JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем специфический по времени метод эффективного манипулирования критическими путями развития плаценты мыши in vivo. Это выполняется путем инъекции и электропорации плазмид CRISPR в плаценты беременных маток на эмбриональный день 12,5.

Аннотация

Плацента является важным органом, который регулирует и поддерживает развитие млекопитающих в утробе матери. Плацента отвечает за передачу питательных веществ и отходов между матерью и плодом, а также за выработку и доставку факторов роста и гормонов. Плацентарные генетические манипуляции у мышей имеют решающее значение для понимания специфической роли плаценты во внутриутробном развитии. Плацентарно-специфические трансгенные мыши, экспрессирующие Cre, имеют различную эффективность, и другие методы манипулирования плацентарными генами могут быть полезными альтернативами. В этой статье описывается метод прямого изменения экспрессии плацентарных генов с использованием манипуляций с генами CRISPR, который может быть использован для модификации экспрессии целевых генов. Используя относительно продвинутый хирургический подход, беременные матери подвергаются лапаротомии на эмбриональный день 12,5 (E12,5), и плазмида CRISPR доставляется стеклянной микропипеткой в отдельные плаценты. Плазмида сразу же подвергается электропорации после каждой инъекции. После восстановления матери плаценты и эмбрионы могут продолжать развитие до оценки в более поздний момент времени. Оценка состояния плаценты и потомства после использования этого метода может определить роль специфической во времени функции плаценты в развитии. Этот тип манипуляции позволит лучше понять, как генетика и функция плаценты влияют на рост и развитие плода в контексте множественных заболеваний.

Введение

Плацента является важным органом, участвующим в развитии плода. Основная роль плаценты заключается в обеспечении необходимых факторов и регулировании передачи питательных веществ и отходов плоду и от него. Плаценты млекопитающих состоят как из плодной, так и из материнской ткани, которые составляют интерфейс плода и матери, и, таким образом, генетика как матери, так и плода влияет на функцию1. Генетические аномалии или нарушение функции плаценты могут резко изменить развитие плода. Предыдущая работа показала, что генетика и развитие плаценты связаны с измененным развитием определенных систем органов у плода. В частности, аномалии в плаценте связаны с изменениями в мозге, сердце и сосудистой системе плода 2,3,4,5.

Транспорт гормонов, факторов роста и других молекул от плаценты к плоду играет важную роль в развитии плода6. Было показано, что изменение плацентарной продукции определенных молекул может изменить развитие нервной системы. Воспаление матери может увеличить выработку серотонина за счет изменения экспрессии метаболического гена триптофана (TRP) в плаценте, что впоследствии создает накопление серотонина в мозге плода7. Другие исследования обнаружили аномалии плаценты наряду с пороками сердца. Считается, что аномалии в плаценте способствуют врожденным порокам сердца, наиболее распространенному врожденному дефекту у людей8. Недавнее исследование выявило несколько генов, которые имеют сходные клеточные пути как в плаценте, так и в сердце. Если эти пути нарушены, они могут вызвать дефекты в обоих органах9. Дефекты плаценты могут усугубить врожденные пороки сердца. Роль генетики и функции плаценты в развитии специфической системы органов плода является новой областью исследований.

У мышей есть гемохориальная плацента и другие особенности плаценты человека, что делает их очень полезными моделями для изучения заболеваний человека1. Несмотря на важность плаценты, в настоящее время отсутствуют целенаправленные генетические манипуляции in vivo. Кроме того, в настоящее время существует больше вариантов нокаутов или нокдаунов, чем манипуляции с чрезмерной экспрессией или усилением функции в плаценте10. Существует несколько трансгенных линий, экспрессирующих Cre, для плацентарно-специфических манипуляций, каждая из которых находится в разных линиях трофобласта в разные моменты времени. К ним относятся Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER и Gcm1-Cre11,12,13,14. Хотя эти трансгены Cre эффективны, они могут быть не способны манипулировать некоторыми генами в определенные моменты времени. Другим широко используемым методом нокаута или сверхэкспрессии экспрессии плацентарных генов является встраивание лентивирусных векторов в культуру бластоцисты, что вызывает специфическую для трофобласта генетическую манипуляцию15,16. Этот метод позволяет добиться устойчивого изменения экспрессии плацентарных генов на ранних стадиях развития. Использование РНК-интерференции in vivo редко используется в плаценте. Вставка плазмид шРНК может быть выполнена аналогично методу CRIPSR, описанному в этой статье. Это было сделано на E13.5 для успешного снижения экспрессии PlGF в плаценте, что влияет на сосудистую сеть мозгапотомства 17.

