JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מתארים שיטה ספציפית לזמן כדי לתפעל ביעילות מסלולים התפתחותיים קריטיים בשליית העכבר in vivo. זה מבוצע באמצעות הזרקה ואלקטרופורציה של פלסמידים CRISPR לתוך השליות של סכרים בהריון ביום העוברי 12.5.

Abstract

השליה היא איבר חיוני המווסת ומשמר את התפתחות היונקים ברחם. השליה אחראית על העברת חומרי מזון ופסולת בין האם לעובר ועל ייצור ואספקה של גורמי גדילה והורמונים. מניפולציות גנטיות שליה בעכברים הן קריטיות להבנת התפקיד הספציפי של השליה בהתפתחות טרום לידתי. לעכברים טרנסגניים בעלי ביטוי Cre ספציפי לשליה יש יעילות משתנה, ושיטות אחרות למניפולציה של גנים שליה יכולות להיות חלופות שימושיות. מאמר זה מתאר טכניקה לשינוי ישיר של ביטוי גנים שליה באמצעות מניפולציה של גן CRISPR, אשר ניתן להשתמש בה כדי לשנות את הביטוי של גנים ממוקדים. באמצעות גישה כירורגית מתקדמת יחסית, סכרים בהריון עוברים לפרוטומיה ביום העוברי 12.5 (E12.5), ופלסמיד CRISPR מועבר על ידי מיקרופיפטה זכוכית לתוך השליה הבודדת. הפלסמיד מחושמל מיד לאחר כל הזרקה. לאחר התאוששות הסכר, השליות והעוברים יכולים להמשיך בהתפתחות עד להערכה בנקודת זמן מאוחרת יותר. הערכת השליה והצאצאים לאחר השימוש בטכניקה זו יכולה לקבוע את התפקיד של תפקוד השליה הספציפי לזמן בהתפתחות. סוג זה של מניפולציה יאפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו גנטיקה ותפקוד של שליה משפיעים על גדילת העובר והתפתחותו בהקשרים של מחלות מרובות.

Introduction

השליה היא איבר חיוני המעורב בהתפתחות העובר. תפקידה העיקרי של השליה הוא לספק גורמים חיוניים ולווסת את העברת החומרים המזינים והפסולת אל העובר וממנו. שליות יונקים מורכבות הן מרקמה עוברית והן מרקמה אימהית, המרכיבות את הממשק העוברי-אימהי, ולכן הגנטיקה של האם והעובר משפיעה על הפונקציה1. אנומליות גנטיות או תפקוד לקוי של השליה יכולים לשנות באופן דרסטי את התפתחות העובר. עבודות קודמות הראו כי גנטיקה והתפתחות שליה קשורות להתפתחות משתנה של מערכות איברים ספציפיות בעובר. בפרט, הפרעות בשליה קשורות לשינויים במוח, בלב ובמערכת כלי הדם של העובר 2,3,4,5.

העברת הורמונים, גורמי גדילה ומולקולות אחרות מהשליה לעובר ממלאת תפקיד מרכזי בהתפתחות העובר6. הוכח כי שינוי ייצור השליה של מולקולות ספציפיות יכול לשנות את ההתפתחות העצבית. דלקת אימהית יכולה להגביר את ייצור הסרוטונין על ידי שינוי ביטוי הגן המטבולי טריפטופן (TRP) בשליה, אשר לאחר מכן יוצר הצטברות של סרוטונין במוח העובר7. מחקרים אחרים מצאו מומים בשליה לצד מומי לב. הפרעות בשליה נחשבות כתורמות למומי לב מולדים, המום המולד, השכיח ביותר בבני אדם8. מחקר שנערך לאחרונה זיהה מספר גנים בעלי מסלולים תאיים דומים הן בשליה והן בלב. אם הם משובשים, מסלולים אלה עלולים לגרום לפגמים בשני האיברים9. המומים בשליה עלולים להחמיר מומי לב מולדים. תפקידה של גנטיקה של השליה ותפקודה על התפתחות מערכת איברים עוברית ספציפית הוא תחום מחקר מתפתח.

