JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里，我们描述了一种时间特异性方法，以有效操纵 体内小鼠胎盘中的关键发育途径。这是通过在胚胎第12.5天将CRISPR质粒注射和电穿孔到妊娠母亲的胎盘中进行的。

摘要

胎盘是调节和维持子宫 内哺乳动物发育的重要器官。胎盘负责母亲和胎儿之间营养物质和废物的转移以及生长因子和激素的产生和输送。小鼠胎盘遗传操作对于了解胎盘在产前发育中的特定作用至关重要。表达胎盘特异性Cre的转基因小鼠具有不同的有效性，其他胎盘基因操作方法可能是有用的替代方案。本文描述了一种利用CRISPR基因操作直接改变胎盘基因表达的技术，可用于修饰靶基因的表达。使用相对先进的手术方法，怀孕的母亲在胚胎第12.5天（E12.5）进行剖腹手术，并通过玻璃微量移液器将CRISPR质粒输送到单个胎盘中。质粒在每次进样后立即电穿孔。母体恢复后，胎盘和胚胎可以继续发育，直到稍后的时间点进行评估。使用该技术后对胎盘和后代的评估可以确定时间特异性胎盘功能在发育中的作用。这种类型的操作将允许更好地了解胎盘遗传学和功能如何影响多种疾病背景下的胎儿生长和发育。

引言

胎盘是参与胎儿发育的重要器官。胎盘的主要作用是提供基本因素并调节营养物质和废物与胎儿之间的转移。哺乳动物胎盘由胎儿和母体组织组成，它们构成了胎母界面，因此，母体和胎儿的遗传学影响功能1。胎盘的遗传异常或功能受损会极大地改变胎儿的发育。先前的工作表明，胎盘遗传学和发育与胎儿特定器官系统的发育改变有关。特别是，胎盘异常与胎儿大脑，心脏和血管系统的变化有关2，3，4，5。

激素、生长因子和其他分子从胎盘到胎儿的运输在胎儿发育中起着重要作用6。已经表明，改变特定分子的胎盘产生可以改变神经发育。母体炎症可以通过改变胎盘中的色氨酸（TRP）代谢基因表达来增加血清素的产生，从而在胎儿大脑中产生血清素7。其他研究发现胎盘异常与心脏缺陷。胎盘异常被认为会导致先天性心脏缺陷，这是人类最常见的出生缺陷8。最近的一项研究已经确定了几个在胎盘和心脏中具有相似细胞途径的基因。如果被破坏，这些途径可能会导致两个器官的缺陷9。胎盘缺陷可能会加剧先天性心脏缺陷。胎盘遗传学和功能对特定胎儿器官系统发育的作用是一个新兴的研究领域。

小鼠具有血绒毛膜胎盘和人类胎盘的其他特征，这使它们成为研究人类疾病的非常有用的模型1。尽管胎盘很重要，但目前缺乏有针对性的体内基因操作。此外，目前有更多的选择可用于敲除或敲低，而不是胎盘中的过表达或功能获得操作10。有几种表达Cre的转基因系用于胎盘特异性操作，每种系在不同的时间点位于不同的滋养层谱系中。这些包括Cyp19-Cre，Ada/Tpbpa-Cre，PDGFRα-CreER和Gcm1-Cre 11，12，13，14。虽然这些Cre转基因是有效的，但它们可能无法在特定的时间点操纵某些基因。敲除或过表达胎盘基因表达的另一种常用方法是将慢病毒载体插入囊胚培养物中，这会导致滋养层特异性遗传操作15，16。该技术允许胎盘基因表达在发育早期发生强劲变化。RNA干扰在体内的使用在胎盘中很少使用。shRNA质粒的插入可以类似于本文中描述的CRIPSR技术进行。这已在E13.5完成，以成功降低胎盘中的PlGF表达，对后代脑脉管系统产生影响17。