В дополнение к методам, которые в основном используются для нокаута или нокдауна, индуцирование сверхэкспрессии обычно выполняется с помощью аденовирусов или введения экзогенного белка. Методы, используемые для сверхэкспрессии, имеют разную степень успеха и в основном выполняются на более поздних сроках беременности. Для изучения роли инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) в функции плаценты был проведен аденовирально-опосредованный перенос плацентарного гена для индуцирования сверхэкспрессии гена IGF-1 18,19. Это было выполнено на поздних сроках беременности мыши на E18.5 с помощью прямой плацентарной инъекции. Чтобы предоставить дополнительные возможности и обойти возможные неудачи установленных плацентарных генетических манипуляций, таких как сбои комбинации Cre-Lox, возможная токсичность аденовирусов и нецелевые эффекты шРНК, можно использовать прямые манипуляции CRISPR с плацентой in vivo 20,21,22. Эта модель была разработана для решения проблемы отсутствия моделей сверхэкспрессии и создания модели с гибкостью.

Этот метод основан на работе Lecuyer et al., в которой плазмиды shRNA и CRISPR были нацелены непосредственно in vivo на плаценты мыши для изменения экспрессии PlGF 17. Этот метод может быть использован для непосредственного изменения экспрессии плацентарных генов с использованием манипуляций CRISPR в несколько моментов времени; для этой работы был выбран Е12.5. Плацента к этому моменту созрела и достаточно велика, чтобы ею можно было манипулировать, что позволяет вставлять специфическую плазмиду CRISPR на E12.5, что может оказать значительное влияние на развитие плода от середины до конца беременности23,24. В отличие от трансгенных подходов, но подобно вирусной индукции или РНК-интерференции, этот метод допускает сверхэкспрессию или нокаут в определенные моменты времени с использованием относительно продвинутого хирургического подхода, что позволяет избежать возможного нарушения плацентации или эмбриональной летальности из-за более ранних изменений. Поскольку только несколько плацент получают экспериментальную или контрольную плазмиду в помете, подход допускает два типа внутреннего контроля. Этими контрольными элементами являются те, которые вводят и электропорируют соответствующую контрольную плазмиду, и те, которые не подвергаются прямым манипуляциям. Этот метод был оптимизирован для создания сверхэкспрессии гена IGF-1 в плаценте мыши с помощью плазмиды CRISPR синергетического медиатора активации (SAM). Был выбран ген IGF-1, так как IGF-1 является важным гормоном роста, доставляемым плоду, который в основном вырабатывается в плаценте до рождения25,26. Этот новый метод CRISPR, нацеленный на плаценту, позволит проводить прямые манипуляции, чтобы помочь определить связь между функцией плаценты и развитием плода.

протокол

Все процедуры были выполнены в соответствии с федеральными правилами и политикой Университета Айовы и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию.

1. Животные и животноводство

  1. Держите животных в 12-часовом световом дневном цикле с едой и водой ad libitum.
  2. Используйте CD-1 самок мышей в возрасте 8-15 недель. Используйте наличие копулятивной пробки для идентификации Е0,5.
  3. На Е0,5 поодиночке размещают беременные плотины.

2. Калибровка микропипетки

ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка микропипетки должна быть выполнена перед операцией, когда это возможно.

