マウスにおける骨幹大腿骨骨折モデルの確立

要約

このプロトコルは、骨折治癒研究のために、髄内ワイヤーで安定化されるマウスの大腿骨に骨幹骨折を確立するための外科的処置を説明しています。

要約

骨には大きな再生能力があります。しかし、骨折治癒は複雑なプロセスであり、病変の重症度や患者の年齢や全体的な健康状態によっては、失敗が発生し、癒合の遅延や癒合不全につながる可能性があります。高エネルギー外傷や加齢による骨折の増加により、骨格/間葉系幹細胞/間質細胞と生体模倣生体材料の組み合わせに基づく骨修復を改善する革新的な治療戦略の開発が急務となっています。この目的のために、信頼できる動物モデルの使用は、治癒結果を決定する主要な細胞および分子メカニズムをよりよく理解するための基本です。すべてのモデルの中で、マウスは実験的分析のための多種多様なトランスジェニック株と試薬を提供するため、好ましい研究モデルです。しかし、マウスの骨折の確立は、サイズが小さいため、技術的に困難な場合があります。したがって、この記事は、軟骨カルスの形成を通じて、髄内ワイヤーで安定化し、最も一般的な骨修復プロセスに類似しているマウスの骨幹骨折の外科的確立の手順を示すことを目的としています。

概要

骨格は重要で機能的に用途の広い器官です。骨格の骨は、体の姿勢と動きを可能にし、内臓を保護し、生理学的反応を統合するホルモンを産生し、造血と^{ミネラル貯蔵の}部位です1。骨折した場合、骨は再生し、損傷前の形態と機能を完全に回復させる驚くべき能力を持っています。治癒過程は、血腫の形成と炎症反応から始まり、骨膜、骨内膜、骨髄からの骨格幹細胞/前駆細胞の活性化と凝縮、およびその後の分化が誘発され、軟軟骨性カルスが形成されます。骨折した端の架橋は、軟骨骨の足場が膨張し、次に石灰化し、硬い骨カルスを形成する軟骨内骨形成に似たプロセスを通じて起こります。最後に、硬カルスは破骨細胞と骨芽細胞によって徐々にリモデリングされ、元の骨構造が復元されます^2,3。

骨折治癒過程はかなり頑健であるが、事象の複雑な総和を伴い、患者の一般的な健康状態、年齢、性別、ならびに骨折した骨の機械的安定化の様式、感染の発生、周囲の軟部^{組織の損傷の}重症度などの傷害要因など、いくつかの個別要因に大きく影響される^4。5、6。したがって、失敗は一般的であり、非癒合の発症につながり、患者のリハビリテーションと生活の質に大きな影響を与えます^7,8。高エネルギーの外傷と加齢の結果としての骨折の数の増加、および治療費の高騰により、非癒合骨折は世界中の医療システムの負担になっています^9,10。この負担の増加は、骨格/間葉系幹細胞/間質細胞と生体模倣生体材料の組み合わせに基づく骨修復を改善するための革新的な治療戦略の緊急の必要性を浮き彫りにしています^11,12。

この目標を追求するために、動物モデルは、骨折治癒メカニズムの基礎生物学を理解することを目的とした研究や、骨修復を促進するための新しい治療戦略を考案することを目的とした概念実証の前臨床試験で広く使用されています^15,16,17。マウスなどの小動物モデルは、実験分析用の遺伝子組み換え株や試薬が広く入手でき、メンテナンスコストが低いため、骨折治癒研究に最適です。さらに、マウスは急速な治癒時間経過を有し、これにより、修復過程のすべての段階の時間的分析が可能になる¹⁵。しかし、動物のサイズが小さいため、人間に適用されるものと同様の固定モードを備えた骨折の外科的生成に課題をもたらす可能性があります。このプロトコルは軟骨のカルスの形成によって共通の骨の修理プロセスに類似している髄内ワイヤーと安定する開いた大腿骨の骨切り術を使用してマウスのひびの治療の簡単で、安価モデルを記述し、ひびの場所へのアクセスが要求される基本的なおよびtranslational調査で使用することができる。