לעכברים יש שליות המוכריאליות ותכונות אחרות של שליות אנושיות, מה שהופך אותם למודלים שימושיים ביותר לחקר מחלות אנושיות1. למרות חשיבותה של השליה, חסרות כיום מניפולציות גנטיות ממוקדות in vivo. יתר על כן, יש כיום יותר אפשרויות זמינות עבור נוקאאוטים או נוק-דאונים מאשר ביטוי יתר או מניפולציות רווח של פונקציה בשליה10. ישנם מספר קווים טרנסגניים למניפולציה ספציפית לשליה, כל אחד בשושלות טרופובלסטים שונות בנקודות זמן שונות. אלה כוללים Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER ו- Gcm1-Cre 11,12,13,14. בעוד טרנסגנים Cre אלה יעילים, הם עשויים שלא להיות מסוגלים לתפעל גנים מסוימים בנקודות זמן ספציפיות. שיטה נפוצה נוספת לביטוי גנים של שליה היא החדרת וקטורים לנטי-ויראליים לתרבית בלסטוציסט, מה שגורם למניפולציה גנטית ספציפית לטרופובלסט15,16. טכניקה זו מאפשרת שינוי משמעותי בביטוי גן השליה בשלב מוקדם בהתפתחות. השימוש בהפרעות RNA in vivo נוצל בדלילות בשליה. החדרת פלסמידים shRNA יכולה להתבצע באופן דומה לטכניקת CRIPSR המתוארת במאמר זה. זה נעשה ב E13.5 כדי להפחית בהצלחה את ביטוי PlGF בשליה, עם השפעות על כלי הדם במוח של צאצאים17.

בנוסף לטכניקות המשמשות בעיקר לנוקאאוט או להדחה, גרימת ביטוי יתר מבוצעת בדרך כלל עם אדנווירוסים או החדרת חלבון אקסוגני. לטכניקות המשמשות לביטוי יתר יש שיעורי הצלחה משתנים והן בוצעו לרוב בשלב מאוחר יותר בהריון. כדי לחקור את תפקידו של גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF-1) בתפקוד השליה, בוצעה העברת גן שליה בתיווך אדנובירל כדי לגרום לביטוי יתר של הגן IGF-1 18,19. זה בוצע מאוחר בהריון עכבר על E18.5 באמצעות הזרקת שליה ישירה. כדי לספק אפשרויות נוספות ולעקוף כשלים אפשריים של מניפולציות גנטיות מבוססות של שליה, כגון כשלים משולבים של Cre-Lox, הרעילות האפשרית של אדנווירוסים, וההשפעות מחוץ למטרה של shRNA, ניתן להשתמש במניפולציה ישירה של CRISPR in vivo של השליה 20,21,22. מודל זה פותח כדי לתת מענה להיעדר מודלים של ביטוי יתר וליצור מודל עם גמישות.

טכניקה זו מבוססת על עבודתם של Lecuyer et al., שבה פלסמידים shRNA ו- CRISPR כוונו ישירות in vivo לשליות עכבר כדי לשנות ביטוי PlGF 17. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לשנות ישירות את ביטוי גני השליה באמצעות מניפולציה של CRISPR במספר נקודות זמן; עבור עבודה זו, E12.5 נבחר. השליה התבגרה בשלב זה והיא גדולה מספיק כדי לבצע מניפולציות, מה שמאפשר החדרת פלסמיד CRISPR ספציפי על E12.5, אשר יכול להשפיע באופן משמעותי על התפתחות העובר מאמצע עד סוף ההריון23,24. בניגוד לגישות טרנסגניות, אך בדומה להשראות נגיפיות או הפרעות RNA, טכניקה זו מאפשרת ביטוי יתר או נוקאאוט בנקודות זמן מסוימות באמצעות גישה כירורגית מתקדמת יחסית, ובכך מונעת שליה לקויה אפשרית או קטלניות עוברית משינויים מוקדמים יותר. מכיוון שרק שליות מעטות מקבלות את פלסמיד הניסוי או הבקרה בתוך המלטה, הגישה מאפשרת שני סוגים של בקרות פנימיות. בקרות אלה הן אלה המוזרקות ומתחשמלות עם פלסמיד הבקרה המתאים ואלה שאינן מקבלות מניפולציה ישירה. טכניקה זו הותאמה ליצירת ביטוי יתר של הגן IGF-1 בשליית העכבר באמצעות פלסמיד CRISPR מתווך הפעלה סינרגיסטי (SAM). הגן IGF-1 נבחר, שכן IGF-1 הוא הורמון גדילה חיוני המועבר לעובר ומיוצר בעיקר בשליה לפני הלידה25,26. טכניקת CRISPR חדשה ממוקדת שליה זו תאפשר מניפולציה ישירה שתסייע להגדיר את הקשר בין תפקוד השליה להתפתחות העובר.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם ובהתאם לתקנות הפדרליות ולמדיניות אוניברסיטת איווה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים.