  1. Перед изготовлением и калибровкой микропипетки разбавьте все плазмиды до рекомендуемой концентрации (0,1 мкг/мкл) в воде, не содержащей ДНКазы. Смешайте плазмиду с соответствующим образом разбавленным красителем Fast Green (1 мкг/мкл в PBS) (конечная концентрация плазмиды: 0,06 мкг/мкл).
  2. Вытягивайте микропипетки с помощью стеклянных капилляров диаметром 10 см с наружным диаметром 1,5 мм и внутренним диаметром 0,86 мм с помощью съемника микропипеток.
  3. Аккуратно отломите кончик микропипетки (2-3 мм) стерильными щипцами.
  4. Загрузите микропипетку в микрокапиллярный наконечник, прикрепленный к микроинжектору. Убедитесь, что микроинжектор подключен к машине для микроинъекций и что уровень азота достаточен для калибровки микропипетки.
  5. После того, как микропипетка прикреплена к микроинжектору, загрузите в нее раствор красителя Fast Green для выполнения калибровки (1 мкг/мкл в PBS). Откалибруйте микропипетку для введения объема примерно 3,5 мкл. Опорожните («очистите») микропипетку, готовясь к загрузке плазмидных растворов, как показано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая микропипетка будет немного отличаться. Чтобы избежать повреждения плаценты во время инъекции, время инъекции следует установить в пределах 0,5-1,5 с. Давление должно быть установлено в пределах 1-8,5 фунтов на квадратный дюйм. Откалибруйте каждую микропипетку отдельно; Если микропипетка не может быть откалибрована в рамках этих параметров, то ее не следует использовать.

3. Хирургия (рис. 1А)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки очистите поверхности как подготовительной, так и хирургической областей 70% этанолом. Поместите впитывающую подкладку в зону подготовки. В области хирургии положите грелку вниз, а затем положите поверх нее впитывающую подкладку. Стерилизуйте все инструменты перед операцией. Время нахождения плотины под наркозом должно составлять менее 1 часа.

