建立小鼠骨干股骨骨折模型

摘要

该协议描述了一种外科手术，用于在小鼠股骨中建立骨干骨折，该骨折用髓内线稳定，用于骨折愈合研究。

摘要

骨骼具有显着的再生能力。然而，骨折愈合是一个复杂的过程，根据病变的严重程度以及患者的年龄和整体健康状况，可能会发生失败，导致愈合延迟或不愈合。由于高能创伤和衰老导致的骨折数量不断增加，迫切需要开发基于骨骼/间充质干细胞/基质细胞和仿生生物材料相结合的创新治疗策略来改善骨修复。为此，使用可靠的动物模型对于更好地了解决定愈合结果的关键细胞和分子机制至关重要。在所有模型中，小鼠是首选的研究模型，因为它提供了多种用于实验分析的转基因菌株和试剂。然而，由于小鼠体型小，在小鼠中建立骨折可能在技术上具有挑战性。因此，本文旨在展示通过软骨愈伤组织形成的小鼠骨干股骨骨折的手术建立程序，该骨折由髓内线稳定，类似于最常见的骨修复过程。

引言

骨骼是一个重要且功能多样的器官。骨骼的骨骼使身体姿势和运动成为可能，保护内脏器官，产生整合生理反应的激素，并且是造血和矿物质储存的场所¹.如果骨折，骨骼具有非凡的再生能力，可以完全恢复其受伤前的形态和功能。愈合过程始于血肿和炎症反应的形成，这诱导骨膜、骨内膜和骨髓的骨骼干/祖细胞的活化和凝聚，以及随后的分化形成软骨愈伤组织。然后，断裂末端的桥接通过类似于软骨内骨形成的过程发生，其中软骨支架膨胀然后矿化，形成坚硬的骨性愈伤组织。最后，硬愈伤组织逐渐由破骨细胞和成骨细胞重塑，以恢复原始骨骼结构 ^2,3。

尽管骨折愈合过程相当稳健，但它涉及一系列错综复杂的事件，并受到几个个体因素的显着影响，包括患者的一般健康状况、年龄和性别，以及损伤因素，例如骨折的机械稳定方式、感染的发生以及周围软组织损伤的严重程度^4，5,6.因此，失败很常见，导致骨不连的发展，这极大地影响了患者的康复和生活质量 ^7,8。由于高能量创伤和衰老导致的骨折数量增加，以及治疗费用高昂，不愈合骨折已成为全世界卫生系统的负担 ^9,10。这种日益增加的负担凸显了对创新治疗策略的迫切需要，以基于骨骼/间充质干细胞/基质细胞和仿生生物材料的组合来改善骨修复^{11,12 13,14}。

为了实现这一目标，动物模型已被广泛用于旨在了解骨折愈合机制基础生物学的研究，以及旨在设计新的治疗策略以促进骨修复的概念验证临床前研究15,16,17。小动物模型，如小鼠，非常适合骨折愈合研究，因为转基因菌株和试剂可用于实验分析，而且维护成本低。此外，小鼠具有快速的愈合时间过程，这允许对修复过程的所有阶段进行时间分析¹⁵。然而，动物的小体型可能会给骨折的手术产生带来挑战，其固定模式类似于人类的固定模式。该协议描述了一种简单且低成本的小鼠骨折愈合模型，使用用髓内线稳定的开放式股骨截骨术，类似于最常见的骨修复过程，通过软骨痂的形成，并且可用于需要进入骨折部位的基础和转化研究。

研究方案

所有实验均已获得里约热内卢联邦大学健康科学中心动物使用和护理委员会的批准（协议编号101/21）。本研究使用10-12周龄（25-30g体重）的雄性Balb/c小鼠。每只小鼠的手术过程大约需要 15-20 分钟。在每次手术之前，所需的器械（列在 材料表中）必须组织在覆盖手术台的无菌手术区域（图1A）。金属手术器械必须在123°C的自密封信封中高压灭菌30分钟。一次性物品，如针头和纱布垫，必须采购无菌。

1. 动物准备

1. 麻醉小鼠并按照机构动物护理和使用计划批准的兽医推荐方案进行镇痛。
   注意:如果可用，最好进行吸入麻醉。吸入麻醉方案的描述可以在 Ewald 等人的报告中找到 ¹⁸.然而，如果骨折是为骨免疫学研究而产生的，则必须避免这种类型的麻醉，因为有证据表明，包括异氟烷在内的几种挥发性麻醉剂会影响先天性和适应性免疫细胞的活性^19,20。
2. 一旦鼠标不动，剃掉左腿，然后将其转移到37°C的温暖加热垫（见 材料表）上的手术台上，上面覆盖着无菌手术单。
3. 用 10% 聚维酮碘海绵擦拭皮肤，对切口区域进行消毒清洗。消毒应沿切口线开始，并以圆形向外延伸。用无菌纱布垫擦干摩擦区域，用70%乙醇清洗，然后用无菌纱布垫再次干燥。重复此过程三次。
4. 将鼠标置于右侧卧位，并用手术胶带固定爪子（图1C）。
5. 悬垂鼠标，使仅可见切口区域（图1D）。

2. 外科手术

1. 在手术过程中，不断检查鼠标是否在呼吸，并在其眼睛中滴眼药水，以避免干燥并防止鼠标失明。
   注意:当由训练有素的外科医生执行时，整个外科手术通常需要 ~15-20 分钟。因此，在手术开始时使用一次眼药水就足够了。如果手术开始变长，只要发现眼睛开始干燥，就可以进行额外的应用。
2. 在进行切口之前，通过捏住尾巴以检查疼痛反应反射并目视检查呼吸频率（计算每分钟的胸腔运动次数）²¹ 来评估麻醉深度。在最佳麻醉下，小鼠不应对夹尾做出反应，呼吸频率必须在 55-65 次/分钟左右²¹.
3. 用手术刀刀片做一个1厘米的皮肤外侧髌旁切口（编号11，见 材料表），从胫骨结节的水平开始，延伸到髌骨的水平，然后，以相等的距离，朝向股骨远端（图1E）。
4. 用钝头剪刀解剖切口线周围的皮下筋膜，露出阔筋膜、股外侧肌和股二头肌²²。
5. 使用11号手术刀刀片，在阔筋膜上做另一个类似于皮肤上的切口，从胫骨粗隆水平开始，沿着股二头肌腱膜延伸，直到股骨远端水平，以打开关节囊并进入膝关节（图1F，G）。
6. 通过将直锯齿状精密尖端镊子的尖端（见 材料表）的尖端放在髌骨下方并将其与髌骨和股四头肌韧带一起推到一边，从而暴露股骨的髁突（图1H）。
7. 用锯齿状尖端镊子握住股骨，将膝盖弯曲 90°，并用 26 G 皮下注射针通过髁间窝手动穿孔股骨髓内管（图 1I，J）。
8. 保持膝关节弯曲 90°，将一段 1.0 厘米的 0.016 英寸（0.40 毫米）不锈钢棒线（图 1K，插入）（见 材料表）通过开口插入股骨髓管朝向大转子（图 1K）。
   注意: 保持膝关节弯曲 90° 对于将金属丝正确插入髓管至关重要。否则会导致金属丝从骨骼和周围的软组织病变中外渗。
9. 用直锯齿状尖端镊子调整金属丝的预弯曲远端，将其紧紧地固定在外侧髁中（图1L）。除了将电线固定到位外，弯曲的肢体还有助于死后移除电线。
10. 用锯齿状尖端镊子通过钝端解剖分离股外侧股骨和股二头肌，以进入股骨远端骨干（图1M）。
11. 在股骨骨干周围以大约90°的角度插入解剖剪刀，并轻轻地进行完整的皮质截骨术（图1N）。
    注意:小鼠股骨很容易切割。截骨术时不要用力过大，以免髓内钢丝弯曲和大面积骨折粉碎。
12. 通过将直锯齿状精密尖端镊子的尖端推到髁突区域来重新定位肌肉和髌骨。
13. 用6-0可吸收缝合线关闭肌肉筋膜，然后使用6-0尼龙缝合线（见 材料表）关闭皮肤，两者都以简单的中断方式（图1O）。
14. 将鼠标转移到单独的干净笼子中进行恢复。一旦醒来，鼠标必须能够在不受限制的负重下自由移动。
15. 在手术后的接下来几天内，按照机构动物护理和使用计划批准的兽医推荐方案进行镇痛。

3. X射线成像

1. 按照步骤1.1中的说明麻醉小鼠。
   注意:如果在外科手术后立即进行射线照相，并且小鼠仍处于最佳麻醉状态（步骤2.2），则无需执行此步骤。
2. 为了获得骨折股骨的干净侧视图，将鼠标置于背侧褥号，并将手术后肢稍微拉向一侧。
3. 用手术胶带固定爪子。
4. 根据可用的设备协议进行射线照相成像。
   注意:在这项研究中，使用具有以下参数的数字牙科 X 射线发生器:70 kVp 电压、7 mA 电流和 0.2 秒曝光时间。

4. 组织学处理和H&E染色

1. 用腹膜内过量的麻醉剂对小鼠实施安乐死（请参阅机构动物护理和使用计划批准的兽医推荐方案）。用尾巴捏住麻醉深度后，进行颈椎脱位。接下来，收集骨折的骨头，去除多余的周围肌肉组织²³，并将骨头固定在10%缓冲福尔马林溶液（pH 7.4）中3天。
2. 将骨样品放入标记的组织学盒中（参见 材料表），并将其浸入10%EDTA磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，pH 7.4,14天进行脱钙。每周更换两次脱钙液。
3. 在一系列增加乙醇浓度（70%，80%，90%，100%，100%）的溶液中将样品脱水1小时。
4. 在两个连续的二甲苯浴中清除样品，每次30分钟。
5. 对于蜡浸润，将样品浸入60°C的两个连续石蜡浴中30分钟。接下来，将样品嵌入块中以进行切片²⁴。
   注意:为了更好地观察愈伤组织，请将骨骼及其长轴嵌入水平位置，以允许纵向切割。
6. 用切片机将组织切成4μm厚的切片（参见 材料表）。
7. 将切片漂浮在56°C水浴中，并将切片安装在组织学载玻片上（参见 材料表）。
8. 对于H&E染色，在三个连续的二甲苯浴中脱蜡载玻片5分钟，并在一系列乙醇浓度降低（95%，80%和70%）的溶液中将组织再水化5分钟。
9. 用自来水冲洗载玻片30秒，用Harris苏木精（参见 材料表）染色载玻片6分钟，然后在自来水中再冲洗30秒。
10. 将载玻片浸入乙醇中的1%盐酸中30秒，然后浸入70%乙醇中30秒。
11. 用伊红染色（见 材料表）2分钟，用自来水洗涤30秒。
12. 用乙醇（70%、80%和95%）脱水载玻片5分钟，并用两个二甲苯浴澄清，每次5分钟。
13. 安装时，将一到两滴安装介质（参见 材料表）滴到每个载玻片上，并用干净的盖玻片盖住载玻片。

结果

评估外科手术在骨折方面是否成功的最简单和最直接的方法是 X 射线成像。可以在手术后立即进行 X 光片，小鼠仍处于麻醉状态，随后在骨折后 7 天、14 天和 21 天进行 X 光检查，以评估愈伤组织形成和进展。可接受的骨折模式是皮质完全破裂，钢丝正确放置在髓管内，并且骨折线是横向的（与骨轴成 90° 角）、斜的（弯曲或倾斜的模式，没有碎片位移）或短斜（相对于骨轴约 30°）（

讨论

随着全球骨折数量的增加 ^9,10,25，愈合不愈合的创新治疗方法变得越来越紧迫。由于骨折愈合涉及对在很长一段时间内发生的事件的复杂而紧密的总结³，因此使用有效的动物模型对于提高我们对决定骨修复成功与否的机制的理解以及选择有效的药物和治疗方案至关重要^16,17

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol 70º	Merck	109-56-8	Or any general available supplier
Canada balsam (mounting medium)	Merck	C1795	Or any general available supplier
Cefazoline	ABL	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Coverslip	Merck	CSL284525	Or any general available supplier
Dental X-Ray Generator	Focus	-	Sold by Instrumentarium Dental Inc.
DEPC water	Merck	W4502	Or any general available supplier
Dissecting Scissor	ABC Instrumentos	0327	Similar brands of the item may be used according to local availability
EDTA	Vetec	60REAVET014340	Similar brands of the item may be used according to local availability
Eosin solution	Laborclin	EA-65	Similar brands of the item may be used according to local availability
Ethanol P.A	Vetec	60REAVET012053	Similar brands of the item may be used according to local availability
Gauze pads	Cremer	Not applicable	Or any general available supplier
Harris Hematoxylin Solution	Laborclin	620503	Similar brands of the item may be used according to local availability
Heating pad	Tonkey Electrical Technology	E114273	Similar brands of the item may be used according to local availability
Histological slides	Merck	CSL294875X25	Or any general available supplier
Histology cassettes	Merck	H0542-1CS	Or any general available supplier
Hydrochloric acid - 37%	Merck	258148	Similar brands of the item may be used according to local availability
Insulin syringe	BD	324918	Or any general available supplier
Iodopovidone sponge	Rioquímica	372106	Or any general available supplier
Ketamine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Lacribel collyrium	Cristalia	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Microtome	Leica	149AUTO00C1
Mouse Tooth Forceps Tweezer	ABC Instrumentos	0164	Similar brands of the item may be used according to local availability
Needle 26 G	BD	2239	Or any general available supplier
Needle Holder	Golgran	135-18	Similar brands of the item may be used according to local availability
Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1546-NT	Or any general available supplier
Paraffin	Exodo	8002 - 74 - 2	Similar brands of the item may be used according to local availability
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4	Similar brands of the item may be used according to local availability
PBS 1x	Lonza	BE17-516F	Similar brands of the item may be used according to local availability
Resorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1596-45B	Or any general available supplier
Rod Wire SS CrNi 0.016"	Orthometric	56.50.2016
Scalpel nº 11	Descarpak	15782	Or any general available supplier
Serrated Tip Tweezer	Quinelato	QC.404.12	Similar brands of the item may be used according to local availability
Shaver	Phillips	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Surgical tape	3M	2734	Or any general available supplier
Surgical tnt field	Polarfix	6153	Or any general available supplier
Tramadol hydrochloride	Teuto	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Water bath for histology	Leica	HI1210
Xylazine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Xylene	Dinamica	60READIN001105	Similar brands of the item may be used according to local availability