1. בעלי חיים ובעלי חיים

  1. שמור על בעלי החיים במחזור אור יום של 12 שעות עם מזון ומים עד ליביטום.
  2. השתמש בעכברות CD-1 בגילאי 8-15 שבועות. השתמש בנוכחות של תקע כפייתי כדי לזהות E0.5.
  3. ב-E0.5 מאכלסים לבדו את הסכרים ההריוניים.

2. כיול המיקרופיפטה

הערה: יש לבצע את כיול המיקרופיפטה לפני הניתוח במידת האפשר.

  1. לפני ייצור וכיול המיקרופיפטה, יש לדלל את כל הפלסמידים לריכוז המומלץ (0.1 מק"ג/מיקרוליטר) במים נטולי DNase. מערבבים את הפלסמיד עם צבע ירוק מהיר מדולל כראוי (1 מיקרוגרם/מיקרוליטר ב-PBS) (ריכוז פלסמיד סופי: 0.06 מק"ג/מק"ל).
  2. משוך מיקרופיפטות באמצעות נימי זכוכית בקוטר 10 ס"מ בקוטר חיצוני של 1.5 מ"מ וקוטר פנימי של 0.86 מ"מ עם מושך מיקרופיפטה.
  3. בזהירות לשבור את קצה micropipette (2-3 מ"מ) עם מלקחיים סטריליים.
  4. לטעון את micropipette לתוך קצה microcapillary מחובר microinjector. ודא שהמיקרו-מזרק מחובר למכונת המיקרו-הזרקה ושיש רמות מספיקות של חנקן כדי לכייל את המיקרופיפטה.
  5. לאחר חיבור המיקרופיפטה למיקרו-מזרק, טען אותה בתמיסת הצבע הירוק המהיר כדי לבצע את הכיול (1 מיקרוגרם/μL ב-PBS). כיילו את המיקרופיפטה להזרקת נפח של כ-3.5 μL. רוקנו ("שקוף") את המיקרופיפטה כהכנה להעמסת תמיסות הפלסמיד כמפורט להלן.
    הערה: כל מיקרופיפטה תהיה שונה במקצת. כדי למנוע פגיעה בשליה במהלך ההזרקה, זמן ההזרקה צריך להיות מוגדר בין 0.5-1.5 שניות. הלחץ צריך להיות מוגדר בין 1-8.5 psi. כיול כל מיקרופיפטה בנפרד; אם micropipette לא ניתן לכייל בתוך פרמטרים אלה, אז זה לא צריך לשמש.

3. ניתוח (איור 1A)

הערה: כדי להכין, נקו את המשטחים הן של אזור ההכנה והן של אזור הניתוח עם אתנול 70%. הניחו תחתיכה סופגת באזור ההכנה. באזור הניתוח, הניחו כרית חימום כלפי מטה, ולאחר מכן הניחו כרית תחתונה סופגת מעליה. יש לעקר את כל הכלים לפני הניתוח. הזמן שהסכר נמצא תחת הרדמה צריך להיות מתחת לשעה.

