Etablierung eines diaphysären Femurfrakturmodells bei Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein chirurgisches Verfahren zur Etablierung einer diaphysären Fraktur im Oberschenkelknochen von Mäusen, die mit einem Markdraht stabilisiert wird, für Frakturheilungsuntersuchungen.

Zusammenfassung

Knochen haben eine signifikante Regenerationsfähigkeit. Die Frakturheilung ist jedoch ein komplexer Prozess, und je nach Schweregrad der Läsionen und dem Alter und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten können Ausfälle auftreten, die zu einer verzögerten oder fehlenden Union führen. Aufgrund der steigenden Zahl von Frakturen, die auf hochenergetische Traumata und Alterung zurückzuführen sind, ist die Entwicklung innovativer therapeutischer Strategien zur Verbesserung der Knochenreparatur auf der Grundlage der Kombination von skelettalen/mesenchymalen Stamm-/Stromazellen und biomimetischen Biomaterialien dringend erforderlich. Zu diesem Zweck ist die Verwendung zuverlässiger Tiermodelle von grundlegender Bedeutung, um die wichtigsten zellulären und molekularen Mechanismen, die die Heilungsergebnisse bestimmen, besser zu verstehen. Von allen Modellen ist die Maus das bevorzugte Forschungsmodell, da sie eine große Vielfalt an transgenen Stämmen und Reagenzien für die experimentelle Analyse bietet. Die Etablierung von Frakturen bei Mäusen kann jedoch aufgrund ihrer geringen Größe eine technische Herausforderung darstellen. Ziel dieses Artikels ist es daher, die Verfahren zur chirurgischen Etablierung einer diaphysären Femurfraktur bei Mäusen zu demonstrieren, die mit einem Markdraht stabilisiert wird und dem häufigsten Knochenreparaturprozess durch knorpelige Kallusbildung ähnelt.

Einleitung

Das Skelett ist ein lebenswichtiges und funktionell vielseitiges Organ. Die Knochen des Skeletts ermöglichen Körperhaltung und Bewegung, schützen die inneren Organe, produzieren Hormone, die physiologische Reaktionen integrieren, und sind der Ort der Hämatopoese und der Mineralienspeicherung¹. Wenn sie gebrochen sind, haben Knochen eine bemerkenswerte Fähigkeit, sich zu regenerieren und ihre Form und Funktion vor der Verletzung vollständig wiederherzustellen. Der Heilungsprozess beginnt mit der Bildung eines Hämatoms und einer Entzündungsreaktion, die die Aktivierung und Kondensation von Skelettstamm-/Vorläuferzellen aus der Knochenhaut, dem Endostel und dem Knochenmark und deren anschließende Differenzierung zur Bildung des weichen Knorpelkallus induziert. Die Überbrückung der gebrochenen Enden erfolgt dann durch einen Prozess, der der endochondralen Knochenbildung ähnelt, bei dem sich das Knorpelgerüst ausdehnt und dann mineralisiert, wodurch der harte knöcherne Kallus gebildet wird. Schließlich wird der harte Kallus nach und nach durch Osteoklasten und Osteoblasten umgebaut, um die ursprüngliche Knochenstruktur wiederherzustellen ^2,3.

Obwohl der Frakturheilungsprozess recht robust ist, beinhaltet er eine komplizierte Zusammenfassung von Ereignissen und wird maßgeblich von mehreren individuellen Faktoren beeinflusst, darunter der allgemeine Gesundheitszustand, das Alter und das Geschlecht des Patienten sowie Verletzungsfaktoren wie die Art der mechanischen Stabilisierung des gebrochenen Knochens, das Auftreten von Infektionen und die Schwere der umgebenden Weichteilverletzung^{4. 5,6}. Daher kommt es häufig zu Misserfolgen, die zur Entwicklung von Pseudarthrosen führen, die sich stark auf die Rehabilitation und Lebensqualität der Patienten auswirken ^7,8. Aufgrund der steigenden Zahl von Frakturen als Folge von hochenergetischen Traumata und Alterung sowie der hohen Behandlungskosten sind Pseudarthronfrakturen zu einer Belastung für die Gesundheitssysteme weltweit geworden ^9,10. Diese zunehmende Belastung unterstreicht den dringenden Bedarf an innovativen therapeutischen Strategien zur Verbesserung der Knochenreparatur^11,12, die auf der Kombination von skelettalen/mesenchymalen Stamm-/Stromazellen und biomimetischen Biomaterialien basieren^13,14.

