente de hibridación in situ

1. Después de que las mitades placentarias se hayan fijado adecuadamente en PFA al 4% a 4 °C durante 1-3 días, moverlas a sacarosa al 20% a 4 °C antes de congelarlas en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT).
2. Dividir en serie las mitades de la placenta incrustada en OCT en un criostato de −20 °C en secciones de 10 μm, y colocarlas en portaobjetos para etiquetarlas. Secciona la placenta a la mitad para que las tres subregiones sean visibles. Conservar los portaobjetos a -80 °C hasta su uso para la hibridación in situ .
3. Realizar el etiquetado de hibridación fluorescente in situ (FISH) siguiendo los protocolos del fabricante. Hibridar un portaobjetos con una sonda dCas9-3xNLS-VP64 y un segundo portaobjetos "hermano" de la misma placenta con una sonda Prl8a8.
   NOTA: La sonda dCas9-3xNLS-VP64 detecta la presencia del plásmido de sobreexpresión. La sonda Prl8a8 resalta los espongiotrofoblastos de la zona de unión, lo que permite identificar las subregiones de la placenta. Estas dos sondas están etiquetadas en portaobjetos "hermanos" separados para evitar la interferencia de la fluorescencia multicanal con la autofluorescencia verde en las placentas.
4. Etiquete ambas sondas con el tinte de detección (Opal 620). Después de completar el protocolo del fabricante para FISH, aplique el medio de montaje DAPI y coloque un cubreobjetos en la corredera. Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.
5. Tome imágenes de los portaobjetos en un microscopio de fluorescencia compuesto vertical y procese utilizando un software de procesamiento de imágenes apropiado. Aquí, se utilizó el software CellSens.

Resultados

Resultados generales del procedimiento (Figura 6)
En el estudio, hubo tres grupos manipulados. Estos incluyeron placentas inyectadas con un plásmido de control CRISPR Cas9 general (Cas9 Control), un plásmido CRISPR de control de activación (Act Control) o un plásmido de activación SAM IGF-1 (Igf1-OE). El Cas9 Control es más adecuado para plásmidos knockout, y el control de activación es más adecuado para plásmidos de sobreexpresión/act...

Discusión

La placenta es un regulador primario del crecimiento fetal y, como se señaló anteriormente, los cambios en la expresión o función génica de la placenta pueden afectar significativamente el desarrollo fetal⁶. El protocolo descrito aquí se puede utilizar para realizar una manipulación CRISPR in vivo dirigida de la placenta del ratón utilizando un enfoque quirúrgico relativamente avanzado. Esta técnica permite un rendimiento significativo de embriones viables y sus correspondientes...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml Tubes	USA Scientific Inc	1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS	Thermo Fisher Scientific	J61899.AP
96 Well plate	Cornings	3598	For BCA kit
Absorbent Underpads	Fisher Scientific	14-206-62
Activation Control Plasmid	Santa Cruz Biotechnology	sc-437275	Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0277L	Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor	Vetamac	VAD-601TT	VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel	Akorn	NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Protein quantification
Biovortexer	Bellco Glass, Inc.	198050000	Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software	Olympus	V4.1.1	Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810	Eppendorf	EP022628168	Plate centrifuge
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	J67241-AP	RNA isolation
Cotton Tipped Applicators	ProAdvantage	77100	Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid	Santa Cruz Biotechnology	sc-418922	Dnase-free water provided for dilution
CryoStat	Leica	CM1950
Dissection Microscope	Leica	M125 C	Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures	Med Vet International	J385H
Distilled Water	Gibco	15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Thermo fisher Scientific	14190144	(-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine)	BTX Harvard Apparatus	45-0662	Generator only
Electric Razor	Wahl	CL9990	Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0487	3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK	Grainger	21RK94	Placenta embedding cassettes
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	268280010
F-Air Canisters	Penn Veterinary Supply Inc	BIC80120	Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF	Sigma	F7252-5G	Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader)	Fisher Scientific	14377576	Can be used for BCA and ELISA
Forceps	VWR	82027-386	Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma Aldrich	HT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette)	Sutter Instrument	B150-86-10	O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x)	Thermo Scientific	1861281	Protein homogenization buffer
Heating Pad	Thermotech	S766D	Digitial Moist Heating Pad
Hemostats	VWR	10806-188	Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath	Fisher Scientific	20253	Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1)	Santa Cruz Biotechnology	sc-421056-ACT	Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber	Vetamac	941443	No specific liter size required
Isoflurane	Piramal Pharma Limited	NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal	Fisher Scientific	A451-4	RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml	Akorn	NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride	Sigma Aldrich	63069-100ML	1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode	Fisher Scientific	4309849	Barcoded plates not required
Microcapillary Tip	Eppendorf	5196082001	Attached to BTX Microinjector
Microinjector	BTX Harvard Apparatus	45-0766	Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine)	BTX Harvard Apparatus	45-0751	MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97	Sutter Instrument	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker)	scilogex	822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit	R & D Systems	MG100
Needles	BD - Becton, Dickson, and Company	305106	30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank	Linde	7727-37-9	Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID)	Norbrook Laboratories Limited	NDC 55529-040-10	Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone	Vetamac	921609	9-14 mm
Opal 620 detection dye	Akoya Biosciences	SKU FP1495001KT	Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound	Sakura	4583
Oxygen Tank	Linde	7782 - 44 - 7	Medical grade oxygen
Pestles	USA Scientific Inc	14155390
Povidone-Iodine Solution, 5%	Avrio Health L.P.	NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4367659	Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers)	New England Biolabs	S1330S	Use for cDNA synthesis
Razor Blade	Grainger	26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator	Zymo Research	R1013
RNALater	Thermo Fisher Scientific	AM7021
RNAscope kit v.2.5	Advanced Cells Diagnostics	323100	Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2	Advanced Cells Diagnostics	528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64	Advanced Cells Diagnostics	527421
Roto-Therm Mini	Benchmark	R2020	Dry oven for in situ hybridization
Scissors	VWR	82027-578	Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline)	Hospra	NDC 0409-4888-03	Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate]	Research Product International	03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical	Fisher Scientific	SS277	Protein homogenization buffer
Steamer	Bella	B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape	Busse	696	Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60	Leica	3800160
Syringes	BD - Becton, Dickson, and Company	309659	BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer	Fisher Scientific	13-400-525	This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive	3M	1469SB	VetBond
Tris HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025	1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018	RNA isolation
TSA Buffer Pack	Advanced Cells Diagnostics	322810	Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit	Vetamac	40200	Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope	Olympus	BX61VS	Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block	Thermo Fisher Scientific	4453536	This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color	Amazon	C450B
Xylazine 20mg/ml	Anased	343730_RX