إنشاء نموذج كسر عظم الفخذ الحجابي في الفئران

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراء جراحيا لإنشاء كسر حاجز في عظم الفخذ للفئران ، والذي يتم تثبيته بسلك داخل النخاع ، لدراسات التئام الكسور.

Abstract

العظام لديها قدرة كبيرة على التجدد. ومع ذلك ، فإن التئام الكسور عملية معقدة ، واعتمادا على شدة الآفات والعمر والحالة الصحية العامة للمريض ، يمكن أن تحدث حالات فشل ، مما يؤدي إلى تأخر الاتحاد أو عدم الاتحاد. نظرا للعدد المتزايد من الكسور الناتجة عن الصدمات عالية الطاقة والشيخوخة ، هناك حاجة ماسة إلى تطوير استراتيجيات علاجية مبتكرة لتحسين إصلاح العظام بناء على مزيج من الخلايا الجذعية الهيكلية / الوسيطة / اللحمة اللحمية والمواد الحيوية المحاكية الحيوية. تحقيقا لهذه الغاية ، يعد استخدام النماذج الحيوانية الموثوقة أمرا أساسيا لفهم الآليات الخلوية والجزيئية الرئيسية التي تحدد نتائج الشفاء بشكل أفضل. من بين جميع النماذج ، يعد الماوس هو نموذج البحث المفضل لأنه يقدم مجموعة متنوعة من السلالات والكواشف المعدلة وراثيا للتحليل التجريبي. ومع ذلك ، قد يكون إنشاء كسور في الفئران تحديا تقنيا بسبب صغر حجمها. لذلك ، تهدف هذه المقالة إلى توضيح إجراءات التأسيس الجراحي لكسر عظم الفخذ الحجابي في الفئران ، والذي يتم تثبيته بسلك داخل النخاع ويشبه عملية إصلاح العظام الأكثر شيوعا ، من خلال تكوين الكالس الغضروفي.

Introduction

الهيكل العظمي هو عضو حيوي ومتعدد الاستخدامات وظيفيا. تمكن عظام الهيكل العظمي من وضع الجسم وحركته ، وتحمي الأعضاء الداخلية ، وتنتج هرمونات تدمج الاستجابات الفسيولوجية ، وهي موقع تكون الدم وتخزين المعادن¹. في حالة كسرها ، تتمتع العظام بقدرة ملحوظة على التجدد واستعادة شكلها ووظيفتها قبل الإصابة بالكامل. تبدأ عملية الشفاء بتكوين ورم دموي واستجابة التهابية ، مما يؤدي إلى تنشيط وتكثيف الخلايا الجذعية / السلفية الهيكلية من السمحاق والإندوستيريوم ونخاع العظم وتمايزها اللاحق لتشكيل الكالس الغضروفي الرخو. ثم يحدث سد النهايات المكسورة من خلال عملية تشبه تكوين العظم الغضروفي الداخلي ، حيث تتوسع السقالة الغضروفية ثم تتمعدن ، وتشكل الكالس العظمي الصلب. أخيرا ، يتم إعادة تشكيل الكالس الصلب تدريجيا بواسطة الخلايا الآكلة للعظم وبانيات العظم لاستعادة بنية العظام الأصلية ^2,3.

على الرغم من أن عملية التئام الكسور قوية إلى حد ما ، إلا أنها تنطوي على تلخيص معقد للأحداث وتتأثر بشكل كبير بالعديد من العوامل الفردية ، بما في ذلك الحالة الصحية العامة والعمر والجنس للمريض ، بالإضافة إلى عوامل الإصابة ، مثل طريقة التثبيت الميكانيكي للعظم المكسور ، وحدوث العدوى ، وشدة إصابة الأنسجة الرخوة المحيطة^{4 ، 5,6}. لذلك ، فإن الفشل شائع ، مما يؤدي إلى تطوير عدم الاتحاد ، مما يؤثر بشكل كبير على إعادة تأهيل المريض ونوعية الحياة ^7,8. نظرا للعدد المتزايد من الكسور نتيجة للصدمات عالية الطاقة والشيخوخة ، فضلا عن ارتفاع تكاليف العلاج ، أصبحت الكسور غير النقابية عبئا على النظم الصحية في جميع أنحاء العالم ^9,10. يسلط هذا العبء المتزايد الضوء على الحاجة الملحة لاستراتيجيات علاجية مبتكرة لتحسين إصلاح العظام^11,12 بناء على مزيج من الخلايا الجذعية الهيكلية / الوسيطة / اللحمية والمواد الحيوية للمحاكاة الحيوية^13,14.

سعيا لتحقيق هذا الهدف ، تم استخدام النماذج الحيوانية على نطاق واسع في الدراسات التي تهدف إلى فهم البيولوجيا الأساسية لآليات التئام الكسور وفي الدراسات قبل السريرية لإثبات المفهوم التي تهدف إلى وضع استراتيجيات علاجية جديدة لتعزيز إصلاح العظام^15،16،17. تعتبر النماذج الحيوانية الصغيرة ، مثل الفأر ، ممتازة لدراسات التئام الكسور بسبب التوافر الواسع للسلالات والكواشف المعدلة وراثيا للتحليلات التجريبية وتكاليف صيانتها المنخفضة. بالإضافة إلى ذلك ، تتمتع الفئران بدورة زمنية سريعة للشفاء ، مما يسمح بالتحليل الزمني لجميع مراحل عملية الإصلاح¹⁵. ومع ذلك ، فإن صغر حجم يمكن أن يشكل تحديات للإنتاج الجراحي للكسور مع أنماط التثبيت مماثلة لتلك المطبقة في البشر. يصف هذا البروتوكول نموذجا بسيطا ومنخفض التكلفة لالتئام الكسور في الفئران باستخدام قطع عظم الفخذ المفتوح المستقر بسلك داخل النخاع ، والذي يشبه عملية إصلاح العظام الأكثر شيوعا ، من خلال تكوين الكالس الغضروفي ، ويمكن استخدامه في كل من التحقيقات الأساسية والانتقالية التي تتطلب الوصول إلى موقع الكسر.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة استخدام ورعايتها التابعة لمركز العلوم الصحية بجامعة ريو دي جانيرو الفيدرالية (رقم البروتوكول 101/21). تم استخدام ذكور Balb / c الفئران في عمر 10-12 أسبوعا (25-30 جم من وزن الجسم) في هذه الدراسة. تستغرق العملية الجراحية حوالي 15-20 دقيقة لكل فأر. قبل كل إجراء ، يجب تنظيم الأدوات المطلوبة (المدرجة في جدول المواد) على مجال جراحي معقم يغطي طاولة العمليات (الشكل 1 أ). يجب تعقيم الأدوات الجراحية المعدنية في مظاريف ذاتية الختم عند 123 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يجب شراء العناصر التي تستخدم لمرة واحدة ، مثل الإبر ومنصات الشاش ، معقمة.

1. إعداد

1. تخدير الفأر وإجراء التسكين وفقا للنظام الموصى به من قبل الطبيب البيطري المعتمد من قبل البرنامج المؤسسي لرعاية واستخدام.
   ملاحظة: إذا كان ذلك متاحا ، يفضل إجراء التخدير بالاستنشاق. يمكن العثور على وصف لبروتوكول التخدير بالاستنشاق في تقرير Ewald et ^al.18. ومع ذلك ، إذا تم إنتاج الكسر لدراسات علم المناعة العظمية ، فيجب تجنب هذا النوع من التخدير ، حيث تشير الأدلة إلى أن العديد من أدوية التخدير المتطايرة ، بما في ذلك الأيزوفلوران ، تؤثر على نشاط كل من الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية^19,20.
2. بمجرد أن يصبح الفأر غير متحرك ، احلق الساق اليسرى ، ثم انقله إلى طاولة الجراحة على وسادة تدفئة دافئة (انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية مغطاة بستارة جراحية معقمة.
3. قم بإجراء غسل مطهر لمنطقة الشق عن طريق فرك الجلد بإسفنجة بوفيدون يود بنسبة 10٪. يجب أن يبدأ التطهير على طول خط الشق ويمتد إلى الخارج في نمط دائري. قم بتجفيف المنطقة المفركة باستخدام وسادات شاش معقمة ، واغسلها بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وجففها مرة أخرى باستخدام وسادة شاش معقمة. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات.
4. ضع الماوس في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن ، وشل حركة الكفوف بشريط جراحي (الشكل 1 ج).
5. قم بثني الماوس بحيث تكون منطقة الشق مرئية فقط (الشكل 1 د).

2. الإجراء الجراحي

1. أثناء العملية الجراحية ، تحقق باستمرار من أن الفأر يتنفس وقدم قطرات للعين في عينيه لتجنب الجفاف ومنع الفأر من أن يصبح أعمى.
   ملاحظة: عادة ما يستغرق الإجراء الجراحي بأكمله ~ 15-20 دقيقة عندما يقوم به جراح مدرب. لذلك ، يجب أن يكون تطبيق قطرات العين مرة واحدة في بداية الإجراء كافيا. إذا بدأ الإجراء في أن يصبح أطول ، يمكن إجراء تطبيقات إضافية كلما تم تحديد أن العيون بدأت في الجفاف.
2. قبل الشروع في الشق ، قم بتقييم عمق التخدير عن طريق الضغط على الذيل للتحقق من منعكس استجابة الألم وفحص معدل التنفس بصريا (حساب عدد الحركات الصدرية في الدقيقة)²¹. تحت التخدير الأمثل ، يجب ألا يستجيب الماوس لقرصة الذيل ، ويجب أن يكون معدل التنفس حوالي 55-65 نفسا / دقيقة²¹.
3. قم بعمل شق جلدي جانبي شبه رضفي بطول 1 سم بشفرة مشرط (رقم 11 ، انظر جدول المواد) ، بدءا من مستوى الحدبة الظنبوبية ويمتد إلى مستوى الرضفة ثم ، لمسافة متساوية ، نحو عظم الفخذ البعيد (الشكل 1E).
4. باستخدام مقص حاد النهاية ، قم بتشريح اللفافة تحت الجلد حول خط الشق لفضح اللفافة لاتا ، والأوعية الجانبية ، وعضلات العضلة ذات الرأسين الفخذية²².
5. باستخدام شفرة المشرط رقم 11 ، قم بعمل شق آخر في اللفافة لاتا مشابه للشق المصنوع في الجلد ، بدءا من مستوى الحدبة الظنبوبية ويمتد على طول العضلة ذات الرأسين الفخذية حتى مستوى عظم الفخذ البعيد ، لفتح الكبسولة المفصلية والوصول إلى مفصل الركبة (الشكل 1F ، G).
6. قم بإجراء خلع إنسي للرضفة عن طريق وضع طرف ملقط دقيق مسنن مستقيم (انظر جدول المواد) تحته ودفعه إلى الجانب مع الأربطة الرضفية ورباعية الرؤوس ، وبالتالي كشف لقمة عظم الفخذ (الشكل 1H).
7. أمسك عظم الفخذ بملقط طرف مسنن ، وثني الركبة بزاوية 90 درجة ، وقم بثقب القناة داخل النخاع يدويا لعظم الفخذ من خلال الحفرة بين اللقمتين بإبرة تحت الجلد 26 جم (الشكل 1I ، J).
8. مع الحفاظ على ثني الركبة عند 90 درجة ، أدخل جزءا من 1.0 سم من سلك قضيب من الفولاذ المقاوم للصدأ 0.016 بوصة (0.40 مم) (الشكل 1K ، إدراج) (انظر جدول المواد) من خلال الفتحة في القناة النخاعية لعظم الفخذ باتجاه المدور الكبير (الشكل 1K).
   ملاحظة: يعد الحفاظ على ثني الركبة عند 90 درجة أمرا بالغ الأهمية لإدخال السلك بشكل صحيح في القناة النخاعية. سيؤدي عدم القيام بذلك إلى تسرب السلك من العظم وآفات الأنسجة الرخوة المحيطة.
9. اضبط الطرف البعيد المثني مسبقا للسلك باستخدام ملقط ذو طرف مسنن مستقيم لتثبيته بإحكام في اللقمة الجانبية (الشكل 1L). بالإضافة إلى تثبيت السلك في مكانه ، فإن الطرف المثني سيسهل إزالة السلك بعد الوفاة.
10. افصل بين الأوعية الدموية الجانبية وعضلات العضلة ذات الرأسين الفخذية من خلال تشريح نهاية حادة باستخدام ملقط مسنن للوصول إلى الحجاب الحاجز البعيد لعظم الفخذ (الشكل 1M).
11. أدخل مقصا تشريحيا حول عظم الفخذ بزاوية 90 درجة تقريبا ، وقم بإجراء قطع العظم القشري الكامل برفق (الشكل 1N).
    ملاحظة: يتم قطع عظم الفخذ الفئران بسهولة. الامتناع عن استخدام القوة المفرطة أثناء قطع العظم لتجنب ثني السلك داخل النخاع وكسر واسع النطاق.
12. أعد وضع العضلات والرضفة عن طريق دفع طرف ملقط دقيق مسنن مستقيم فوق منطقة اللقمة اللقيمة.
13. أغلق اللفافة العضلية بخياطة قابلة للامتصاص 6-0 ثم الجلد باستخدام خياطة نايلون 6-0 (انظر جدول المواد) ، كلاهما بطريقة بسيطة متقطعة (الشكل 1O).
14. نقل الماوس إلى قفص نظيف فردي للانتعاش. بمجرد الاستيقاظ ، يجب أن يكون الماوس قادرا على التحرك بحرية مع تحمل الوزن غير المقيد.
15. في الأيام التالية بعد الجراحة ، قم بإجراء تسكين الألم وفقا للنظام الموصى به من قبل الطبيب البيطري المعتمد من قبل البرنامج المؤسسي لرعاية واستخدامها.

3. التصوير بالأشعة السينية

1. تخدير الماوس كما هو موضح في الخطوة 1.1.
   ملاحظة: إذا تم إجراء التصوير الشعاعي مباشرة بعد العملية الجراحية وكان الفأر لا يزال تحت التخدير الأمثل (الخطوة 2.2) ، فليس من الضروري إجراء هذه الخطوة.
2. للحصول على رؤية جانبية نظيفة لعظم الفخذ المكسور ، ضع الماوس في وضع الاستلقاء الظهري ، واسحب الطرف الخلفي الذي تم تشغيله قليلا إلى الجانب.
3. شل الكفوف بشريط جراحي.
4. إجراء التصوير الشعاعي وفقا لبروتوكول المعدات المتاحة.
   ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام مولد الأشعة السينية الرقمي للأسنان مع المعلمات التالية: جهد 70 كيلو فولت ، تيار 7 مللي أمبير ، ووقت تعرض 0.2 ثانية.

4. معالجة الأنسجة وتلطيخ H& E

1. القتل الرحيم للفئران بجرعة زائدة داخل الصفاق من التخدير (يرجى الرجوع إلى النظام الموصى به من قبل الطبيب البيطري المعتمد من قبل البرنامج المؤسسي لرعاية واستخدامها). بعد التحقق من عمق التخدير مع قرصة الذيل ، قم بإجراء خلع عنق الرحم. بعد ذلك ، اجمع العظم المكسور ، وقم بإزالة الأنسجة العضلية المحيطة الزائدة²³ ، وقم بتثبيت العظم في محلول فورمالين مخزن بنسبة 10٪ (درجة الحموضة 7.4) لمدة 3 أيام.
2. ضع عينات العظام في أشرطة الأنسجة الموسومة (انظر جدول المواد) ، واغمرها في 10٪ EDTA في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4 ، لمدة 14 يوما لإزالة الكلس. قم بتغيير محلول إزالة الكلس مرتين في الأسبوع.
3. تجفيف العينات في سلسلة من المحاليل لزيادة تركيزات الإيثانول (70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 100٪ ، 100٪) لمدة 1 ساعة لكل منهما.
4. امسح العينات في حمامين متتاليين من الزيلين لمدة 30 دقيقة لكل منهما.
5. لتسلل الشمع ، اغمر العينات في حمامين متتاليين من البارافين عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتضمين العينات في كتل للتقسيم²⁴.
   ملاحظة: لعرض الكالس بشكل أفضل ، قم بتضمين العظم بمحوره الطويل في الوضع الأفقي للسماح بإجراء تخفيضات طولية.
6. قطع الأنسجة إلى أقسام بسمك 4 ميكرومتر مع ميكروتوم (انظر جدول المواد).
7. قم بتعويم الأقسام في حمام مائي بدرجة حرارة 56 درجة مئوية ، وقم بتركيب الأقسام على شرائح نسيجية (انظر جدول المواد).
8. بالنسبة لتلطيخ H&E ، قم بإزالة الشرائح في ثلاثة حمامات متتالية من الزيلين لمدة 5 دقائق ، وأعد ترطيب الأنسجة في سلسلة من المحاليل لتقليل تركيزات الإيثانول (95٪ و 80٪ و 70٪) لمدة 5 دقائق.
9. اشطف الشرائح بماء الصنبور لمدة 30 ثانية ، وقم بتلطيخ الشرائح باستخدام هاريس هيماتوكسيلين (انظر جدول المواد) لمدة 6 دقائق ، ثم اشطفها بماء الصنبور لمدة 30 ثانية أخرى.
10. اغمر الشرائح في 1٪ حمض الهيدروكلوريك في الإيثانول لمدة 30 ثانية ثم في 70٪ إيثانول لمدة 30 ثانية.
11. تلطخ مع eosin (انظر جدول المواد) لمدة 2 دقيقة ، وتغسل بماء الصنبور لمدة 30 ثانية.
12. جفف الشرائح بالإيثانول (70٪ و 80٪ و 95٪ لمدة 5 دقائق) ، وقم بتوضيحها باستخدام حمامين من الزيلين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
13. للتركيب ، قم بالتنقيط قطرة أو قطرتين من وسيط التركيب (انظر جدول المواد) على كل شريحة ، وقم بتغطية الشريحة بغطاء نظيف.