Um dieses Ziel zu erreichen, wurden Tiermodelle häufig in Studien eingesetzt, die darauf abzielen, die grundlegende Biologie der Frakturheilungsmechanismen zu verstehen, und in präklinischen Proof-of-Concept-Studien, die darauf abzielen, neue therapeutische Strategien zur Förderung der Knochenreparatur zu entwickeln 15,16,17. Kleintiermodelle, wie z. B. die Maus, eignen sich hervorragend für Frakturheilungsstudien, da genetisch veränderte Stämme und Reagenzien für experimentelle Analysen weit verbreitet sind und die Wartungskosten gering sind. Darüber hinaus haben Mäuse einen schnellen Heilungszeitverlauf, der die zeitliche Analyse aller Stadien des Reparaturprozesses ermöglicht¹⁵. Die geringe Größe des Tieres kann jedoch eine Herausforderung für die chirurgische Herstellung von Frakturen mit ähnlichen Fixationsmodi wie beim Menschen darstellen. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches und kostengünstiges Modell der Frakturheilung bei Mäusen unter Verwendung einer offenen Femurosteotomie, die mit einem Markdraht stabilisiert wird, die dem häufigsten Knochenreparaturprozess durch knorpelige Kallusbildung ähnelt und sowohl in grundlegenden als auch in translationalen Untersuchungen verwendet werden kann, bei denen ein Zugang zur Frakturstelle erforderlich ist.

Protokoll

Alle Versuche wurden vom Komitee für Tiernutzung und -pflege des Zentrums für Gesundheitswissenschaften der Bundesuniversität von Rio de Janeiro genehmigt (Protokollnummer 101/21). In dieser Studie wurden männliche Balb/c-Mäuse im Alter von 10-12 Wochen (25-30 g Körpergewicht) verwendet. Der chirurgische Eingriff dauert ca. 15-20 min pro Maus. Vor jedem Eingriff müssen die erforderlichen Instrumente (aufgeführt in der Materialtabelle) über einem sterilen Operationsfeld angeordnet werden, das den Operationstisch abdeckt (Abbildung 1A). Die metallischen chirurgischen Instrumente müssen in selbstklebenden Hüllen bei 123 °C für 30 min autoklaviert werden. Einwegartikel wie Nadeln und Mullbinden müssen steril beschafft werden.

1. Zubereitung von Tieren

1. Betäuben Sie die Maus und führen Sie eine Analgesie in Übereinstimmung mit dem vom Tierarzt empfohlenen Schema durch, das vom institutionellen Tierpflege- und -verwendungsprogramm genehmigt wurde.
   HINWEIS: Falls verfügbar, sollte vorzugsweise eine Inhalationsanästhesie durchgeführt werden. Eine Beschreibung des Protokolls für die Inhalationsanästhesie findet sich im Bericht von Ewald et ^al.18. Wenn die Fraktur jedoch für osteoimmunologische Studien hergestellt wird, muss diese Art der Anästhesie vermieden werden, da es Hinweise darauf gibt, dass mehrere flüchtige Anästhetika, einschließlich Isofluran, die Aktivität sowohl der angeborenen als auch der adaptiven Immunzellen beeinflussen^19,20.
2. Sobald die Maus unbeweglich ist, rasieren Sie das linke Bein und legen es dann auf einem warmen Heizkissen (siehe Materialtabelle) bei 37 °C, das mit einem sterilen OP-Tuch bedeckt ist, auf den OP-Tisch.
3. Führen Sie eine antiseptische Reinigung des Inzisionsbereichs durch, indem Sie die Haut mit einem 10%igen Povidon-Jod-Schwamm abreiben. Die Desinfektion sollte entlang der Inzisionslinie beginnen und sich kreisförmig nach außen erstrecken. Trocknen Sie die eingeriebene Stelle mit sterilen Mullbinden ab, waschen Sie sie mit 70%igem Ethanol und trocknen Sie sie erneut mit einem sterilen Mulltuch. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.
4. Platzieren Sie die Maus in der rechten seitlichen Dekubitusposition und immobilisieren Sie die Pfoten mit chirurgischem Klebeband (Abbildung 1C).
5. Drapieren Sie die Maus so, dass nur der Inzisionsbereich sichtbar ist (Abbildung 1D).

2. Chirurgischer Eingriff

1. Kontrollieren Sie während des chirurgischen Eingriffs ständig, ob die Maus atmet, und geben Sie Augentropfen in ihre Augen, um Trockenheit zu vermeiden und zu verhindern, dass die Maus erblindet.
   HINWEIS: Der gesamte chirurgische Eingriff dauert in der Regel ~15-20 Minuten, wenn er von einem ausgebildeten Chirurgen durchgeführt wird. Daher sollte es ausreichen, die Augentropfen zu Beginn des Eingriffs einmal aufzutragen. Wenn der Eingriff länger wird, können zusätzliche Anwendungen durchgeführt werden, wenn festgestellt wird, dass die Augen zu trocknen beginnen.
2. Bevor Sie mit dem Schnitt fortfahren, bewerten Sie die Anästhesietiefe, indem Sie den Schwanz zusammenkneifen, um den Schmerzreaktionsreflex zu überprüfen, und die Atemfrequenz visuell überprüfen (Zählen der Anzahl der Thoraxbewegungen pro Minute)²¹. Unter optimaler Anästhesie sollte die Maus nicht auf ein Einklemmen des Schwanzes reagieren, und die Atemfrequenz muss etwa 55-65 Atemzüge/min betragen²¹.
3. Mit einer Skalpellklinge (Nummer 11, siehe Materialtabelle) wird ein 1 cm langer kutaner lateraler parapatellar Schnitt durchgeführt, der auf Höhe der Tuberositas tibiais beginnt und sich bis zur Höhe der Kniescheibe und dann über einen gleichen Abstand in Richtung des distalen Femurs erstreckt (Abbildung 1E).
4. Mit einer Schere mit stumpfem Ende wird die subkutane Faszie um die Inzisionslinie herum präpariert, um die Fascia lata, den lateralen Vastus und die Oberschenkelbizepsmuskeln freizulegen²².
5. Mit der Skalpellklinge Nummer 11 wird ein weiterer Schnitt in der Fascia lata gemacht, ähnlich dem in der Haut, beginnend auf Höhe der Tuberositas tibiais und entlang der Aponeurose des Bizeps femoris bis zur Höhe des distalen Femurs, um die Gelenkkapsel zu öffnen und das Kniegelenk zu erreichen (Abbildung 1F, G).
6. Führen Sie eine mediale Luxation der Kniescheibe durch, indem Sie die Spitze einer geraden, gezackten Präzisionspinzette (siehe Materialtabelle) darunter legen und sie zusammen mit den Patella- und Quadrizepsbändern zur Seite schieben, wodurch die Kondylen des Oberschenkelknochens freigelegt werden (Abbildung 1H).
7. Halten Sie den Oberschenkelknochen mit einer Pinzette mit gezackter Spitze fest, beugen Sie das Knie um 90° und perforieren Sie den Markkanal des Oberschenkelknochens manuell durch die Fossa intercondylaris mit einer 26-G-Injektionsnadel (Abbildung 1I, J).
8. Halten Sie das Knie um 90° gebeugt und führen Sie ein Segment von 1,0 cm eines 0,016 Zoll (0,40 mm) Edelstahldrahtes (Abbildung 1K, Einsatz) (siehe Materialtabelle) durch die Öffnung in den Markkanal des Oberschenkelknochens in Richtung des großen Trochanters (Abbildung 1K) ein.
   HINWEIS: Die 90°-Beugung des Knies ist entscheidend für das korrekte Einführen des Drahtes in den Markkanal. Wenn Sie dies nicht tun, führt dies zur Extravasation des Drahtes aus dem Knochen und den umgebenden Weichteilläsionen.
9. Passen Sie das vorgebogene distale Ende des Drahtes mit einer Pinzette mit gerader gezackter Spitze an, um es fest im lateralen Kondylus zu fixieren (Abbildung 1L). Die gebogene Extremität fixiert nicht nur den Draht, sondern erleichtert auch die postmortale Entfernung des Drahtes.
10. Trennen Sie den lateralen Vastus und den Oberschenkelbizeps durch stumpfe Enddissektion mit einer Pinzette mit gezackter Spitze, um an die distale Diaphyse des Oberschenkelknochens zu gelangen (Abbildung 1M).
11. Führen Sie eine Präparierschere in einem Winkel von ca. 90° um die Oberschenkeldiaphyse ein und führen Sie vorsichtig eine vollständige kortikale Osteotomie durch (Abbildung 1N).
    HINWEIS: Die Oberschenkelknochen von Mäusen lassen sich leicht schneiden. Verzichten Sie während der Osteotomie auf übermäßige Krafteinwirkung, um eine Verbiegung des Markdrahtes und eine ausgedehnte Frakturzerkleinerung zu vermeiden.
12. Positionieren Sie die Muskeln und die Kniescheibe neu, indem Sie die Spitze einer geraden, gezackten Präzisionspinzette über die Kondylusregion schieben.
13. Verschließen Sie die Muskelfaszie mit einer resorbierbaren 6-0-Naht und dann die Haut mit einer 6-0-Nylonnaht (siehe Materialtabelle), beides in einer einfachen unterbrochenen Weise (Abbildung 1O).
14. Bringen Sie die Maus zur Erholung in einen einzelnen, sauberen Käfig. Nach dem Aufwachen muss sich die Maus frei und uneingeschränkt belastend bewegen können.
15. Führen Sie in den folgenden Tagen nach der Operation eine Analgesie gemäß dem vom Tierarzt empfohlenen Schema durch, das vom institutionellen Tierpflege- und -verwendungsprogramm genehmigt wurde.

3. Röntgenbildgebung

1. Betäuben Sie die Maus wie in Schritt 1.1 beschrieben.
   HINWEIS: Wenn die Röntgenaufnahme direkt nach dem chirurgischen Eingriff durchgeführt wird und sich die Maus noch in optimaler Narkose befindet (Schritt 2.2), ist es nicht erforderlich, diesen Schritt durchzuführen.
2. Für eine saubere seitliche Sicht auf den gebrochenen Oberschenkelknochen legen Sie die Maus in die dorsale Dekubitusposition und ziehen Sie die operierte Hintergliedmaße leicht zur Seite.
3. Immobilisieren Sie die Pfoten mit chirurgischem Klebeband.
4. Führen Sie Röntgenaufnahmen gemäß dem verfügbaren Geräteprotokoll durch.
   HINWEIS: Für diese Studie wurde ein digitaler dentaler Röntgengenerator mit den folgenden Parametern verwendet: 70 kVp Spannung, 7 mA Strom und 0,2 s Belichtungszeit.

4. Histologische Aufbereitung und H&E-Färbung

1. Euthanasie der Mäuse mit einer intraperitonealen Überdosis von Anästhetika (bitte beachten Sie das vom Tierarzt empfohlene Schema, das vom institutionellen Tierpflege- und -verwendungsprogramm genehmigt wurde). Nachdem Sie die Tiefe der Anästhesie mit einer Schwanzkneifung überprüft haben, führen Sie eine zervikale Luxation durch. Als nächstes wird der gebrochene Knochen gesammelt, überschüssiges umgebendes Muskelgewebe²³ entfernt und der Knochen 3 Tage lang in 10%iger gepufferter Formalinlösung (pH 7,4) fixiert.
2. Legen Sie die Knochenproben in markierte Histologiekassetten (siehe Materialtabelle) und tauchen Sie sie zur Entkalkung 14 Tage lang in 10%iges EDTA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4. Wechseln Sie die Entkalkungslösung zweimal pro Woche.
3. Dehydrieren Sie die Proben in einer Reihe von Lösungen mit steigender Ethanolkonzentration (70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 100 %) für jeweils 1 Stunde.
4. Reinigen Sie die Proben in zwei aufeinanderfolgenden Xylolbädern für jeweils 30 Minuten.
5. Für die Wachsinfiltration werden die Proben 30 min lang in zwei aufeinanderfolgende Paraffinbäder bei 60 °C getaucht. Als Nächstes betten Sie die Proben in Blöcke ein, um²⁴ zu schneiden.
   HINWEIS: Um die Hornhaut besser zu sehen, betten Sie den Knochen mit seiner Längsachse in die horizontale Position ein, um Längsschnitte zu ermöglichen.
6. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Mikrotom in 4 μm dicke Abschnitte (siehe Materialtabelle).
7. Schwimmen Sie die Schnitte in einem 56 °C warmen Wasserbad und montieren Sie die Schnitte auf histologische Objektträger (siehe Materialtabelle).
8. Für die H&E-Färbung werden die Objektträger in drei aufeinanderfolgenden Xylolbädern für 5 Minuten deparaffiniert und das Gewebe 5 Minuten lang in einer Reihe von Lösungen mit abnehmenden Ethanolkonzentrationen (95 %, 80 % und 70 %) rehydriert.
9. Spülen Sie die Objektträger 30 s lang in Leitungswasser ab, färben Sie die Objektträger 6 Minuten lang mit Harris-Hämatoxylin (siehe Materialtabelle) und spülen Sie sie weitere 30 Sekunden in Leitungswasser ab.
10. Tauchen Sie die Objektträger 30 s lang in 1%ige Salzsäure in Ethanol und dann 30 s lang in 70%iges Ethanol.
11. 2 Minuten mit Eosin (siehe Materialtabelle) färben und 30 s lang mit Leitungswasser waschen.
12. Dehydrieren Sie die Objektträger mit Ethanol (70 %, 80 % und 95 % für 5 Minuten) und klären Sie sie mit zwei Bädern Xylol für jeweils 5 Minuten.
13. Für die Montage träufeln Sie ein bis zwei Tropfen Eindeckmedium (siehe Materialtabelle) auf jeden Objektträger und decken Sie den Objektträger mit einem sauberen Deckglas ab.

Ergebnisse

Der einfachste und unmittelbarste Weg, um den Erfolg des chirurgischen Eingriffs bei der Herstellung der Fraktur zu beurteilen, ist die Röntgenbildgebung. Röntgenaufnahmen können unmittelbar nach der Operation durchgeführt werden, während die Maus noch unter Narkose steht, und anschließend 7 Tage, 14 Tage und 21 Tage nach der Fraktur, um die Kallusbildung und das Fortschreiten der Fraktur zu beurteilen. Akzeptable Frakturmuster sind solche, bei denen die Kortexe vollständig gerissen sind, die Drähte korrekt im Ma...

Diskussion

Da die Zahl der Frakturen weltweit zunimmt ^9,10,25, werden innovative Behandlungen für Pseudarthrosen immer dringlicher. Da die Frakturheilung eine komplexe und straff orchestrierte Zusammenfassung von Ereignissen beinhaltet, die über einen langen Zeitraum auftreten³, ist die Verwendung valider Tiermodelle von zentraler Bedeutung, um unser Verständnis der Mechanismen, die den Erfolg der Knochenreparatu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol 70º	Merck	109-56-8	Or any general available supplier
Canada balsam (mounting medium)	Merck	C1795	Or any general available supplier
Cefazoline	ABL	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Coverslip	Merck	CSL284525	Or any general available supplier
Dental X-Ray Generator	Focus	-	Sold by Instrumentarium Dental Inc.
DEPC water	Merck	W4502	Or any general available supplier
Dissecting Scissor	ABC Instrumentos	0327	Similar brands of the item may be used according to local availability
EDTA	Vetec	60REAVET014340	Similar brands of the item may be used according to local availability
Eosin solution	Laborclin	EA-65	Similar brands of the item may be used according to local availability
Ethanol P.A	Vetec	60REAVET012053	Similar brands of the item may be used according to local availability
Gauze pads	Cremer	Not applicable	Or any general available supplier
Harris Hematoxylin Solution	Laborclin	620503	Similar brands of the item may be used according to local availability
Heating pad	Tonkey Electrical Technology	E114273	Similar brands of the item may be used according to local availability
Histological slides	Merck	CSL294875X25	Or any general available supplier
Histology cassettes	Merck	H0542-1CS	Or any general available supplier
Hydrochloric acid - 37%	Merck	258148	Similar brands of the item may be used according to local availability
Insulin syringe	BD	324918	Or any general available supplier
Iodopovidone sponge	Rioquímica	372106	Or any general available supplier
Ketamine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Lacribel collyrium	Cristalia	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Microtome	Leica	149AUTO00C1
Mouse Tooth Forceps Tweezer	ABC Instrumentos	0164	Similar brands of the item may be used according to local availability
Needle 26 G	BD	2239	Or any general available supplier
Needle Holder	Golgran	135-18	Similar brands of the item may be used according to local availability
Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1546-NT	Or any general available supplier
Paraffin	Exodo	8002 - 74 - 2	Similar brands of the item may be used according to local availability
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4	Similar brands of the item may be used according to local availability
PBS 1x	Lonza	BE17-516F	Similar brands of the item may be used according to local availability
Resorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1596-45B	Or any general available supplier
Rod Wire SS CrNi 0.016"	Orthometric	56.50.2016
Scalpel nº 11	Descarpak	15782	Or any general available supplier
Serrated Tip Tweezer	Quinelato	QC.404.12	Similar brands of the item may be used according to local availability
Shaver	Phillips	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Surgical tape	3M	2734	Or any general available supplier
Surgical tnt field	Polarfix	6153	Or any general available supplier
Tramadol hydrochloride	Teuto	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Water bath for histology	Leica	HI1210
Xylazine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Xylene	Dinamica	60READIN001105	Similar brands of the item may be used according to local availability