  1. הרדמה
    1. יש לתת 5 מ"ג/ק"ג של NSAID (meloxicam) או משכך כאבים מאושר אחר לסכר ההריון 30 דקות עד שעה לפני הניתוח.
    2. הניחו את הסכר ההריוני בתא אינדוקציה המחובר לוופורייזר איזופלורן.
    3. כוונו את הוופורייזר ל-4% איזופלורן ו-3.5 ליטר/דקה חמצן.
    4. לאחר שההרדמה אושרה על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן וקצב נשימה מופחת, יש להסיר את הסכר מתא האינדוקציה לאזור ההכנה.
  2. הכנה לניתוח
    1. באזור ההכנה, מניחים את הסכר שכיבה עם חרוט האף.
    2. הפחיתו את הוופורייזר ל-2% איזופלורן ו-3.5 ליטר/דקה חמצן בזמן שהסכר נמצא בחרוט האף.
    3. לגלח היטב את בטן הסכר ולהסיר פרווה עודפת. ציפוי לסירוגין של הבטן המגולחת בתמיסת פובידון ואתנול 70% שלוש פעמים באמצעות אפליקטורים סטריליים מכותנה. החל את המעיל הסופי של תמיסת פובידון. כדי למנוע התייבשות של הקרנית, הניחו ג'ל דמעות מלאכותי על שתי העיניים של הסכר (איור 2A, B).
    4. לאחר ההכנה, העבירו את הסכר עם חרוט האף לאזור הניתוח המיועד.
  3. לפרוטומיה של הרחם
    הערה: יש להשתמש בכפפות סטריליות לאורך כל ההליך הכירורגי. החליפו את הכפפות אם נוצר מגע עם משטח לא סטרילי.
    1. באזור הניתוח, הניחו את עמוד השדרה של הסכר, והדקו את חרוט האף למקומו באמצעות נייר דבק. הניחו את כרית החימום מתחת לכרית הסופגת לטמפרטורה של 45°C.
    2. בעזרת מלקחיים ומספריים, לבצע חתך קו אמצע משוער 2 ס"מ דרך העור. השתמש במלקחיים כדי אוהל העור, ולעשות חתך אנכי לתוך העור. לאחר מכן, בצע חתך נוסף בגודל דומה דרך הצפק כדי לחשוף את קרני הרחם. בעזרת מלקחיים, מקמים את הצפק תוך כדי ביצוע החתך האנכי (איור 2C, D).
      הערה: אי ביצוע אוהל כראוי בעת חיתוך הצפק עלול להוביל לחתך קטלני של המעיים.
    3. לעסות בעדינות את קרני הרחם דרך החתך על ידי לחיצה על צידי הבטן. עשו זאת על ידי הנחיה זהירה של הרחם ללא כלים, תוך שימוש באצבעות בלבד כדי למנוע פגיעה בשוגג. הניחו את הרחם החשוף על גבי וילון כירורגי סטרילי המכסה את בטן הסכר ושמרו אותו לח לאורך כל הניתוח בעזרת טיפות מלח סטריליות, שניתן לחמם ל-30°C לפני השימוש לפי הצורך (איור 2E, F).
      הערה: ניתן לזהות את קרני הרחם כמתואר ב- Wang et al.27.
    4. לאחר שהרחם נחשף, בחר שלושה זוגות שליות למניפולציה.
      הערה: ניתן לזהות את השליות כפי שתוארו על ידי Elmore et al.24. כדי למקסם את הישרדות העוברים, לא יותר מ 6 שליות צריך להיות מטופל. אם קיימים פחות מ-12 עוברים, יש להזריק לא יותר מ-4 שליות. בחר שתי שליות סמוכות כך שאחת תקבל זריקת בקרה והשנייה תקבל את פלסמיד הניסוי. השימוש בשתי שליות סמוכות מאפשר השוואה טובה יותר של שליות במקומות דומים ברחם וגם מאפשר קצב הישרדות מוגבר. זוגות השליות שנבחרו נבחרים באופן אקראי ומרווחים לאורך שתי קרני הרחם (איור 1B).
    5. רשום את מיקום מניפולציות השליה וארגון העוברים בתוך קרני הרחם, כך שניתן יהיה לזהות את העוברים והשליות במהלך האיסוף, שכן סכר אחד יישא הן שליות/עוברים שטופלו בניסוי.
  4. הזרקת שליה ואלקטרופורציה של פלסמיד הבקרה
    הערה: כדי לשמור על טכניקה אספטית, יש לעקר את משוטי האלקטרופורציה ואת המיקרו-מזרק בחומר מעקר קר לפני השימוש. החליפו כפפות אם נוצר מגע עם משטח לא סטרילי.
    1. באמצעות מיקרופיפטה מכוילת, לטעון כמות מספקת של פלסמיד הבקרה המתאים עבור שלוש זריקות. בצעו את כל ההזרקות בעומק של ~0.5 מ"מ לרוחב לתוך השליה בין אזור הדסידואה (לבן) לאזור הצומת (אדום כהה) (איור 3A-F).
    2. לבצע זריקות בשלוש שליות הביקורת.
      הערה: בצע את כל זריקות פלסמיד הבקרה לפני זריקות הניסוי כדי למנוע זיהום צולב של הפלסמידים עם המיקרופיפטה. זה יאפשר להשתמש באותה מיקרופיפטה, שכן שינוי מיקרופיפטות וזמן כיול מגדיל באופן דרסטי את זמן הניתוח ומקטין את הישרדות הסכר.
    3. בצע אלקטרופורציה של שליות הבקרה המוזרקות בפלסמיד תוך 2 דקות מההזרקה.
    4. עבור אלקטרופורציה, השתמש בזוג משוטים 3 מ"מ המחוברים למכונת אלקטרופורציה. כדי להבטיח יעילות שילוב CRISPR ואת הכדאיות של עוברים, השתמש בהגדרות האלקטרופורציה הבאות: 2 פולסים, 30 V, 30 ms פולס, 970 ms פולס כבוי, חד קוטבי.
    5. לאחר ההזרקה אך מיד לפני ההתחשמלות יש לצפות את מקומות המגע במי מלח סטריליים, ולמרוח את המלח בדיוק על שלושת האתרים בדופן הרחם והמשוטים בטפטפת או מזרק.
    6. לחץ בעדינות על משוטי האלקטרופורציה בצדדים הרוחביים של השליה. הניחו את משוט האנודה מעל אתר ההזרקה ואת הקתודה ישירות ממול (איור 4A-C).
    7. לחץ על הפולס במכשיר האלקטרופורציה, והמתן עד ששתי הפולסים יסתיימו לפני הסרת משוטי האלקטרופורציה.
      הערה: כמות קטנה של קצף לבן נראית לעתים קרובות בין המשוטים לשליה במהלך פולסים. אם זה לא קורה, בדוק את המתח מהמשוטים עם מד מתח לפני שימוש נוסף. אם הקריאה במד המתח אינה תואמת את הגדרת מתח האלקטרופורציה, המשוטים אינם פונקציונליים.
  5. הזרקת שליה ואלקטרופורציה של פלסמיד ניסיוני
    1. בצע את אותן הוראות משלב 3.4.1. לשלב 3.4.2. שימוש בפלסמיד ניסיוני במקום פלסמיד הבקרה.
    2. בצע אלקטרופורציה של כל שלוש השליות המוזרקות הניסיוניות תוך 2 דקות מההזרקה. זה צריך להתבצע באותו אופן כמו עבור אלה מוזרקים עם פלסמידים בקרה. בצע את שלב 3.4.4. לשלב 3.4.7.
  6. סיום הניתוח
    1. לאחר השלמת מניפולציית השליה, עסו בעדינות את קרני הרחם בחזרה לתוך חלל הבטן באמצעות אצבעות בלבד (איור 5A).
    2. ראשית, בצע תפרים בודדים בעלי קשר כפול על שכבת הצפק באמצעות תפרים מצופים וקלועים הניתנים להמסת מסה באורך 45 ס"מ עם סגסוגת מחט 3/8c 13 מ"מ. רווח את התפרים במרחק של 2-3 מ"מ זה מזה (איור 5B).
    3. לאחר תפירת שכבת הצפק, תפרו את העור בתפרים נמסים. קשר משולש התפרים הבודדים במרחק של 2-3 מ"מ זה מזה כדי להבטיח שהסכר לא יוכל לבטל את התפר (איור 5C).
    4. לאחר השלמת התפירה, כוונו את האיזופלורן ל-1% ואת החמצן ל-3.5 ליטר/דקה, ומרחו דבק רקמות על התפרים שעל העור (איור 5D).
      הערה: דבק רקמות הוא אופציונלי אך מומלץ למנוע פתיחה מחדש של החתך עקב לעיסת סכר.
    5. כאשר דבק הרקמה התייבש, כבו את מכשיר האידוי והוציאו את הסכר מאזור הניתוח. הניחו את הסכר בכלוב תומך על גבו.