  1. Обезболивание
    1. Введите 5 мг / кг НПВП (мелоксикама) или другого одобренного анальгетика беременной женщине за 30 минут до 1 часа до операции.
    2. Поместите беременную мать в индукционную камеру, прикрепленную к испарителю изофлурана.
    3. Установите испаритель на 4% изофлурана и 3,5 л/мин кислорода.
    4. После того, как анестезия будет подтверждена отсутствием реакции на защемление пальца ноги и снижением частоты дыхания, удалите плотину из индукционной камеры в область подготовки.
  2. Подготовка к операции
    1. В зоне подготовки поместите плотину на спину с носовым конусом.
    2. Уменьшите содержание испарителя до 2% изофлурана и 3,5 л/мин кислорода, пока плотина находится в носовом обтекателе.
    3. Тщательно побрейте брюшко плотины и удалите лишнюю шерсть. Поочередно покрывайте бритый живот раствором повидона и 70% этанола три раза, используя стерильные аппликаторы с ватными наконечниками. Нанесите последний слой раствора повидона. Чтобы предотвратить высыхание роговицы, нанесите искусственный слезный гель на оба глаза плотины (рис. 2A, B).
    4. После подготовки переместите плотину с носовым конусом в назначенную операционную зону.
  3. Лапаротомия матки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильные перчатки на протяжении всей хирургической процедуры. Смените перчатки при контакте с какой-либо нестерильной поверхностью.
    1. В области хирургии поместите лежачий лежа на спине и закрепите носовой конус на месте с помощью ленты. Установите грелку под впитывающей прокладкой на 45 °C.
    2. С помощью щипцов и ножниц сделайте разрез кожи примерно на 2 см по средней линии. Используйте щипцы, чтобы наложить палатку на кожу, и сделайте вертикальный разрез на коже. После этого сделайте еще один разрез аналогичного размера через брюшину, чтобы обнажить рога матки. Используя щипцы, заткните брюшину, делая вертикальный разрез (рис. 2C, D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неспособность правильно наложить палатку при разрезе брюшины может привести к смертельному разрезу кишечника.
    3. Аккуратно помассируйте рога матки через разрез, надавливая по бокам живота. Делайте это, осторожно направляя матку без инструментов, используя только пальцы, чтобы избежать случайной травмы. Поместите обнаженную матку поверх стерильной хирургической простыни, закрывающей брюшную полость матери, и держите ее влажной на протяжении всей операции с помощью капель стерильного физиологического раствора, который можно нагреть до 30 ° C перед использованием по мере необходимости (рис. 2E, F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рога матки могут быть идентифицированы, как описано в Wang et al.27.
    4. После того, как матка обнажена, выберите три пары плацент для манипуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плаценты могут быть идентифицированы, как описано Elmore et al.24. Для максимальной приживаемости эмбрионов следует обрабатывать не более 6 плацент. Если присутствует менее 12 эмбрионов, следует вводить не более 4 плацент. Выберите две соседние плаценты так, чтобы одна получила контрольную инъекцию, а другая — экспериментальную плазмиду. Использование двух соседних плацент позволяет лучше сравнивать плаценты в аналогичных местах матки, а также обеспечивает повышенную выживаемость. Выбранные плацентарные пары выбираются случайным образом и располагаются по обоим рогам матки (рис. 1B).
    5. Запишите расположение плацентарных манипуляций и организацию эмбрионов в рогах матки, чтобы эмбрионы и плаценты можно было идентифицировать во время сбора, так как одна мать будет нести как контрольные, так и экспериментально обработанные плаценты/эмбрионы.
  4. Плацентарная инъекция и электропорация контрольной плазмиды
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания асептической техники перед использованием стерилизуйте электропорационные лопасти и микроинжектор холодным стерилизующим средством. Смените перчатки при контакте с какой-либо нестерильной поверхностью.
    1. Используя калиброванную микропипетку, загрузите достаточное количество соответствующей контрольной плазмиды для трех инъекций. Выполните все инъекции на глубине ~0,5 мм латерально в плаценту между децидуа (белая) и соединительной зоной (темно-красная) (рис. 3A-F).
    2. Выполняют инъекции в три контрольные плаценты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все контрольные инъекции плазмиды перед экспериментальными инъекциями, чтобы избежать перекрестного загрязнения плазмид микропипеткой. Это позволит использовать одну и ту же микропипетку, так как смена микропипеток и время калибровки резко увеличивают время операции и снижают выживаемость матери.
    3. Проведите электропорацию контрольной плазмиды плаценты в течение 2 мин после инъекции.
    4. Для электропорации используйте пару лопастей диаметром 3 мм, прикрепленных к электропорационной машине. Чтобы обеспечить эффективность включения CRISPR и жизнеспособность эмбрионов, используйте следующие настройки электропорации: 2 импульса, 30 В, импульс 30 мс, импульс 970 мс выключен, униполярный.
    5. После инъекции, но непосредственно перед электропорацией, покройте места контакта стерильным физиологическим раствором, нанося физиологический раствор точно на три участка на стенке матки и лопатки с помощью капельницы или шприца.
    6. Аккуратно надавите на лопатки электропорации на боковых сторонах плаценты. Поместите лопасть анода над местом впрыска и катодом прямо напротив (рис. 4A-C).
    7. Нажмите на импульс на электропорационной машине и дождитесь завершения двух импульсов, прежде чем снимать электропорационные лепестки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое количество белой пены часто наблюдается между лопатками и плацентой во время импульсов. Если этого не произошло, перед дальнейшим использованием проверьте напряжение на лопастях вольтметром. Если показания вольтметра не совпадают с настройкой напряжения электропорации, лопасти не работают.
  5. Плацентарная инъекция и электропорация экспериментальной плазмиды
    1. Следуйте тем же инструкциям, что и на шаге 3.4.1. к этапу 3.4.2. использование экспериментальной плазмиды вместо контрольной плазмиды.
    2. Проведите электропорацию всех трех экспериментальных инъецированных плацент в течение 2 минут после инъекции. Это следует выполнять так же, как и для тех, кому вводят контрольные плазмиды. Выполните шаг 3.4.4. к этапу 3.4.7.
  6. Завершение операции
    1. После завершения манипуляций с плацентой аккуратно помассируйте рога матки обратно внутрь брюшной полости, используя только пальцы (рис. 5А).
    2. Во-первых, выполните двойные одиночные швы на брюшинном слое, используя рассасывающиеся швы с покрытием и плетеными рассасывающимися швами длиной 45 см игольчатым сплавом 13 мм 3/8c. Разместите швы на расстоянии 2-3 мм друг от друга (рис. 5B).
    3. После наложения швов на слой брюшины наложите швы на кожу рассасывающимися швами. Тройной узел одинарных швов на расстоянии 2-3 мм друг от друга, чтобы гарантировать, что плотина не сможет расстегнуть шов (рис. 5C).
    4. После завершения наложения швов установите изофлуран на 1%, а кислород на 3,5 л / мин и нанесите тканевый клей на швы на коже (рис. 5D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тканевый клей не является обязательным, но рекомендуется для предотвращения повторного открытия разреза из-за жевания плотины.
    5. Когда тканевый клей высохнет, выключите испаритель и удалите плотину из области операции. Поместите плотину в поддерживающую клетку на спине.