除了主要用于敲除或敲低的技术外，诱导过表达通常使用腺病毒或插入外源性蛋白进行。用于过表达的技术具有不同的成功率，并且大多在妊娠后期进行。为了研究胰岛素样生长因子1（IGF-1）在胎盘功能中的作用，进行了腺病毒介导的胎盘基因转移以诱导IGF-1基因18，19的过表达。这是在小鼠妊娠后期通过直接胎盘注射在E18.5上进行的。为了提供额外的选择并规避已建立的胎盘遗传操作的可能失败，例如Cre-Lox组合失败，腺病毒的可能毒性以及shRNA的脱靶效应，可以使用胎盘的体内直接CRISPR操作20，21，22。开发该模型是为了解决缺乏过表达模型的问题，并创建一个具有灵活性的模型。

该技术基于Lecuyer等人的工作，其中shRNA和CRISPR质粒在体内直接靶向小鼠胎盘以改变PlGF表达17。该技术可用于在多个时间点使用CRISPR操作直接改变胎盘基因表达;对于这项工作，选择了E12.5。此时胎盘已经成熟，并且足够大，可以操纵，允许在E12.5上插入特定的CRISPR质粒，这可能对怀孕中晚期的胎儿发育产生重大影响23，24。与转基因方法不同，但与病毒诱导或RNA干扰类似，该技术允许使用相对先进的手术方法在特定时间点进行过表达或敲除，从而避免早期变化可能造成的胎盘受损或胚胎致死性。由于只有少数胎盘在一窝中接受实验质粒或对照质粒，因此该方法允许两种类型的内部对照。这些质控品是用适当的对照质粒进样和电穿孔的质粒，以及未接受直接操作的质粒。该技术经过优化，通过协同激活介质（SAM）CRISPR质粒在小鼠胎盘中产生IGF-1基因的过表达。选择了 IGF-1 基因，因为 IGF-1 是一种主要的生长激素，主要在出生前在胎盘中产生25，26.这种新的胎盘靶向CRISPR技术将允许直接操作，以帮助确定胎盘功能与胎儿发育之间的联系。

研究方案

所有程序均按照联邦法规和爱荷华大学政策执行，并得到机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 畜牧业

  1. 将动物保持在12小时的日光循环 中，随意进食和水。
  2. 使用8-15周龄的CD-1雌性小鼠。使用交配插头的存在来识别 E0.5。
  3. 在E0.5上，单独容纳怀孕的水坝。

2. 微量移液器的校准

注意:微量移液器的校准应在手术前尽可能进行。

  1. 在制作和校准微量移液器之前，将所有质粒稀释至无DNA酶水中的推荐浓度（0.1μg/μL）。将质粒与适当稀释的快速绿染料（PBS 中的 1 μg/μL）（最终质粒浓度:0.06 μg/μL）混合。
  2. 使用外径为1.5 mm，内径为0.86 mm的10 cm玻璃毛细管拉动微量移液器。
  3. 用无菌镊子小心地折断微量移液器（2-3毫米）的尖端。
  4. 将微量移液器装入连接到微量注射器的微毛细管尖端中。确保微量注射器连接到显微注射机，并且有足够的氮气水平来校准微量移液器。
  5. 将微量移液器连接到微量进样器后，用Fast Green染料溶液加载以执行校准（PBS中为1μg/μL）。校准微量移液器以注入约3.5μL的体积。 清空（"清除"）微量移液器以准备加载质粒溶液，如下所示。
    注意:每个微量移液器略有不同。为避免在注射过程中损坏胎盘，注射时间应设置在0.5-1.5秒之间。压力应设置在 1-8.5 psi 之间。分别校准每个微量移液器;如果微量移液器无法在这些参数内校准，则不应使用。

3. 手术（图1A）

注意:要准备，请用70%乙醇清洁准备和手术区域的表面。在准备区域放置吸收性垫。在手术区域，放一个加热垫，然后在上面放一个吸收垫。手术前对所有工具进行消毒。大坝麻醉的时间应在1小时内。

  1. 麻醉
    1. 在手术前30分钟至1小时向妊娠母亲施用5mg / kg非甾体抗炎药（美洛昔康）或其他批准的镇痛药。
    2. 将怀孕的大坝放在连接到异氟烷蒸发器的诱导室中。
    3. 将蒸发器设置为 4% 异氟醚和 3.5 L/min 氧气。
    4. 一旦确认麻醉对脚趾夹伤和呼吸频率降低缺乏反应，将大坝从诱导室移至准备区域。
  2. 手术准备
    1. 在准备区域，用鼻锥仰卧位大坝。
    2. 当大坝在鼻锥中时，将蒸发器减少到 2% 异氟醚和 3.5 L/min 氧气。
    3. 彻底剃掉大坝的腹部并去除多余的皮毛。使用无菌棉头涂抹器，用聚维酮溶液和 70% 乙醇交替涂覆剃光的腹部 3 次。涂上聚维酮溶液的最后一层。为防止角膜干燥，将人工泪液凝胶放在大坝的双眼上（图2A，B）。
    4. 准备好后，将带有鼻锥的大坝移动到指定的手术区域。
  3. 子宫剖腹手术
    注意:在整个手术过程中使用无菌手套。如果接触任何非无菌表面，请更换手套。
    1. 在手术区域，将大坝仰卧，并用胶带将鼻锥固定到位。将吸收垫下方的加热垫设置为45°C。
    2. 使用镊子和剪刀，在皮肤上做一个大约 2 厘米的中线切口。用镊子撑开皮肤，并在皮肤上做一个垂直切口。在此之后，通过腹膜做另一个类似大小的切口以露出子宫角。使用镊子，在垂直切口的同时撑起腹膜（图2C，D）。
      注意:切开腹膜时未能正确搭帐篷可能会导致肠道致命切口。
    3. 通过按压腹部两侧，通过切口轻轻按摩子宫角。通过不使用工具小心地引导子宫来做到这一点，只用手指以避免意外伤害。将暴露的子宫放在覆盖大坝腹部的无菌手术窗帘上，并在整个手术过程中用无菌盐水滴保持湿润，可以根据需要使用前将其加热至30°C（图2E，F）。
      注意:子宫角可以按照Wang等人27中的描述进行识别。
    4. 一旦子宫暴露，选择三对胎盘进行操作。
      注意:胎盘可以按照Elmore等人24的描述进行识别。为了最大限度地提高胚胎的存活率，不应治疗超过6个胎盘。如果胚胎少于12个，则不应注射超过4个胎盘。选择两个相邻的胎盘，使一个接受对照注射，另一个接受实验质粒。使用两个相邻的胎盘可以更好地比较子宫中相似位置的胎盘，还可以提高存活率。所选胎盘对是随机选择的，并在整个子宫角中间隔开（图1B）。
    5. 记录胎盘操作的位置和胚胎在子宫角内的组织，以便在收集过程中可以识别胚胎和胎盘，因为一个母亲将携带对照和实验处理的胎盘/胚胎。
  4. 胎盘注射和对照质粒电穿孔
    注意:为保持无菌技术，请在使用前用冷灭菌剂对电穿孔桨和显微注射器进行消毒。如果接触任何非无菌表面，请更换手套。
    1. 使用校准的微量移液器，加载足够量的适当对照质粒进行三次进样。在~0.5mm的深度横向进行所有注射到蜕膜（白色）和交界区（深红色）之间的胎盘中（图3A-F）。
    2. 在三个对照胎盘中进行注射。
      注意:在实验进样之前执行所有对照质粒进样，以避免质粒与微量移液器交叉污染。这将允许使用相同的微量移液器，因为更换微量移液器和校准时间会大大增加手术时间并降低大坝的存活率。
    3. 在注射后2分钟内对对照质粒注射的胎盘进行电穿孔。
    4. 对于电穿孔，请使用连接到电穿孔机的一对 3 毫米桨。为确保CRISPR掺入效率和胚胎的活力，请使用以下电穿孔设置:2脉冲，30 V，30 ms脉冲，970 ms脉冲关闭，单极性。
    5. 注射后但在电穿孔前，用无菌盐水涂覆接触部位，用滴管或注射器将盐水精确地涂抹在子宫壁和桨上的三个部位。
    6. 轻轻按压胎盘侧面的电穿孔桨。将阳极桨放在注射部位和正对的阴极上（图4A-C）。
    7. 按压电穿孔机上的脉冲，等待两个脉冲完成，然后再取出电穿孔桨。
      注意:在脉冲期间，桨和胎盘之间经常看到少量白色泡沫。如果没有发生这种情况，请在进一步使用前用电压表检查桨的电压。如果电压表上的读数与电穿孔电压设置不匹配，则拨片不起作用。
  5. 胎盘注射和实验质粒电穿孔
    1. 按照步骤 3.4.1 中的相同说明进行操作。到步骤 3.4.2。使用实验质粒代替对照质粒。
    2. 在注射后2分钟内对所有三个实验性注射胎盘进行电穿孔。这应以与注射对照质粒相同的方式进行。按照步骤 3.4.4 操作。到步骤 3.4.7。
  6. 手术完成
    1. 胎盘操作完成后，仅用手指轻轻按摩腹腔内的子宫角（图5A）。
    2. 首先，使用45厘米长的涂层和编织可溶解缝合线和13毫米3/8c针合金在腹膜层上进行双结单缝合。将缝合线间隔2-3毫米（图5B）。
    3. 缝合腹膜层后，用可溶解的缝合线缝合皮肤。将单缝线打结三重，间隔2-3毫米，以确保大坝无法解开缝合（图5C）。
    4. 缝合完成后，将异氟醚设置为1%，将氧气设置为3.5 L / min，并将组织粘合剂涂在皮肤上的缝合线上（图5D）。
      注意:纸巾粘合剂是可选的，但建议使用，以防止由于大坝咀嚼而重新打开切口。
    5. 当组织粘合剂干燥后，关闭蒸发器，并从手术区域取出大坝。将大坝放在背上的支撑笼中。