4. טיפול ומעקב לאחר הניתוח

  1. לאפשר לסכר ההרה להתאושש בכלוב נקי תחת השגחה למשך 30 דקות לפחות כדי להבטיח שלא יהיו סיבוכים מיידיים של הניתוח. התבונן עד שהוא אמבולטורי לחלוטין ויכול להתהפך על רגליו ללא סיוע. לשכן את הסכר לאחר הניתוח.
  2. יש לעקוב אחר הטיפול והמעקב המוסדיים שלאחר הניתוח עד לאיסוף העוברים. רשום את משקל הסכר, ועקוב אחר התפרים ואתר החתך מדי יום.

5. איסוף שליה E14.5

  1. ב-E14.5, יש להרדים עמוקות את הסכר עם קוקטייל קטמין/קסילזין (1 מ"ג/מ"ל קטמין ו-0.1 מ"ג/מ"ל קסילזין), ולאחר מכן לנקוע את הסכר בצוואר הרחם.
  2. בצע חתך בצורת V לתוך הבטן של הסכר עם מספריים, ולהסיר את הרחם. מניחים מיד על צלחת פטרי בקוטר 5 ס"מ על קרח. באמצעות מלקחיים, בזהירות להסיר את העובר ואת השליה המתאימה מן הרחם.
    הערה: שמור תיעוד של מיקום העובר והשליה המתאימה בקרני הרחם כדי לקבוע מי קיבל את המניפולציה הישירה במהלך הניתוח.
  3. רשום את משקלי השליה. באמצעות מלקחיים וסכיני גילוח נטולי RNAse, חתכו את השליה לשניים לאורך קו האמצע. הכניסו מחצית אחת ל-4% PFA בטמפרטורה של 4°C. חתכו שוב את החצי הנותר לשניים, ואחסנו את שני הרבעונים הנותרים בטמפרטורה של 80°C בשני צינורות, אחד עם מגיב אחסון RNA.
    הערה: ניתן לאחסן עוברים ורקמות אימהיות אחרות מהאוסף בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי.

6. ניתוח ביטוי גנים שליה

  1. השתמש ברבע השליה המאוחסנת ב -80 מעלות צלזיוס בריאגנט אחסון RNA.
  2. עבד את השליות עבור qPCR כמתואר ב- Elser et al. באמצעות שיטת Trizol לבידוד RNA, ספקטרופוטומטר לריכוז RNA, ערכת סינתזת cDNA ו- qPCR עם SYBR Green Master Mix28. במקום ערכת Turbo DNAfree DNAse המוזכרת ב- Elser et al., השתמש בערכת RNAcleanup לאחר בידוד ה- RNA של Trizol כדי להבטיח שהדגימות אינן מכילות מזהמים28.
    הערה: קרא את גיליון נתוני בטיחות החומרים (MSDS) עבור Trizol, והשתמש בו במכסה אדים כימי.
  3. להעריך את החדרת הפלסמיד של פלסמיד הבקרה עם פריימרים GFP ושל פלסמיד ניסיוני עם פריימרים BLAST (פריימרים המפורטים בטבלה משלימה 1). השתמש בערך CT כדי לקבוע את נוכחותו של פלסמיד.
    הערה: ערכי CT מעל 35 הם תוצאות חיוביות שגויות, ורק אלה מתחת ל -35 צריכים להיחשב אינדיקטור חיובי לכך שהפלסמיד הוכנס בהצלחה.
  4. להעריך את ביטוי השליה IGF-1 מנורמל לגן משק הבית 18s (פריימרים המפורטים בטבלה משלימה 1). השתמש בשיטת ddCT כדי לחשב את שינוי הקיפול, ולאחר מכן חשב את שינוי הקיפול המנורמל של דגימות הניסוי לשינוי הקיפול הממוצע של דגימות הבקרה.

7. ניתוח רמת חלבון שליה

  1. השתמש ברבע השליה שאוחסנה ב -80 מעלות צלזיוס. הומוגניזציה של הרקמה בתמיסת חיץ העשויה 11.5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl 2 ומעכב פרוטאז 10 mM ב- diH2 O עם pH סופי של 7.4. השתמש הומוגנייזר כף יד ו pestle כדי לפרק את הרקמה.
    הערה: הדגימה לא תעלה על 10% מנפח המאגר.
  2. דללו את הדגימות ההומוגניות במאגר ביחס של 1:12, כך שהן יהיו בטווח הניתן לזיהוי של ערכת בדיקת חומצה ביכונית. בצע את בדיקת BCA בהתאם להוראות היצרן, וכמת את סך החלבון באמצעות קורא לוחות.
  3. לאחר ביצוע בדיקת BCA, לנרמל את כל הדגימות לאותו ריכוז חלבון כולל של 2 מ"ג / מ"ל עבור IGF-1 ELISA, כפי שנעשה Gumusoglu et al.29.
  4. בצע את IGF-1 ELISA בהתאם להוראות היצרן, וכמת את רמות החלבון IGF-1 באמצעות קורא לוחות באמצעות עקומת ריכוז סטנדרטית.