4. Послеоперационный уход и наблюдение

  1. Дайте беременной матери восстановиться в чистой клетке под наблюдением в течение как минимум 30 минут, чтобы избежать немедленных осложнений операции. Наблюдайте до тех пор, пока он не станет полностью амбулаторным и не сможет перевернуться на ноги без посторонней помощи. Одиночный дом плотины после операции.
  2. Следите за послеоперационным уходом и наблюдением в учреждении до сбора эмбрионов. Записывайте вес плотины и ежедневно контролируйте швы и место разреза.

5. Сбор плаценты E14.5

  1. На E14.5 глубоко обезболите плотину коктейлем кетамин/ксилазин (1 мг/мл кетамина и 0,1 мг/мл ксилазина), а затем цервикально вывихните плотину.
  2. Сделайте ножницами V-образный надрез в брюшной полости плотины, а матку извлеките. Сразу же выложите на 5-сантиметровую чашку Петри со льдом. С помощью щипцов аккуратно извлеките эмбрион и соответствующую плаценту из матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ведите учет расположения эмбриона и соответствующей плаценты в рогах матки, чтобы определить, какая из них подверглась непосредственной манипуляции во время операции.
  3. Запишите вес плаценты. Используя щипцы и бритвы без РНК, разрежьте плаценту пополам по средней линии. Положите одну половину в 4% PFA при 4 ° C. Разрежьте оставшуюся половину пополам и храните оставшиеся две четверти при температуре -80 ° C в двух пробирках, одна из которых содержит реагент для хранения РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы и другие материнские ткани можно хранить из коллекции при температуре -80 °C для использования в будущем.

6. Анализ экспрессии плацентарных генов

  1. Используйте четверть плаценты, хранящуюся при -80 ° C в реагенте для хранения РНК.
  2. Обработайте плаценты для кПЦР, как описано в Elser et al., используя метод Trizol для выделения РНК, спектрофотометр для определения концентрации РНК, набор для синтеза кДНК и кПЦР с помощью SYBR Green Master Mix28. Вместо набора ДНК Turbo DNAfree, упомянутого в Elser et al., используйте набор RNAcleanup после выделения РНК Trizol, чтобы убедиться, что образцы не содержат загрязняющих веществ28.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прочтите паспорт безопасности материала (MSDS) для тризола и используйте его в химическом вытяжном шкафу.
  3. Оцените плазмидную вставку контрольной плазмиды с праймерами GFP и экспериментальной плазмиды с праймерами BLAST (праймеры перечислены в дополнительной таблице 1). Используйте значение КТ, чтобы определить наличие плазмиды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения КТ выше 35 являются ложноположительными, и только те, которые ниже 35, следует считать положительным показателем того, что плазмида была успешно вставлена.
  4. Оцените экспрессию плаценты IGF-1 , нормализованную к гену 18 домашнего хозяйства (праймеры перечислены в дополнительной таблице 1). Используйте метод ddCT для расчета изменения сгиба, а затем рассчитайте нормализованное изменение сгиба экспериментальных образцов на среднее изменение сгиба контрольных образцов.

7. Анализ уровня плацентарного белка

  1. Используйте четверть плаценты, которая хранилась при -80 ° C. Гомогенизируют ткань в буферном растворе, состоящем из 11,5 мМ Tris HCl, 5 мМMgCl2 и 10 мМ ингибитора протеазы в diH2O с конечным рН 7,4. Используйте ручной гомогенизатор и пестик, чтобы разбить ткань.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец не должен превышать 10% от объема буфера.
  2. Разбавьте гомогенизированные образцы в буфере в соотношении 1:12 так, чтобы они находились в пределах обнаруживаемого диапазона набора для анализа бицинхониновой кислоты (BCA). Выполните анализ BCA в соответствии с инструкциями производителя и количественно определите общий белок с помощью планшетного считывателя.
  3. После проведения анализа BCA нормализуйте все образцы до одинаковой концентрации общего белка 2 мг / мл для ИФА IGF-1, как это было сделано в Gumusoglu et al.29.
  4. Выполните ИФА ИФР-1 в соответствии с инструкциями производителя и количественно определите уровни белка ИФР-1 с помощью считывателя планшетов, используя стандартную кривую концентрации.

8. Пространственная верификация CRIPSR с использованием флуоресцентной гибридизационной маркировки in situ

  1. После того, как половинки плаценты будут надлежащим образом зафиксированы в 4% PFA при 4 ° C в течение 1-3 дней, переместите их в 20% сахарозу при 4 ° C, прежде чем заморозить их в смеси с оптимальной температурой резки (OCT).
  2. Последовательно разделите плаценту, встроенную в ОКТ, в криостате -20 °C на срезы по 10 мкм и поместите их на предметные стекла для маркировки. Разделите плаценту пополам так, чтобы были видны все три субрегиона. Храните предметные стекла при температуре -80 °C до использования для гибридизации in situ .
  3. Выполняйте маркировку флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) в соответствии с протоколами производителя. Гибридизуйте один слайд с зондом dCas9-3xNLS-VP64 и второй «сестринский» слайд той же плаценты с зондом Prl8a8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зонд dCas9-3xNLS-VP64 обнаруживает присутствие плазмиды сверхэкспрессии. Зонд Prl8a8 выделяет спонгиотрофобласты соединительной зоны, что позволяет идентифицировать субрегионы плаценты. Эти два зонда помечены на отдельных «сестринских» предметных стеклах, чтобы избежать интерференции многоканальной флуоресценции с зеленой автофлуоресценцией в плацентах.
  4. Пометьте оба зонда детектирующим красителем (Opal 620). После выполнения протокола производителя для FISH нанесите монтажную среду DAPI и поместите покровное стекло на предметное стекло. Запечатайте покровное стекло прозрачным лаком для ногтей.
  5. Изобразите слайды на вертикальном составном флуоресцентном микроскопе и обработайте их с помощью соответствующего программного обеспечения для обработки изображений. Здесь использовалось программное обеспечение CellSens.

Результаты

Общие результаты процедуры (рис. 6)
В исследовании было три манипулируемые группы. К ним относятся плаценты, которым вводили общую контрольную плазмиду CRISPR Cas9 (Cas9 Control), контрольную плазмиду CRISPR активации (Act Control) или активационную плазмиду IGF-1 SAM (Ig...

Обсуждение

Плацента является основным регулятором роста плода, и, как отмечалось ранее, изменения в экспрессии или функции плацентарных генов могут существенно повлиять на развитие плода6. Протокол, изложенный здесь, может быть использован для выполнения целенаправленных манипуляц?...