4. 术后护理和监测

  1. 让怀孕的大坝在监督下的干净笼子中休养至少 30 分钟，以确保手术没有立即并发症。观察，直到它完全走动并且可以在没有帮助的情况下翻转站起来。手术后单独安置大坝。
  2. 遵循机构术后护理和监测，直到胚胎采集。记录坝重，并每天监测缝合线和切口部位。

5. E14.5胎盘采集

  1. 在 E14.5 上，用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（1 mg/mL 氯胺酮和 0.1 mg/mL 甲苯噻嗪）深度麻醉大坝，然后颈椎脱臼大坝。
  2. 用剪刀在大坝腹部做一个V形切口，然后切除子宫。立即放在冰上的5厘米培养皿上。使用镊子，小心地从子宫中取出胚胎和相应的胎盘。
    注意:记录胚胎位置和子宫角中的相应胎盘，以确定在手术过程中接受直接操作的胎盘。
  3. 记录胎盘重量。使用不含RNA酶的镊子和剃须刀，将胎盘从中线切成两半。将一半放入4°C的4%PFA中。 再次将剩余的一半切成两半，并将剩余的四分之一在-80°C下储存在两个管中，一个装有RNA储存试剂。
    注意:胚胎和其他母体组织可以从收集中储存在-80°C以备将来使用。

6. 胎盘基因表达分析

  1. 使用在RNA储存试剂中储存在-80°C的胎盘的四分之一。
  2. 如Elser等人所述，使用Trizol方法进行RNA分离，分光光度计进行RNA浓度，cDNA合成试剂盒以及使用SYBR绿色预混液28的qPCR，处理胎盘以进行qPCR。代替Elser等人引用的Turbo DNAfree试剂盒DNAse，在Trizol RNA分离后使用RNAcleanup试剂盒，以确保样品不含污染物28。
    注意:阅读Trizol的材料安全数据表（MSDS），并在化学通风橱中使用它。
  3. 用GFP引物评估对照质粒的质粒插入和用BLAST引物（ 补充表1中列出的引物）的实验质粒插入。使用CT值确定质粒的存在。
    注意:CT值高于35是假阳性，只有低于35的CT值才应被视为质粒已成功插入的阳性指标。
  4. 评估归一化为管家基因的 IGF-1 胎盘表达 18s （ 补充表1中列出的引物）。使用ddCT方法计算倍数变化，然后计算实验样品的归一化倍数变化到对照样品的平均倍数变化。