プロトコル

すべての実験は、リオデジャネイロ連邦大学健康科学センターの動物利用およびケア委員会によって承認されました(プロトコル番号101/21)。この研究では、10〜12週齢(体重25〜30g)の雄のBalb / cマウスを使用しました。外科的処置は、マウスあたり約15〜20分かかります。各手順の前に、必要な器具( 材料表に記載)を手術台を覆う無菌手術野に整理する必要があります(図1A)。金属製の手術器具は、123°Cで30分間、セルフシールエンベロープに入れてオートクレーブ滅菌する必要があります。針やガーゼパッドなどの使い捨てアイテムは、滅菌状態で調達する必要があります。

1.動物の調製

1. マウスに麻酔をかけ、動物管理および使用プログラムによって承認された獣医師が推奨するレジメンに従って鎮痛を行います。
   注:可能であれば、吸入麻酔を行うことが望ましいです。.吸入麻酔のプロトコルの説明は、Ewald et ^al.18 による報告に記載されています。ただし、骨折が骨免疫学研究のために生成される場合、イソフルランを含むいくつかの揮発性麻酔薬が自然免疫細胞と獲得免疫細胞の両方の活性に影響を与えることを示す証拠があるため、このタイプの麻酔は避ける必要があります^19,20。
2. マウスが動かなくなったら、左脚を剃り、滅菌手術用ドレープで覆われた37°Cの温かい加熱パッド( 材料表を参照)で手術台に移します。
3. 10%ポビドンヨードスポンジで皮膚をこすって切開部の消毒洗浄を行います。消毒は切開線に沿って開始し、円形のパターンで外側に拡張する必要があります。滅菌ガーゼパッドでこすった部分を乾かし、70%エタノールで洗浄し、滅菌ガーゼパッドで再度乾燥させます。この手順を 3 回繰り返します。
4. マウスを右外側褥瘡の位置に置き、サージカルテープで足を固定します(図1C)。
5. 切開部のみが見えるようにマウスをドレープします(図1D)。

2.外科的処置

1. 外科的処置中は、マウスが呼吸していることを常に確認し、乾燥を防ぎ、マウスが失明するのを防ぐために、目に点眼薬をさします。
   注:訓練を受けた外科医が行う場合、外科的処置全体は通常15~20分かかります。したがって、施術の開始時に一度点眼薬を塗るだけで十分です。手順が長くなり始めたら、目が乾燥し始めていることが特定されたときに、追加のアプリケーションを実行できます。
2. 切開に進む前に、尾部をつまんで疼痛反応反射を確認し、呼吸数を目視で検査する(1分間の胸部運動回数を数える)ことで麻酔深度を評価する²¹。最適な麻酔下では、マウスは尾のつまみに反応してはならず、呼吸速度は約55〜65呼吸/分でなければなりません²¹。
3. メスの刃(番号11、 資料表を参照)で、脛骨結節のレベルから膝蓋骨のレベルまで、そして等距離で大腿骨遠位部に向かって1cmの皮膚外側傍膝蓋骨切開を行います(図1E)。
4. 鈍い端のはさみで、切開線の周りの皮下筋膜を解剖して、大腿筋膜、外側広筋、および大腿上腕二頭筋を露出させます²²。
5. メスの刃番号11を使用して、脛骨結節のレベルから始まり、大腿骨上腕二頭筋腱膜に沿って大腿骨遠位部のレベルまで、皮膚に行われたものと同様の筋膜を大腿骨に別の切開を行い、関節嚢を開き、膝関節にアクセスします(図1F、G)。
6. 膝蓋骨の内側脱臼術は、まっすぐな鋸歯状の精密先端ピンセット( 材料表を参照)の先端を下に置き、膝蓋骨と大腿四頭筋の靭帯と一緒に横に押して、大腿骨の顆を露出させることにより行います(図1H)。
7. 鋸歯状の先端ピンセットで大腿骨を保持し、膝を90°に曲げ、26Gの皮下注射針で大腿骨の髄内管を顆間窩に手動で穿孔します(図1I、J)。
8. 膝を90°に曲げた状態で、0.016インチ(0.40 mm)のステンレス鋼棒ワイヤー(図1K、挿入物)( 資料表を参照)の1.0cmのセグメントを開口部から大転子に向かって大腿骨の髄管に挿入します(図1K)。
   注意: 膝を90°に曲げたままにすることは、ワイヤーを髄管に適切に挿入するために重要です。そうしないと、ワイヤーが骨や周囲の軟部組織病変から血管外に漏出します。
9. まっすぐな鋸歯状の先端ピンセットでワイヤーの事前に曲がった遠位端を調整し、外側顆にしっかりと固定します(図1L)。ワイヤーを所定の位置に固定することに加えて、曲がった四肢はワイヤーの死後の取り外しを容易にします。
10. 鋸歯状の先端ピンセットで鈍末端を解剖し、外側広筋と大腿上腕二頭筋を分離し、大腿骨の遠位骨幹にアクセスします(図1M)。
11. 大腿骨骨幹の周囲に解剖ハサミを約90°の角度で挿入し、完全な皮質骨切り術を静かに行います(図1N)。
    注:マウスの大腿骨は簡単に切断されます。骨切り術中に過度の力を加えることは、髄内ワイヤーの曲がりや広範囲の骨折の粉砕を避けるために控えてください。.
12. まっすぐな鋸歯状の精密先端ピンセットの先端を顆頭領域に押して、筋肉と膝蓋骨の位置を変えます。
13. 6-0の吸収性縫合糸で筋膜を閉じ、次に6-0のナイロン縫合糸( 材料表を参照)を使用して皮膚を、どちらも単純な中断方法で閉じます(図1O)。
14. マウスを個別の清潔なケージに移して回復します。目覚めたら、マウスは無制限の体重負荷で自由に動くことができなければなりません。
15. 手術後数日間は、獣医が推奨するレジメンに従って鎮痛を行います 施設の動物のケアと使用プログラムによって承認されました。

3. X線イメージング

1. ステップ1.1の説明に従ってマウスを麻酔します。
   注:外科的処置の直後にX線撮影が行われ、マウスがまだ最適な麻酔下にある場合(ステップ2.2)、このステップを実行する必要はありません。
2. 骨折した大腿骨をきれいに横向きに見るには、マウスを背側褥瘡の位置に置き、手術後肢を横に少し引っ張ります。
3. サージカルテープで足を固定します。
4. 利用可能な機器プロトコルに従ってX線撮影を行います。
   注:この研究では、デジタル歯科用X線発生装置を、電圧70 kVp、電流7 mA、および0.2秒の露光時間で使用しました。

4. 組織学処理とH&E染色

1. 麻酔薬の腹腔内過剰摂取でマウスを安楽死させます(施設の動物ケアおよび使用プログラムによって承認された獣医が推奨するレジメンを参照してください)。テールピンチで麻酔の深さを確認した後、子宮頸部脱臼を行います。次に、骨折した骨を採取し、周囲の余分な筋肉組織²³を除去し、10%緩衝ホルマリン溶液(pH7.4)で3日間骨を固定する。
2. 骨サンプルをラベル付き組織学カセット( 材料表を参照)に入れ、pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の10%EDTAに14日間浸漬して脱灰します。脱灰液は週に2回交換してください。
3. エタノール濃度を上昇させる一連の溶液(70%、80%、90%、100%、100%)でサンプルをそれぞれ1時間脱水します。
4. サンプルをキシレンの2つの連続浴でそれぞれ30分間透明にします。
5. ワックスを浸潤させるには、サンプルを60°Cの2つの連続パラフィン浴に30分間浸漬します。次に、サンプルをブロックに埋め込んで切断します²⁴.
   注:カルスを見やすくするには、長軸を水平位置にして骨を埋め込み、縦方向のカットを可能にします。
6. ミクロトームで組織を厚さ4μmの切片に切断します( 材料表を参照)。
7. 切片を56°Cのウォーターバスに浮かべ、切片を組織学的スライドに取り付けます( 材料表を参照)。
8. H&E染色では、キシレンの3つの連続浴でスライドを脱パラフィンして5分間、エタノール濃度を低下させる一連の溶液(95%、80%、70%)で5分間組織を再水和します。
9. スライドを水道水で30秒間すすぎ、スライドをハリスヘマトキシリン( 材料表を参照)で6分間染色し、さらに水道水で30秒間すすぎます。
10. スライドを1%塩酸のエタノールに30秒間浸し、次に70%エタノールに30秒間浸します。
11. エオシン( 材料表参照)で2分間染色し、水道水で30秒間洗浄します。
12. スライドをエタノール(70%、80%、95%)で5分間脱水し、キシレンの浴2回でそれぞれ5分間清澄化します。
13. 取り付けの場合は、各スライドに1〜2滴の封入剤( 材料表を参照)を滴下し、スライドを清潔なカバーガラスで覆います。

結果

骨折の原因となる外科的処置の成功を評価する最も簡単で直接的な方法は、X線画像診断です。X線写真は、マウスを麻酔下に置いたまま手術直後に実施し、その後、骨折後7日、14日、および21日後に実施して、カルスの形成と進行を評価することができます。許容される骨折パターンは、皮質が完全に破裂し、ワイヤーが髄管内に正しく配置され、骨折線が横方向(骨の軸に対して90°の角度)、...

ディスカッション

世界中で骨折の数が増加するにつれて ^9,10,25、非癒合症の革新的な治療法はますます緊急性を増しています。骨折治癒には、長い時間スケールで発生する事象の複雑で緊密に調整された総和が含まれるため³、有効な動物モデルの使用は、骨修復の成功を決定するメカニズムの理解を深め、効果的な薬と治...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol 70º	Merck	109-56-8	Or any general available supplier
Canada balsam (mounting medium)	Merck	C1795	Or any general available supplier
Cefazoline	ABL	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Coverslip	Merck	CSL284525	Or any general available supplier
Dental X-Ray Generator	Focus	-	Sold by Instrumentarium Dental Inc.
DEPC water	Merck	W4502	Or any general available supplier
Dissecting Scissor	ABC Instrumentos	0327	Similar brands of the item may be used according to local availability
EDTA	Vetec	60REAVET014340	Similar brands of the item may be used according to local availability
Eosin solution	Laborclin	EA-65	Similar brands of the item may be used according to local availability
Ethanol P.A	Vetec	60REAVET012053	Similar brands of the item may be used according to local availability
Gauze pads	Cremer	Not applicable	Or any general available supplier
Harris Hematoxylin Solution	Laborclin	620503	Similar brands of the item may be used according to local availability
Heating pad	Tonkey Electrical Technology	E114273	Similar brands of the item may be used according to local availability
Histological slides	Merck	CSL294875X25	Or any general available supplier
Histology cassettes	Merck	H0542-1CS	Or any general available supplier
Hydrochloric acid - 37%	Merck	258148	Similar brands of the item may be used according to local availability
Insulin syringe	BD	324918	Or any general available supplier
Iodopovidone sponge	Rioquímica	372106	Or any general available supplier
Ketamine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Lacribel collyrium	Cristalia	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Microtome	Leica	149AUTO00C1
Mouse Tooth Forceps Tweezer	ABC Instrumentos	0164	Similar brands of the item may be used according to local availability
Needle 26 G	BD	2239	Or any general available supplier
Needle Holder	Golgran	135-18	Similar brands of the item may be used according to local availability
Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1546-NT	Or any general available supplier
Paraffin	Exodo	8002 - 74 - 2	Similar brands of the item may be used according to local availability
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4	Similar brands of the item may be used according to local availability
PBS 1x	Lonza	BE17-516F	Similar brands of the item may be used according to local availability
Resorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1596-45B	Or any general available supplier
Rod Wire SS CrNi 0.016"	Orthometric	56.50.2016
Scalpel nº 11	Descarpak	15782	Or any general available supplier
Serrated Tip Tweezer	Quinelato	QC.404.12	Similar brands of the item may be used according to local availability
Shaver	Phillips	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Surgical tape	3M	2734	Or any general available supplier
Surgical tnt field	Polarfix	6153	Or any general available supplier
Tramadol hydrochloride	Teuto	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Water bath for histology	Leica	HI1210
Xylazine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Xylene	Dinamica	60READIN001105	Similar brands of the item may be used according to local availability