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Авторы признают следующие источники финансирования: R01 MH122435, NIH T32GM008629 и NIH T32GM145441. Авторы благодарят лаборатории доктора Вэла Шеффилда и доктора Кельвина Картера в Университете Айовы за использование их операционной комнаты и оборудования, а также доктора Эрика Ван Оттерлоо, доктора Нандакумара Нараянана и доктора Мэтью Вебера за их помощь в микроскопии. Авторы также благодарят доктора Сару Маурер, Майю Эванс и Шрилеху Кунду за их помощь в проведении пилотных операций.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml TubesUSA Scientific Inc1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBSThermo Fisher ScientificJ61899.AP
96 Well plateCornings3598For BCA kit
Absorbent UnderpadsFisher Scientific14-206-62
Activation Control PlasmidSanta Cruz Biotechnologysc-437275Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse TranscriptaseNew England BiolabsM0277LUse for cDNA synthesis
Anesthetic Gas VaporizorVetamacVAD-601TTVAD-compact vaporizer
Artifical Tear GelAkornNDC 59399-162-35
BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23227Protein quantification
BiovortexerBellco Glass, Inc.198050000Hand-held tissue homogenizer
CellSens SoftwareOlympusV4.1.1Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810EppendorfEP022628168Plate centrifuge
ChloroformThermo Fisher ScientificJ67241-APRNA isolation
Cotton Tipped ApplicatorsProAdvantage77100Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control PlasmidSanta Cruz Biotechnologysc-418922Dnase-free water provided for dilution
CryoStatLeicaCM1950
Dissection MicroscopeLeicaM125 CUsed for post-necroscopy imaging
Dissolvable SuturesMed Vet InternationalJ385H
Distilled WaterGibco15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Thermo fisher Scientific14190144(-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine)BTX Harvard Apparatus45-0662Generator only
Electric RazorWahlCL9990Kent Scientific
Electroporation paddles/TweezertrodesBTX Harvard Apparatus45-04873 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PKGrainger21RK94Placenta embedding cassettes
EthanolThermo Fisher Scientific268280010
F-Air CanistersPenn Veterinary Supply IncBIC80120Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCFSigmaF7252-5GDissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader)Fisher Scientific14377576Can be used for BCA and ELISA
ForcepsVWR82027-386Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10%Sigma AldrichHT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette)Sutter InstrumentB150-86-10O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x)Thermo Scientific1861281Protein homogenization buffer
Heating PadThermotechS766DDigitial Moist Heating Pad
HemostatsVWR10806-188Fully surrated jaw; curved
Hot Water BathFisher Scientific20253Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1)Santa Cruz Biotechnologysc-421056-ACTDnase-free water provided for dilution
Induction ChamberVetamac941443No specific liter size required
IsofluranePiramal Pharma LimitedNDC 66794-013-25
Isoproponal/2-ProponalFisher ScientificA451-4RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/mlAkornNDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum ChlorideSigma Aldrich63069-100ML1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with BarcodeFisher Scientific4309849Barcoded plates not required
Microcapillary TipEppendorf5196082001Attached to BTX Microinjector
MicroinjectorBTX Harvard Apparatus45-0766Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine)BTX Harvard Apparatus45-0751MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97Sutter InstrumentP-97Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker)scilogex822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA KitR & D SystemsMG100
NeedlesBD - Becton, Dickson, and Company30510630 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen TankLinde7727-37-9Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID)Norbrook Laboratories LimitedNDC 55529-040-10Analesgic such as Meloxicam
Nose ConeVetamac9216099-14 mm
Opal 620 detection dyeAkoya BiosciencesSKU FP1495001KTUsed for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) CompoundSakura4583
Oxygen TankLinde7782 - 44 - 7Medical grade oxygen
PestlesUSA Scientific Inc14155390
Povidone-Iodine Solution, 5%Avrio Health L.P.NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4367659Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers)New England BiolabsS1330SUse for cDNA synthesis
Razor BladeGrainger26X080
RNA Cleanup Kit & ConcentratorZymo ResearchR1013
RNALaterThermo Fisher ScientificAM7021
RNAscope kit v.2.5Advanced Cells Diagnostics323100Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2Advanced Cells Diagnostics 528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64Advanced Cells Diagnostics527421
Roto-Therm MiniBenchmarkR2020Dry oven for in situ hybridization
ScissorsVWR82027-578Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline)HospraNDC 0409-4888-03Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate]Research Product International03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher ChemicalFisher ScientificSS277Protein homogenization buffer
SteamerBellaB00DPX8UBA
Sterile Surgical DrapeBusse696Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60Leica3800160
SyringesBD - Becton, Dickson, and Company309659BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 FluorometerFisher Scientific13-400-525This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive3M1469SBVetBond
Tris HClThermo Fisher Scientific155680251M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ ReagentThermo Fisher Scientific15596018RNA isolation
TSA Buffer PackAdvanced Cells Diagnostics322810Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-CircuitVetamac40200Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence MicroscopeOlympusBX61VSUsed for FISH imaging
Vectorshield with DAPIVector LaboratoriesH-1200Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well BlockThermo Fisher Scientific4453536This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail ColorAmazonC450B
Xylazine 20mg/mlAnased343730_RX

Ссылки

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. . Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

194CRISPR1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены