Stabilire un modello di frattura del femore diafisario nei topi

Riepilogo

Questo protocollo descrive una procedura chirurgica per l'instaurazione di una frattura diafisaria nel femore dei topi, che viene stabilizzata con un filo intramidollare, per studi di guarigione delle fratture.

Abstract

Le ossa hanno una notevole capacità rigenerativa. Tuttavia, la guarigione delle fratture è un processo complesso e, a seconda della gravità delle lesioni, dell'età e dello stato di salute generale del paziente, possono verificarsi fallimenti, che portano a un'unione ritardata o alla mancata unione. A causa del crescente numero di fratture derivanti da traumi ad alta energia e dall'invecchiamento, è urgentemente necessario lo sviluppo di strategie terapeutiche innovative per migliorare la riparazione ossea basate sulla combinazione di cellule staminali scheletriche/mesenchimali/stromali e biomateriali biomimetici. A tal fine, l'uso di modelli animali affidabili è fondamentale per comprendere meglio i principali meccanismi cellulari e molecolari che determinano gli esiti di guarigione. Di tutti i modelli, il topo è il modello di ricerca preferito perché offre un'ampia varietà di ceppi transgenici e reagenti per l'analisi sperimentale. Tuttavia, l'instaurazione di fratture nei topi può essere tecnicamente impegnativa a causa delle loro piccole dimensioni. Pertanto, questo articolo mira a dimostrare le procedure per l'instaurazione chirurgica di una frattura del femore diafisario nei topi, che è stabilizzata con un filo intramidollare e assomiglia al più comune processo di riparazione ossea, attraverso la formazione di callo cartilagineo.

Introduzione

Lo scheletro è un organo vitale e funzionalmente versatile. Le ossa dello scheletro consentono la postura e il movimento del corpo, proteggono gli organi interni, producono ormoni che integrano le risposte fisiologiche e sono il sito dell'emopoiesi e dell'accumulo di minerali¹. In caso di frattura, le ossa hanno una notevole capacità di rigenerarsi e ripristinare completamente la loro forma e funzione pre-lesione. Il processo di guarigione inizia con la formazione di un ematoma e di una risposta infiammatoria, che induce l'attivazione e la condensazione delle cellule staminali/progenitrici scheletriche dal periostio, dall'endostio e dal midollo osseo e la loro successiva differenziazione per formare il callo cartilagineo molle. Il ponte delle estremità fratturate avviene quindi attraverso un processo che assomiglia alla formazione dell'osso endocondrale, in cui l'impalcatura cartilaginea si espande e poi si mineralizza, formando il callo osseo duro. Infine, il callo duro viene gradualmente rimodellato da osteoclasti e osteoblasti per ripristinare la struttura ossea originale ^2,3.

Sebbene il processo di guarigione della frattura sia abbastanza robusto, comporta un'intricata sommatoria di eventi ed è significativamente influenzato da diversi fattori individuali, tra cui lo stato di salute generale, l'età e il sesso del paziente, nonché fattori di lesione, come la modalità di stabilizzazione meccanica dell'osso fratturato, l'insorgenza di infezioni e la gravità della lesione dei tessuti molli circostanti^{4, 5,6}. Pertanto, i fallimenti sono comuni, portando allo sviluppo della non unione, che ha un forte impatto sulla riabilitazione del paziente e sulla qualità della vita ^7,8. A causa del crescente numero di fratture a causa di traumi ad alta energia e dell'invecchiamento, nonché degli alti costi dei trattamenti, le fratture non unionali sono diventate un peso per i sistemi sanitari di tutto il mondo ^9,10. Questo onere crescente evidenzia l'urgente necessità di strategie terapeutiche innovative per migliorare la riparazione ossea^11,12 basate sulla combinazione di cellule staminali scheletriche/mesenchimali/stromali e biomateriali biomimetici^13,14.

Nel perseguimento di questo obiettivo, i modelli animali sono stati ampiamente utilizzati in studi volti a comprendere la biologia fondamentale dei meccanismi di guarigione delle fratture e in studi preclinici proof-of-concept volti a ideare nuove strategie terapeutiche per promuovere la riparazione ossea 15,16,17. I modelli di piccoli animali, come il topo, sono eccellenti per gli studi di guarigione delle fratture grazie all'ampia disponibilità di ceppi e reagenti geneticamente modificati per le analisi sperimentali e ai loro bassi costi di manutenzione. Inoltre, i topi hanno un rapido decorso temporale di guarigione, che consente l'analisi temporale di tutte le fasi del processo di riparazione¹⁵. Tuttavia, le piccole dimensioni dell'animale possono rappresentare una sfida per la produzione chirurgica di fratture con modalità di fissazione simili a quelle applicate nell'uomo. Questo protocollo descrive un modello semplice e a basso costo di guarigione delle fratture nei topi utilizzando un'osteotomia femorale aperta stabilizzata con un filo intramidollare, che assomiglia al più comune processo di riparazione ossea, attraverso la formazione di callo cartilagineo, e può essere utilizzato sia in indagini di base che traslazionali in cui è richiesto l'accesso al sito di frattura.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato per l'Uso e la Cura degli Animali del Centro per le Scienze della Salute dell'Università Federale di Rio de Janeiro (Numero di Protocollo 101/21). In questo studio sono stati utilizzati topi maschi Balb/c a 10-12 settimane di età (25-30 g di peso corporeo). La procedura chirurgica richiede circa 15-20 minuti per topo. Prima di ogni procedura, gli strumenti necessari (elencati nella Tabella dei materiali) devono essere disposti su un campo chirurgico sterile che copre il tavolo operatorio (Figura 1A). Gli strumenti chirurgici metallici devono essere sterilizzati in autoclave in buste autosigillanti a 123 °C per 30 min. Gli articoli monouso, come aghi e garze, devono essere procurati sterili.

1. Preparazione dell'animale

1. Anestetizzare il topo ed eseguire l'analgesia in conformità con il regime raccomandato dal veterinario approvato dal programma istituzionale di cura e utilizzo degli animali.
   NOTA: Se disponibile, è preferibile eseguire l'anestesia per inalazione. Una descrizione del protocollo per l'anestesia inalatoria può essere trovata nel rapporto di Ewald et ^al.18. Tuttavia, se la frattura viene prodotta per studi di osteoimmunologia, questo tipo di anestesia deve essere evitato, poiché l'evidenza mostra che diversi anestetici volatili, tra cui l'isoflurano, influenzano l'attività delle cellule immunitarie sia innate che adattative^19,20.
2. Una volta che il mouse è immobile, radere la gamba sinistra, quindi trasferirla sul tavolo operatorio su un termoforo caldo (vedere Tabella dei materiali) a 37 °C coperto da un telo chirurgico sterile.
3. Eseguire il lavaggio antisettico dell'area dell'incisione strofinando la pelle con una spugna di iodopovidone al 10%. La disinfezione deve iniziare lungo la linea di incisione ed estendersi verso l'esterno in modo circolare. Asciugare l'area strofinata con garze sterili, lavare con etanolo al 70% e asciugare nuovamente con una garza sterile. Ripetere questa procedura tre volte.
4. Posizionare il mouse nella posizione di decubito laterale destra e immobilizzare le zampe con del nastro chirurgico (Figura 1C).
5. Drappeggiare il topo in modo che sia visibile solo la regione dell'incisione (Figura 1D).

2. Procedura chirurgica

1. Durante la procedura chirurgica, controllare costantemente che il topo respiri e fornire colliri negli occhi per evitare la secchezza e impedire che il topo diventi cieco.
   NOTA: L'intera procedura chirurgica di solito richiede ~ 15-20 minuti se eseguita da un chirurgo qualificato. Pertanto, l'applicazione del collirio una volta all'inizio della procedura dovrebbe essere sufficiente. Se la procedura inizia a diventare più lunga, è possibile eseguire ulteriori applicazioni ogni volta che viene identificato che gli occhi stanno iniziando a seccarsi.
2. Prima di procedere all'incisione, valutare la profondità dell'anestetico pizzicando la coda per controllare il riflesso di risposta al dolore e ispezionando visivamente la frequenza respiratoria (contando il numero di movimenti toracici al minuto)²¹. In anestesia ottimale, il topo non dovrebbe rispondere a un pizzicamento della coda e la frequenza respiratoria deve essere di circa 55-65 respiri/min²¹.
3. Praticare un'incisione pararotulea laterale cutanea di 1 cm con una lama di bisturi (numero 11, vedi tabella dei materiali), iniziando a livello della tuberosità tibiale e estendendosi fino al livello della rotula e poi, per una distanza uguale, verso il femore distale (Figura 1E).
4. Con le forbici smussate, sezionare la fascia sottocutanea attorno alla linea di incisione per esporre la fascia lata, il vasto laterale e i muscoli bicipiti femorali²².
5. Con la lama del bisturi numero 11, praticare un'altra incisione nella fascia lata simile a quella praticata nella pelle, iniziando a livello della tuberosità tibiale e percorrendo l'aponeurosi del bicipite femorale fino al livello del femore distale, per aprire la capsula articolare e accedere all'articolazione del ginocchio (Figura 1F, G).
6. Eseguire una lussazione mediale della rotula posizionando la punta di una pinzetta di precisione a punta seghettata diritta (vedi Tabella dei materiali) sotto di essa e spingendola di lato insieme ai legamenti rotuleo e quadricipite, esponendo così i condili del femore (Figura 1H).
7. Tenendo il femore con una pinzetta a punta seghettata, flettere il ginocchio a 90° e perforare manualmente il canale intramidollare del femore attraverso la fossa intercondilare con un ago ipodermico da 26 G (Figura 1I, J).
8. Mantenendo il ginocchio flesso a 90°, inserire un segmento di 1,0 cm di un filo di acciaio inossidabile da 0,016 pollici (0,40 mm) (Figura 1K, inserto) (vedere la tabella dei materiali) attraverso l'apertura nel canale midollare del femore verso il grande trocantere (Figura 1K).
   NOTA: Mantenere il ginocchio flesso a 90° è fondamentale per il corretto inserimento del filo nel canale midollare. In caso contrario, il filo fuoriesce dall'osso e le lesioni dei tessuti molli circostanti.
9. Regolare l'estremità distale pre-piegata del filo con una pinzetta a punta seghettata diritta per fissarlo saldamente nel condilo laterale (Figura 1L). Oltre a fissare il filo in posizione, l'estremità piegata faciliterà la rimozione post-mortem del filo.
10. Separare i muscoli del vasto laterale e del bicipite femorale attraverso la dissezione dell'estremità smussata con una pinzetta a punta seghettata per accedere alla diafisi distale del femore (Figura 1M).
11. Inserire una forbice da dissezione attorno alla diafisi del femore con un angolo di circa 90° ed eseguire delicatamente un'osteotomia corticale completa (Figura 1N).
    NOTA: I femori dei topi sono facilmente tagliabili. Astenersi dall'applicare una forza eccessiva durante l'osteotomia per evitare la flessione del filo intramidollare e l'estesa sminuzzatura della frattura.
12. Riposizionare i muscoli e la rotula spingendo la punta di una pinzetta di precisione dritta e seghettata sopra la regione del condilo.
13. Chiudere la fascia muscolare con una sutura riassorbibile 6-0 e poi la pelle utilizzando una sutura di nylon 6-0 (vedi Tabella dei materiali), entrambe in modo semplice interrotto (Figura 1O).
14. Trasferisci il mouse in una gabbia pulita individuale per il recupero. Una volta sveglio, il mouse deve essere in grado di muoversi liberamente con un carico illimitato.
15. Nei giorni successivi all'intervento, eseguire l'analgesia secondo il regime raccomandato dal veterinario approvato dal programma istituzionale di cura e utilizzo degli animali.

3. Imaging a raggi X

1. Anestetizzare il topo come descritto al punto 1.1.
   NOTA: Se la radiografia viene eseguita subito dopo la procedura chirurgica e il topo è ancora in anestesia ottimale (passaggio 2.2), non è necessario eseguire questo passaggio.
2. Per una visione laterale pulita del femore fratturato, posizionare il topo in posizione di decubito dorsale e tirare leggermente di lato l'arto posteriore operato.
3. Immobilizzare le zampe con del nastro chirurgico.
4. Eseguire l'imaging radiografico secondo il protocollo dell'apparecchiatura disponibile.
   NOTA: Per questo studio, è stato utilizzato un generatore di raggi X dentale digitale con i seguenti parametri: tensione di 70 kVp, corrente di 7 mA e tempo di esposizione di 0,2 s.

4. Elaborazione istologica e colorazione H&E

1. Eutanasiare i topi con un sovradosaggio intraperitoneale di anestetici (fare riferimento al regime raccomandato dal veterinario approvato dal programma istituzionale per la cura e l'uso degli animali). Dopo aver controllato la profondità dell'anestesia con un pizzico di coda, eseguire la lussazione cervicale. Successivamente, raccogliere l'osso fratturato, rimuovere il tessuto muscolare circostante^{in eccesso 23} e fissare l'osso in una soluzione di formalina tamponata al 10% (pH 7,4) per 3 giorni.
2. Collocare i campioni ossei in cassette istologiche etichettate (vedere la tabella dei materiali) e immergerli in EDTA al 10% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4, per 14 giorni per la decalcificazione. Cambiare la soluzione decalcificante due volte a settimana.
3. Disidratare i campioni in una serie di soluzioni di concentrazioni crescenti di etanolo (70%, 80%, 90%, 100%, 100%) per 1 ora ciascuna.
4. Pulire i campioni in due bagni sequenziali di xilene per 30 minuti ciascuno.
5. Per l'infiltrazione della cera, immergere i campioni in due bagni di paraffina sequenziali a 60 °C per 30 minuti. Successivamente, incorporare i campioni nei blocchi per il sezionamento²⁴.
   NOTA: Per visualizzare meglio il callo, incorporare l'osso con il suo asse lungo in posizione orizzontale per consentire i tagli longitudinali.
6. Tagliare il tessuto in sezioni spesse 4 μm con un microtomo (vedi Tabella dei materiali).
7. Far galleggiare le sezioni in un bagnomaria a 56 °C e montare le sezioni su vetrini istologici (vedi Tabella dei materiali).
8. Per la colorazione H&E, deparaffinare i vetrini in tre bagni sequenziali di xilene per 5 minuti e reidratare il tessuto in una serie di soluzioni di concentrazioni di etanolo decrescenti (95%, 80% e 70%) per 5 minuti.
9. Sciacquare i vetrini in acqua di rubinetto per 30 secondi, colorare i vetrini con ematossilina Harris (vedere la tabella dei materiali) per 6 minuti e sciacquarli in acqua di rubinetto per altri 30 secondi.
10. Immergere i vetrini in etanolo all'1% di acido cloridrico per 30 secondi e poi in etanolo al 70% per 30 secondi.
11. Colorare con eosina (vedi Tabella dei materiali) per 2 minuti e lavare con acqua di rubinetto per 30 secondi.
12. Disidratare i vetrini con etanolo (70%, 80% e 95% per 5 minuti) e chiarificare con due bagni di xilene per 5 minuti ciascuno.
13. Per il montaggio, gocciolare una o due gocce di mezzo di montaggio (vedere la Tabella dei materiali) su ciascun vetrino e coprire il vetrino con un vetrino coprioggetti pulito.

Risultati

Il modo più semplice e immediato per valutare il successo dell'intervento chirurgico nel produrre la frattura è la radiografia. Le radiografie possono essere eseguite immediatamente dopo l'intervento, con il topo ancora sotto anestesia, e successivamente 7, 14 giorni e 21 giorni dopo la frattura per valutare la formazione e la progressione del callo. I modelli di frattura accettabili sono quelli in cui le cortecce sono completamente rotte, i fili sono posizionati correttamente all'interno del canale midollare e le line...

Discussione

Con l'aumento del numero di fratture in tutto il mondo ^9,10,25, i trattamenti innovativi per la mancata unione stanno diventando sempre più urgenti. Poiché la guarigione delle fratture comporta una somma complessa e strettamente orchestrata di eventi che si verificano su un lungo arco temporale³, l'uso di modelli animali validi è fondamentale per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi che det...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol 70º	Merck	109-56-8	Or any general available supplier
Canada balsam (mounting medium)	Merck	C1795	Or any general available supplier
Cefazoline	ABL	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Coverslip	Merck	CSL284525	Or any general available supplier
Dental X-Ray Generator	Focus	-	Sold by Instrumentarium Dental Inc.
DEPC water	Merck	W4502	Or any general available supplier
Dissecting Scissor	ABC Instrumentos	0327	Similar brands of the item may be used according to local availability
EDTA	Vetec	60REAVET014340	Similar brands of the item may be used according to local availability
Eosin solution	Laborclin	EA-65	Similar brands of the item may be used according to local availability
Ethanol P.A	Vetec	60REAVET012053	Similar brands of the item may be used according to local availability
Gauze pads	Cremer	Not applicable	Or any general available supplier
Harris Hematoxylin Solution	Laborclin	620503	Similar brands of the item may be used according to local availability
Heating pad	Tonkey Electrical Technology	E114273	Similar brands of the item may be used according to local availability
Histological slides	Merck	CSL294875X25	Or any general available supplier
Histology cassettes	Merck	H0542-1CS	Or any general available supplier
Hydrochloric acid - 37%	Merck	258148	Similar brands of the item may be used according to local availability
Insulin syringe	BD	324918	Or any general available supplier
Iodopovidone sponge	Rioquímica	372106	Or any general available supplier
Ketamine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Lacribel collyrium	Cristalia	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Microtome	Leica	149AUTO00C1
Mouse Tooth Forceps Tweezer	ABC Instrumentos	0164	Similar brands of the item may be used according to local availability
Needle 26 G	BD	2239	Or any general available supplier
Needle Holder	Golgran	135-18	Similar brands of the item may be used according to local availability
Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1546-NT	Or any general available supplier
Paraffin	Exodo	8002 - 74 - 2	Similar brands of the item may be used according to local availability
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4	Similar brands of the item may be used according to local availability
PBS 1x	Lonza	BE17-516F	Similar brands of the item may be used according to local availability
Resorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1596-45B	Or any general available supplier
Rod Wire SS CrNi 0.016"	Orthometric	56.50.2016
Scalpel nº 11	Descarpak	15782	Or any general available supplier
Serrated Tip Tweezer	Quinelato	QC.404.12	Similar brands of the item may be used according to local availability
Shaver	Phillips	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Surgical tape	3M	2734	Or any general available supplier
Surgical tnt field	Polarfix	6153	Or any general available supplier
Tramadol hydrochloride	Teuto	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Water bath for histology	Leica	HI1210
Xylazine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Xylene	Dinamica	60READIN001105	Similar brands of the item may be used according to local availability