النتائج

الطريقة الأكثر بساطة وفورية لتقييم نجاح العملية الجراحية في إنتاج الكسر هي التصوير بالأشعة السينية. يمكن إجراء الصور الشعاعية مباشرة بعد الجراحة ، مع بقاء الفأر تحت التخدير ، وبعد ذلك 7 أيام و 14 يوما و 21 يوما بعد الكسر لتقييم تكوين الكالس وتقدمه. أنماط الكسر المقبولة هي تلك التي تتمزق فيها ...

Discussion

مع زيادة عدد الكسور في جميع أنحاء العالم^9،10،25 ، أصبحت العلاجات المبتكرة لعدم الاتحاد ملحة بشكل متزايد. نظرا لأن التئام الكسور ينطوي على جمع معقد ومنظم بإحكام للأحداث التي تحدث على نطاق زمني^{طويل 3} ، فإن استخدام نماذج حيوانية ص...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol 70º	Merck	109-56-8	Or any general available supplier
Canada balsam (mounting medium)	Merck	C1795	Or any general available supplier
Cefazoline	ABL	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Coverslip	Merck	CSL284525	Or any general available supplier
Dental X-Ray Generator	Focus	-	Sold by Instrumentarium Dental Inc.
DEPC water	Merck	W4502	Or any general available supplier
Dissecting Scissor	ABC Instrumentos	0327	Similar brands of the item may be used according to local availability
EDTA	Vetec	60REAVET014340	Similar brands of the item may be used according to local availability
Eosin solution	Laborclin	EA-65	Similar brands of the item may be used according to local availability
Ethanol P.A	Vetec	60REAVET012053	Similar brands of the item may be used according to local availability
Gauze pads	Cremer	Not applicable	Or any general available supplier
Harris Hematoxylin Solution	Laborclin	620503	Similar brands of the item may be used according to local availability
Heating pad	Tonkey Electrical Technology	E114273	Similar brands of the item may be used according to local availability
Histological slides	Merck	CSL294875X25	Or any general available supplier
Histology cassettes	Merck	H0542-1CS	Or any general available supplier
Hydrochloric acid - 37%	Merck	258148	Similar brands of the item may be used according to local availability
Insulin syringe	BD	324918	Or any general available supplier
Iodopovidone sponge	Rioquímica	372106	Or any general available supplier
Ketamine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Lacribel collyrium	Cristalia	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Microtome	Leica	149AUTO00C1
Mouse Tooth Forceps Tweezer	ABC Instrumentos	0164	Similar brands of the item may be used according to local availability
Needle 26 G	BD	2239	Or any general available supplier
Needle Holder	Golgran	135-18	Similar brands of the item may be used according to local availability
Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1546-NT	Or any general available supplier
Paraffin	Exodo	8002 - 74 - 2	Similar brands of the item may be used according to local availability
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4	Similar brands of the item may be used according to local availability
PBS 1x	Lonza	BE17-516F	Similar brands of the item may be used according to local availability
Resorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1596-45B	Or any general available supplier
Rod Wire SS CrNi 0.016"	Orthometric	56.50.2016
Scalpel nº 11	Descarpak	15782	Or any general available supplier
Serrated Tip Tweezer	Quinelato	QC.404.12	Similar brands of the item may be used according to local availability
Shaver	Phillips	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Surgical tape	3M	2734	Or any general available supplier
Surgical tnt field	Polarfix	6153	Or any general available supplier
Tramadol hydrochloride	Teuto	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Water bath for histology	Leica	HI1210
Xylazine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Xylene	Dinamica	60READIN001105	Similar brands of the item may be used according to local availability