8. אימות CRIPSR מרחבי באמצעות תיוג הכלאה פלואורסצנטי באתרו

  1. לאחר שחצאי השליה קובעו כראוי ב-4% PFA ב-4°C למשך 1-3 ימים, העבירו אותם ל-20% סוכרוז ב-4°C לפני הקפאתם בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT).
  2. באופן סריאלי חותכים את השליה המשובצת OCT בחצי קריוסטט של -20 מעלות צלזיוס למקטעים של 10 מיקרומטר, ומניחים אותם על שקופיות כדי להיות מסומנים. חתכו את חצאי השליה כך שכל שלושת אזורי המשנה יהיו גלויים. אחסנו את המגלשות בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש להכלאה באתר .
  3. בצע תיוג הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) בהתאם לפרוטוקולים של היצרן. בצע הכלאה של שקופית אחת עם בדיקה dCas9-3xNLS-VP64 ושקופית "אחות" שנייה של אותה שליה עם בדיקה Prl8a8.
    הערה: הבדיקה dCas9-3xNLS-VP64 מזהה את נוכחותו של פלסמיד ביטוי יתר. הגשושית Prl8a8 מדגישה ספונגיוטרופובלסטים של אזור הצומת, מה שמאפשר לזהות את תת-האזורים של השליה. שתי בדיקות אלה מסומנות בשקופיות "אחות" נפרדות כדי למנוע הפרעה של פלואורסצנטיות רב-ערוצית עם האוטופלואורסצנטיות הירוקה בשליות.
  4. תייגו את שתי הגשושיות בצבע הזיהוי (אופל 620). לאחר השלמת פרוטוקול היצרן עבור FISH, החל מדיום הרכבה DAPI והנח מכסה על השקופית. אטמו את הכיסוי בלק שקוף.
  5. דמיינו את השקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי מורכב זקוף, ועבדו אותן באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מתאימה. כאן נעשה שימוש בתוכנת CellSens.

תוצאות

תוצאות כלליות של הליכים (איור 6)
במחקר היו שלוש קבוצות שעברו מניפולציה. אלה כללו שליות שהוזרקו עם פלסמיד בקרה כללי CRISPR Cas9 (Cas9 Control), פלסמיד CRISPR בקרת הפעלה (Act Control), או פלסמיד הפעלת IGF-1 SAM (Igf1-OE). בקרת Cas9 מתאימה יותר לפלסמידים נוקאאוט, ובקרת ההפעלה מתאימה י?...