7. 胎盘蛋白水平分析

  1. 使用储存在-80°C的胎盘的四分之一。 在由 11.5 mM Tris HCl、5 mM MgCl2 和 10 mM 蛋白酶抑制剂制成的缓冲溶液中匀浆组织，最终 pH值为 7.4。使用手持式均质器和杵分解组织。
    注意:样品不应超过缓冲液体积的10%。
  2. 在缓冲液中以1:12稀释匀浆样品，使其在二辛可宁酸测定（BCA）试剂盒的可检测范围内。根据制造商的说明进行BCA测定，并使用酶标仪定量总蛋白质。
  3. 进行BCA测定后，将所有样品标准化为IGF-1 ELISA的相同总蛋白质浓度2mg / mL，如Gumusoglu等人所做的那样29。
  4. 根据制造商的说明执行 IGF-1 ELISA， 并使用标准浓度曲线用酶标仪定量 IGF-1 蛋白水平.

8. 使用荧光 原位 杂交标记的空间CRIPSR验证

  1. 将胎盘两半在4°C的4%PFA中适当固定1-3天后，将它们在4°C下移动到20%蔗糖中，然后在最佳切割温度（OCT）化合物中冷冻。
  2. 将OCT包埋的胎盘在-20°C低温恒温器中连续切片成10μm切片，并将它们放在要标记的载玻片上。将胎盘切成两半，以便所有三个子区域都可见。将载玻片储存在-80°C直至用于 原位 杂交。
  3. 按照制造商的方案进行荧光 原位 杂交（FISH）标记。用dCas9-3xNLS-VP64探针杂交一张载玻片，用Prl8a8探针杂交同一胎盘的第二张"姐妹"载玻片。
    注意:dCas9-3xNLS-VP64探针检测过表达质粒的存在。Prl8a8探针突出显示了交界区的海绵养层，这使得胎盘的亚区域是可识别的。这两个探针标记在单独的"姐妹"载玻片上，以避免多通道荧光对胎盘中的绿色自发荧光的干扰。
  4. 用检测染料（Opal 620）标记两个探针。完成制造商的 FISH 协议后，应用 DAPI 安装介质，并在载玻片上放置盖玻片。用透明指甲油密封盖玻片。
  5. 在正置复合荧光显微镜上对载玻片进行成像，并使用适当的图像处理软件对其进行处理。这里使用了CellSens软件。

结果

一般手术结果（图6）
在这项研究中，有三个纵的组。这些包括注射普通CRISPR Cas9对照质粒（Cas9对照），活化对照CRISPR质粒（行动对照）或IGF-1 SAM活化质粒（Igf1-OE）的胎盘。Cas9对照更适合敲除质粒，活化对照更适合过表达/活化质粒。为了评估通过注射和电穿孔操纵胎盘引起的活力变化，在E14.5上分析了垫料中的胚胎存活率（

讨论

胎盘是胎儿生长的主要调节因子，如前所述，胎盘基因表达或功能的变化可能会显着影响胎儿发育6。这里概述的方案可用于使用相对先进的手术方法对小鼠胎盘进行靶向体内CRISPR操作。该技术允许大量可存活的胚胎及其相应的胎盘，可用于进一步研究（图6A，B）。这项技术使我们能够成功地在E14.5上过表达胎盘IGF-1（

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

作者承认以下资金来源:R01 MH122435，NIH T32GM008629和NIH T32GM145441。作者感谢Val Sheffield博士和Calvin Carter博士在爱荷华大学的实验室使用他们的手术室和设备，以及Eric Van Otterloo博士，Nandakumar Narayanan博士和Matthew Weber博士在显微镜方面的帮助。作者还感谢Sara Maurer博士，Maya Evans和Sreelekha Kundu对试点手术的帮助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml TubesUSA Scientific Inc1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBSThermo Fisher ScientificJ61899.AP
96 Well plateCornings3598For BCA kit
Absorbent UnderpadsFisher Scientific14-206-62
Activation Control PlasmidSanta Cruz Biotechnologysc-437275Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse TranscriptaseNew England BiolabsM0277LUse for cDNA synthesis
Anesthetic Gas VaporizorVetamacVAD-601TTVAD-compact vaporizer
Artifical Tear GelAkornNDC 59399-162-35
BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23227Protein quantification
BiovortexerBellco Glass, Inc.198050000Hand-held tissue homogenizer
CellSens SoftwareOlympusV4.1.1Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810EppendorfEP022628168Plate centrifuge
ChloroformThermo Fisher ScientificJ67241-APRNA isolation
Cotton Tipped ApplicatorsProAdvantage77100Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control PlasmidSanta Cruz Biotechnologysc-418922Dnase-free water provided for dilution
CryoStatLeicaCM1950
Dissection MicroscopeLeicaM125 CUsed for post-necroscopy imaging
Dissolvable SuturesMed Vet InternationalJ385H
Distilled WaterGibco15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Thermo fisher Scientific14190144(-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine)BTX Harvard Apparatus45-0662Generator only
Electric RazorWahlCL9990Kent Scientific
Electroporation paddles/TweezertrodesBTX Harvard Apparatus45-04873 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PKGrainger21RK94Placenta embedding cassettes
EthanolThermo Fisher Scientific268280010
F-Air CanistersPenn Veterinary Supply IncBIC80120Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCFSigmaF7252-5GDissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader)Fisher Scientific14377576Can be used for BCA and ELISA
ForcepsVWR82027-386Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10%Sigma AldrichHT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette)Sutter InstrumentB150-86-10O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x)Thermo Scientific1861281Protein homogenization buffer
Heating PadThermotechS766DDigitial Moist Heating Pad
HemostatsVWR10806-188Fully surrated jaw; curved
Hot Water BathFisher Scientific20253Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1)Santa Cruz Biotechnologysc-421056-ACTDnase-free water provided for dilution
Induction ChamberVetamac941443No specific liter size required
IsofluranePiramal Pharma LimitedNDC 66794-013-25
Isoproponal/2-ProponalFisher ScientificA451-4RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/mlAkornNDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum ChlorideSigma Aldrich63069-100ML1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with BarcodeFisher Scientific4309849Barcoded plates not required
Microcapillary TipEppendorf5196082001Attached to BTX Microinjector
MicroinjectorBTX Harvard Apparatus45-0766Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine)BTX Harvard Apparatus45-0751MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97Sutter InstrumentP-97Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker)scilogex822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA KitR & D SystemsMG100
NeedlesBD - Becton, Dickson, and Company30510630 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen TankLinde7727-37-9Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID)Norbrook Laboratories LimitedNDC 55529-040-10Analesgic such as Meloxicam
Nose ConeVetamac9216099-14 mm
Opal 620 detection dyeAkoya BiosciencesSKU FP1495001KTUsed for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) CompoundSakura4583
Oxygen TankLinde7782 - 44 - 7Medical grade oxygen
PestlesUSA Scientific Inc14155390
Povidone-Iodine Solution, 5%Avrio Health L.P.NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4367659Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers)New England BiolabsS1330SUse for cDNA synthesis
Razor BladeGrainger26X080
RNA Cleanup Kit & ConcentratorZymo ResearchR1013
RNALaterThermo Fisher ScientificAM7021
RNAscope kit v.2.5Advanced Cells Diagnostics323100Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2Advanced Cells Diagnostics 528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64Advanced Cells Diagnostics527421
Roto-Therm MiniBenchmarkR2020Dry oven for in situ hybridization
ScissorsVWR82027-578Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline)HospraNDC 0409-4888-03Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate]Research Product International03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher ChemicalFisher ScientificSS277Protein homogenization buffer
SteamerBellaB00DPX8UBA
Sterile Surgical DrapeBusse696Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60Leica3800160
SyringesBD - Becton, Dickson, and Company309659BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 FluorometerFisher Scientific13-400-525This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive3M1469SBVetBond
Tris HClThermo Fisher Scientific155680251M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ ReagentThermo Fisher Scientific15596018RNA isolation
TSA Buffer PackAdvanced Cells Diagnostics322810Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-CircuitVetamac40200Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence MicroscopeOlympusBX61VSUsed for FISH imaging
Vectorshield with DAPIVector LaboratoriesH-1200Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well BlockThermo Fisher Scientific4453536This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail ColorAmazonC450B
Xylazine 20mg/mlAnased343730_RX

参考文献

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. . Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

194 CRISPR 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。