Discussion

השליה היא מווסת עיקרי של גדילת העובר, וכאמור, שינויים בביטוי או בתפקוד של גן השליה עשויים להשפיע באופן משמעותי על התפתחות העובר6. ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כאן לביצוע מניפולציה ממוקדת in vivo CRISPR של שליית העכבר בגישה כירורגית מתקדמת יחסית. טכניקה זו מאפשרת יבול משמעותי ש?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מכירים במקורות המימון הבאים: R01 MH122435, NIH T32GM008629 ו-NIH T32GM145441. המחברים מודים לד"ר ואל שפילד ולמעבדות של ד"ר קלווין קרטר באוניברסיטת איווה על השימוש בחדר הניתוח ובציוד שלהם, כמו גם לד"ר אריק ואן אוטרלו, ד"ר ננדקומר נאראיאנן וד"ר מתיו ובר על עזרתם במיקרוסקופיה. המחברים מודים גם לד"ר שרה מאורר, מאיה אוונס וסרילקה קונדו על עזרתן בניתוחי הפיילוט.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml TubesUSA Scientific Inc1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBSThermo Fisher ScientificJ61899.AP
96 Well plateCornings3598For BCA kit
Absorbent UnderpadsFisher Scientific14-206-62
Activation Control PlasmidSanta Cruz Biotechnologysc-437275Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse TranscriptaseNew England BiolabsM0277LUse for cDNA synthesis
Anesthetic Gas VaporizorVetamacVAD-601TTVAD-compact vaporizer
Artifical Tear GelAkornNDC 59399-162-35
BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23227Protein quantification
BiovortexerBellco Glass, Inc.198050000Hand-held tissue homogenizer
CellSens SoftwareOlympusV4.1.1Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810EppendorfEP022628168Plate centrifuge
ChloroformThermo Fisher ScientificJ67241-APRNA isolation
Cotton Tipped ApplicatorsProAdvantage77100Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control PlasmidSanta Cruz Biotechnologysc-418922Dnase-free water provided for dilution
CryoStatLeicaCM1950
Dissection MicroscopeLeicaM125 CUsed for post-necroscopy imaging
Dissolvable SuturesMed Vet InternationalJ385H
Distilled WaterGibco15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Thermo fisher Scientific14190144(-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine)BTX Harvard Apparatus45-0662Generator only
Electric RazorWahlCL9990Kent Scientific
Electroporation paddles/TweezertrodesBTX Harvard Apparatus45-04873 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PKGrainger21RK94Placenta embedding cassettes
EthanolThermo Fisher Scientific268280010
F-Air CanistersPenn Veterinary Supply IncBIC80120Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCFSigmaF7252-5GDissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader)Fisher Scientific14377576Can be used for BCA and ELISA
ForcepsVWR82027-386Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10%Sigma AldrichHT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette)Sutter InstrumentB150-86-10O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x)Thermo Scientific1861281Protein homogenization buffer
Heating PadThermotechS766DDigitial Moist Heating Pad
HemostatsVWR10806-188Fully surrated jaw; curved
Hot Water BathFisher Scientific20253Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1)Santa Cruz Biotechnologysc-421056-ACTDnase-free water provided for dilution
Induction ChamberVetamac941443No specific liter size required
IsofluranePiramal Pharma LimitedNDC 66794-013-25
Isoproponal/2-ProponalFisher ScientificA451-4RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/mlAkornNDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum ChlorideSigma Aldrich63069-100ML1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with BarcodeFisher Scientific4309849Barcoded plates not required
Microcapillary TipEppendorf5196082001Attached to BTX Microinjector
MicroinjectorBTX Harvard Apparatus45-0766Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine)BTX Harvard Apparatus45-0751MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97Sutter InstrumentP-97Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker)scilogex822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA KitR & D SystemsMG100
NeedlesBD - Becton, Dickson, and Company30510630 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen TankLinde7727-37-9Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID)Norbrook Laboratories LimitedNDC 55529-040-10Analesgic such as Meloxicam
Nose ConeVetamac9216099-14 mm
Opal 620 detection dyeAkoya BiosciencesSKU FP1495001KTUsed for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) CompoundSakura4583
Oxygen TankLinde7782 - 44 - 7Medical grade oxygen
PestlesUSA Scientific Inc14155390
Povidone-Iodine Solution, 5%Avrio Health L.P.NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4367659Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers)New England BiolabsS1330SUse for cDNA synthesis
Razor BladeGrainger26X080
RNA Cleanup Kit & ConcentratorZymo ResearchR1013
RNALaterThermo Fisher ScientificAM7021
RNAscope kit v.2.5Advanced Cells Diagnostics323100Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2Advanced Cells Diagnostics 528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64Advanced Cells Diagnostics527421
Roto-Therm MiniBenchmarkR2020Dry oven for in situ hybridization
ScissorsVWR82027-578Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline)HospraNDC 0409-4888-03Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate]Research Product International03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher ChemicalFisher ScientificSS277Protein homogenization buffer
SteamerBellaB00DPX8UBA
Sterile Surgical DrapeBusse696Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60Leica3800160
SyringesBD - Becton, Dickson, and Company309659BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 FluorometerFisher Scientific13-400-525This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive3M1469SBVetBond
Tris HClThermo Fisher Scientific155680251M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ ReagentThermo Fisher Scientific15596018RNA isolation
TSA Buffer PackAdvanced Cells Diagnostics322810Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-CircuitVetamac40200Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence MicroscopeOlympusBX61VSUsed for FISH imaging
Vectorshield with DAPIVector LaboratoriesH-1200Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well BlockThermo Fisher Scientific4453536This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail ColorAmazonC450B
Xylazine 20mg/mlAnased343730_RX

References

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. . Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1941

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved