JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данном протоколе описывается хирургическая процедура по установлению диафизарного перелома бедренной кости мышей, которая стабилизируется интрамедуллярной проволокой, для исследований заживления перелома.

Аннотация

Кости обладают значительной регенеративной способностью. Однако заживление переломов является сложным процессом, и в зависимости от тяжести поражений, возраста и общего состояния здоровья пациента могут возникать сбои, приводящие к отсроченному сращению или несращению. В связи с растущим числом переломов, возникающих в результате высокоэнергетических травм и старения, срочно необходима разработка инновационных терапевтических стратегий для улучшения восстановления костей, основанных на комбинации скелетных/мезенхимальных стволовых/стромальных клеток и биомиметических биоматериалов. С этой целью использование надежных моделей на животных имеет основополагающее значение для лучшего понимания ключевых клеточных и молекулярных механизмов, определяющих результаты лечения. Из всех моделей мышь является предпочтительной моделью исследования, поскольку она предлагает широкий спектр трансгенных штаммов и реагентов для экспериментального анализа. Тем не менее, установление переломов у мышей может быть технически сложной задачей из-за их небольшого размера. Поэтому целью данной статьи является демонстрация процедур хирургического установления диафизарного перелома бедренной кости у мышей, который стабилизируется интрамедуллярной проволокой и напоминает наиболее распространенный процесс восстановления кости, посредством образования хрящевой мозоли.

Введение

Скелет является жизненно важным и функционально универсальным органом. Кости скелета обеспечивают осанку и движения тела, защищают внутренние органы, вырабатывают гормоны, которые интегрируют физиологические реакции, и являются местом кроветворенияи накопления минералов. При переломе кости обладают замечательной способностью к регенерации и полному восстановлению своей формы и функции до травмы. Процесс заживления начинается с образования гематомы и воспалительной реакции, которая индуцирует активацию и конденсацию скелетных стволовых/прогениторных клеток из надкостницы, эндостея и костного мозга и их последующую дифференцировку с образованием мягкой хрящевой мозоли. Сращивание сломанных концов происходит с помощью процесса, напоминающего формирование эндохондральной кости, при котором хрящевой каркас расширяется, а затем минерализуется, образуя твердую костную мозоль. Наконец, твердая мозоль постепенно ремоделируется остеокластами и остеобластами для восстановления первоначальной структуры кости 2,3.

Несмотря на то, что процесс заживления перелома является достаточно прочным, он включает в себя сложную совокупность событий и в значительной степени зависит от нескольких индивидуальных факторов, включая общее состояние здоровья, возраст и пол пациента, а также факторы травмы, такие как режим механической стабилизации сломанной кости, возникновение инфекции и тяжесть окружающего повреждения мягких тканей4, 5,6. Таким образом, часто случаются неудачи, приводящие к развитию несращения, что значительно влияет на реабилитацию пациента икачество жизни 7,8. Из-за растущего числа переломов в результате высокоэнергетических травм и старения, а также высокой стоимости лечения, несросшиеся переломы стали бременем для систем здравоохранения во всем мире 9,10. Это растущее бремя подчеркивает настоятельную потребность в инновационных терапевтических стратегиях для улучшения восстановления костной ткани11,12, основанных на комбинации скелетных/мезенхимальных стволовых/стромальных клеток и биомиметических биоматериалов13,14.

Для достижения этой цели животные модели широко использовались в исследованиях, направленных на понимание фундаментальной биологии механизмов заживления переломов, а также в доклинических исследованиях, направленных на разработку новых терапевтических стратегий, способствующих восстановлению костной ткани 15,16,17. Модели мелких животных, таких как мыши, отлично подходят для исследований заживления переломов из-за широкой доступности генетически модифицированных штаммов и реагентов для экспериментального анализа и низких затрат на их обслуживание. Кроме того, у мышей наблюдается быстрый ход заживления, что позволяет проводить временной анализ всех этапов процесса репарации15. Тем не менее, небольшой размер животного может создать проблемы для хирургического получения переломов с режимами фиксации, аналогичными тем, которые применяются у людей. Этот протокол описывает простую и недорогую модель заживления переломов у мышей с использованием открытой остеотомии бедренной кости, стабилизированной интрамедуллярной проволокой, которая напоминает наиболее распространенный процесс восстановления кости путем образования хрящевой мозоли, и может быть использована как в базовых, так и в трансляционных исследованиях, при которых требуется доступ к месту перелома.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты были одобрены Комитетом по использованию и уходу за животными Центра медицинских наук Федерального университета Рио-де-Жанейро (протокол No 101/21). В исследовании использовали самцов мышей линии Balb/c в возрасте 10-12 недель (масса тела 25-30 г). Хирургическая процедура занимает примерно 15-20 минут на одну мышь. Перед каждой процедурой необходимые инструменты (перечисленные в таблице материалов) должны быть размещены на стерильном операционном поле, покрывающем операционный стол (Рисунок 1А). Металлические хирургические инструменты должны быть автоклавированы в самогерметизирующиеся конверты при температуре 123 °C в течение 30 минут. Одноразовые предметы, такие как иглы и марлевые салфетки, должны быть стерильными.

1. Подготовка животных

  1. Обезболивайте мышь и выполняйте анальгезию в соответствии с рекомендованным ветеринарами режимом, утвержденным программой по уходу за животными и их использованию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии необходимости предпочтительно проводить ингаляционную анестезию. Описание протокола ингаляционной анестезии можно найти в отчете Ewald et al.18. Однако, если перелом производится для остеоиммунологических исследований, этого вида анестезии следует избегать, так как данные показывают, что некоторые летучие анестетики, включая изофлуран, влияют на активность как врожденных, так и адаптивных иммунных клеток19,20.
  2. Как только мышь станет неподвижной, побрейте левую ногу, а затем перенесите ее на операционный стол на теплую грелку (см. Таблицу материалов) при температуре 37 °C, накрыв стерильной хирургической простыней.
  3. Выполнить антисептическое промывание области разреза, протерев кожу 10% повидон-йодной губкой. Дезинфекция должна начинаться вдоль линии разреза и распространяться наружу по кругу. Высушите натертый участок стерильными марлевыми салфетками, вымойте 70% этиловым спиртом и снова высушите стерильной марлевой салфеткой. Повторите эту процедуру три раза.
  4. Поместите мышь в правостороннее положение пролежней и обездвижьте лапы хирургической лентой (рис. 1C).
  5. Накиньте мышь так, чтобы была видна только область разреза (рис. 1D).

2. Хирургическое вмешательство

  1. Во время хирургической процедуры постоянно проверяйте, дышит ли мышь, и закапывайте ей глазные капли, чтобы избежать сухости и предотвратить слепоту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся хирургическая процедура обычно занимает ~15-20 минут, если выполняется квалифицированным хирургом. Поэтому одного применения глазных капель в начале процедуры должно быть достаточно. Если процедура начинает удлиняться, можно проводить дополнительные аппликации, когда будет выявлено, что глаза начинают сохнуть.
  2. Прежде чем приступить к разрезу, оцените глубину анестетика, ущипнув хвост для проверки рефлекса болевой реакции и визуально проверив частоту дыхания (считая количество движений грудной клетки в минуту)21. При оптимальной анестезии мышь не должна реагировать на пощипывание хвоста, а частота дыхания должна составлять около 55-65 вдохов/мин21.
  3. Сделайте латеральный парапателлярный разрез кожи длиной 1 см лезвием скальпеля (No 11, см. таблицу материалов), начиная с уровня бугристости большеберцовой кости и заканчивая уровнем надколенника, а затем, на равном расстоянии, по направлению к дистальному отделу бедренной кости (рис. 1E).
  4. Ножницами с тупым концом рассекают подкожную фасцию вокруг линии разреза, чтобы обнажить широчайшую фасцию, латеральный вастус и двуглавую мышцу бедра22.
  5. Лезвием скальпеля No 11 сделайте еще один разрез в широчайшей фасции, аналогичный тому, который делается на коже, начиная с уровня бугристости большеберцовой кости и проходя вдоль апоневроза двуглавой мышцы бедра до уровня дистального отдела бедренной кости, чтобы открыть суставную капсулу и получить доступ к коленному суставу (рис. 1F, G).
  6. Выполните медиальный вывих надколенника, поместив под него кончик прямого зубчатого пинцета с прецизионным кончиком (см. Таблицу материалов) и отодвинув его в сторону вместе со связками надколенника и четырехглавой мышцы бедра, обнажив таким образом мыщелки бедренной кости (рис. 1H).
  7. Придерживая бедренную кость пинцетом с зазубренным наконечником, согните колено под углом 90° и вручную проперфорируйте интрамедуллярный канал бедренной кости через межмыщелковую ямку иглой для подкожных инъекций 26 G (рис. 1I, J).
  8. Удерживая колено согнутым под углом 90°, введите отрезок диаметром 1,0 см из стержневой проволоки из нержавеющей стали диаметром 0,016 дюйма (0,40 мм) (см. Таблицу материалов) через отверстие в мозговой канал бедренной кости по направлению к большому вертелу (Рисунок 1К).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание коленного сустава согнутым под углом 90° имеет решающее значение для правильного введения проволоки в медуллярный канал. Если этого не сделать, это приведет к экстравазации проволоки из кости и окружающих поражений мягких тканей.
  9. Отрегулируйте предварительно отогнутый дистальный конец проволоки пинцетом с прямым зазубренным концом, чтобы плотно зафиксировать его в боковом мыщелке (рис. 1L). Помимо фиксации проволоки на месте, согнутый конец облегчит посмертное удаление проволоки.
  10. Отделите латеральную васту и мышцу двуглавой мышцы бедра путем рассечения тупым концом пинцетом с зазубренным концом, чтобы получить доступ к дистальному диафизу бедренной кости (рис. 1M).
  11. Вставьте рассекающие ножницы вокруг диафиза бедренной кости под углом примерно 90° и аккуратно выполните полную кортикальную остеотомию (рис. 1N).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бедренные кости мышей легко разрезаются. Воздержитесь от приложения чрезмерной силы во время остеотомии, чтобы избежать изгиба интрамедуллярной проволоки и обширного измельчения перелома.
  12. Переместите мышцы и коленную чашечку, надавливая кончиком пинцета с прямым зазубренным кончиком на область мыщелка.
  13. Закройте мышечную фасцию рассасывающимся шовным материалом 6-0, а затем кожу нейлоновым шовным материалом 6-0 (см. таблицу материалов), оба простым прерывистым способом (рисунок 1O).
  14. Переложите мышь в индивидуальную чистую клетку для восстановления. После пробуждения мышь должна иметь возможность свободно двигаться с неограниченной нагрузкой.
  15. В последующие дни после операции проводят обезболивание в соответствии с рекомендованной ветеринарами схемой, утвержденной программой ухода и использования животных в учреждении.

3. Рентгенография

  1. Обезболивайте мышь, как описано в шаге 1.1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если рентгенография проводится сразу после хирургического вмешательства, а мышь все еще находится под оптимальной анестезией (шаг 2.2), нет необходимости выполнять этот этап.
  2. Для четкого бокового обзора сломанной бедренной кости поместите мышь в положение спинного пролежня, а оперированную заднюю конечность слегка отведите в сторону.
  3. Обездвижьте лапы хирургической лентой.
  4. Выполняйте рентгенографическую визуализацию в соответствии с имеющимся протоколом оборудования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для данного исследования был использован цифровой генератор стоматологического рентгеновского излучения со следующими параметрами: напряжение 70 кВ, ток 7 мА и время экспозиции 0,2 с.

4. Гистологическая обработка и окрашивание H&E

  1. Усыпляйте мышей с помощью внутрибрюшинной передозировки анестетиков (см. рекомендованную ветеринарами схему, одобренную программой по уходу за животными и их использованию). Проверив глубину анестезии защемлением хвоста, выполняют вывих шейного отдела. Затем собирают сломанную кость, удаляют излишки окружающей мышечной ткани23 и фиксируют кость в 10% буферном растворе формалина (рН 7,4) в течение 3 дней.
  2. Поместите образцы костей в маркированные гистологические кассеты (см. таблицу материалов) и погрузите их в 10% ЭДТА в фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,4, на 14 дней для декальцинации. Меняйте раствор для удаления накипи два раза в неделю.
  3. Обезвоживают образцы в серии растворов с возрастающими концентрациями этанола (70%, 80%, 90%, 100%, 100%) в течение 1 ч каждый.
  4. Очищают образцы в двух последовательных ваннах с ксилолом по 30 мин каждая.
  5. Для инфильтрации воска образцы погружают в две последовательные парафиновые ванны при 60 °C на 30 мин. Далее встраиваем образцы в блоки для секционирования24.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы лучше рассмотреть мозоль, поместите кость длинной осью в горизонтальное положение, чтобы обеспечить продольные разрезы.
  6. Разрежьте ткань на срезы толщиной 4 мкм микротомом (см. Таблицу материалов).
  7. Срезы поплавят на водяной бане с температурой 56 °C и смонтируют на гистологических предметных стеклах (см. Таблицу материалов).
  8. Для окрашивания H&E депарафинизируют предметные стекла в трех последовательных ваннах с ксилолом в течение 5 мин и регидратируют ткань в серии растворов для снижения концентрации этанола (95%, 80% и 70%) в течение 5 мин.
  9. Промыть предметные стекла в водопроводной воде в течение 30 с, окрасить предметные стекла гематоксилином Harris (см. таблицу материалов) в течение 6 мин и промыть их в водопроводной воде еще 30 с.
  10. Погружают предметные стекла в 1%-ную соляную кислоту в этаноле на 30 с, а затем в 70%-ный этанол на 30 с.
  11. Окрашивать эозином (см. Таблицу материалов) в течение 2 мин и смывать водопроводной водой в течение 30 с.
  12. Обезвоживайте предметные стекла этанолом (70%, 80% и 95% в течение 5 минут) и осветляйте двумя ваннами с ксилолом по 5 минут каждая.
  13. Для монтажа капните одну-две капли монтажного носителя (см. Таблицу материалов) на каждое предметное стекло и накройте затвор чистым покровным стеклом.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Самым простым и непосредственным способом оценить успешность хирургического вмешательства в получении перелома является рентгенография. Рентгенограммы могут быть выполнены сразу после операции, когда мышь все еще находится под наркозом, а затем через 7, 14 и 21 день после перелома для о...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

По мере того, как количество переломов во всем мире увеличивается 9,10,25, инновационные методы лечения несращений становятся все более актуальными. Поскольку заживление переломов включает в себя сложную и строго организованную суммаци?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Конфликт финансовых интересов у авторов отсутствует.

Благодарности

Эта работа финансировалась Фондом поддержки научных исследований штата Рио-де-Жанейро имени Карлоса Шагаса Фильо (FAPERJ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Alcohol 70ºMerck109-56-8Or any general available supplier
Canada balsam (mounting medium)MerckC1795Or any general available supplier
CefazolineABLNot applicableSimilar brands of the item may be used according to local availability
CoverslipMerckCSL284525Or any general available supplier
Dental X-Ray GeneratorFocus-Sold by Instrumentarium Dental Inc. 
DEPC waterMerckW4502Or any general available supplier
Dissecting ScissorABC Instrumentos0327Similar brands of the item may be used according to local availability
EDTAVetec60REAVET014340Similar brands of the item may be used according to local availability
Eosin solutionLaborclinEA-65Similar brands of the item may be used according to local availability
Ethanol P.AVetec60REAVET012053Similar brands of the item may be used according to local availability
Gauze padsCremerNot applicableOr any general available supplier
Harris Hematoxylin SolutionLaborclin620503Similar brands of the item may be used according to local availability
Heating padTonkey Electrical TechnologyE114273Similar brands of the item may be used according to local availability
Histological slidesMerckCSL294875X25Or any general available supplier
Histology cassettesMerckH0542-1CSOr any general available supplier
Hydrochloric acid - 37%Merck258148Similar brands of the item may be used according to local availability
Insulin syringeBD324918Or any general available supplier
Iodopovidone spongeRioquímica372106Or any general available supplier
Ketamine hydrochlorideCevaNot applicableSimilar brands of the item may be used according to local availability
Lacribel collyriumCristaliaNot applicableSimilar brands of the item may be used according to local availability
MicrotomeLeica149AUTO00C1
Mouse Tooth Forceps TweezerABC Instrumentos0164Similar brands of the item may be used according to local availability
Needle 26 GBD2239Or any general available supplier
Needle Holder Golgran135-18Similar brands of the item may be used according to local availability
Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6AtramatC1546-NTOr any general available supplier
ParaffinExodo8002 - 74 - 2Similar brands of the item may be used according to local availability
ParaformaldehydeSigma30525-89-4Similar brands of the item may be used according to local availability
PBS 1x Lonza BE17-516FSimilar brands of the item may be used according to local availability
Resorbable Nylon Suture thread nº 6AtramatC1596-45BOr any general available supplier
Rod Wire SS CrNi 0.016"Orthometric56.50.2016
Scalpel nº 11Descarpak15782Or any general available supplier
Serrated Tip TweezerQuinelatoQC.404.12Similar brands of the item may be used according to local availability
ShaverPhillipsNot applicableSimilar brands of the item may be used according to local availability
Surgical tape3M2734Or any general available supplier
Surgical tnt fieldPolarfix6153Or any general available supplier
Tramadol hydrochlorideTeuto Not applicableSimilar brands of the item may be used according to local availability
Water bath for histologyLeicaHI1210
Xylazine hydrochlorideCevaNot applicableSimilar brands of the item may be used according to local availability
XyleneDinamica60READIN001105Similar brands of the item may be used according to local availability

Ссылки

  1. Florencio-Silva, R., Sasso, G. R., Sasso-Cerri, E., Simoes, M. J., Cerri, P. S. Biology of bone tissue: Structure, function, and factors that influence bone cells. BioMed Research International. 2015, 421746(2015).
  2. Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. Journal of Orthopedic Research. 37 (1), 35-50 (2019).
  3. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  4. Perren, S. M. Fracture healing: Fracture healing understood as the result of a fascinating cascade of physical and biological interactions. Part II. Acta Chirurgiae Orthopaedicae et Traumatologiae Cechoslovaca. 82 (1), 13-21 (2015).
  5. Giannoudis, P. V., Krettek, C., Lowenberg, D. W., Tosounidis, T., Borrelli, J. Fracture healing adjuncts-The world's perspective on what works. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, Suppl 1 43-47 (2018).
  6. Kates, S. L., et al. Outside the bone: What is happening systemically to influence fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, Suppl 1 33-36 (2018).
  7. Ding, Z. C., Lin, Y. K., Gan, Y. K., Tang, T. T. Molecular pathogenesis of fracture nonunion. Journal of Orthopaedic Translation. (14), 45-56 (2018).
  8. Calori, G. M., et al. Non-unions. Clinical Cases in Mineral Bone Metabolism. 14 (2), 186-188 (2017).
  9. Ekegren, C. L., Edwards, E. R., de Steiger, R., Gabbe, B. J. Incidence, costs and predictors of non-union, delayed union and mal-union following long bone fracture. Internation Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2845(2018).
  10. Aziziyeh, R., et al. The burden of osteoporosis in four Latin American countries: Brazil, Mexico, Colombia, and Argentina. Journal of Medical Economics. 22 (7), 638-644 (2019).
  11. Kostenuik, P., Mirza, F. M. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 213-223 (2017).
  12. Gomez-Barrena, E., et al. fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions. Bone. 70, 93-101 (2015).
  13. Schlundt, C., et al. Clinical and research approaches to treat non-union fracture. Current Osteoporosis Reports. 16 (2), 155-168 (2018).
  14. Gomez-Barrena, E., et al. Feasibility and safety of treating non-unions in tibia, femur and humerus with autologous, expanded, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells associated with biphasic calcium phosphate biomaterials in a multicentric, non-comparative trial. Biomaterials. 196, 100-108 (2018).
  15. Ryan, G., et al. Systemically impaired fracture healing in small animal research: A review of fracture repair models. Journal of Orthopedic Research. 39 (7), 1359-1367 (2021).
  16. Marmor, M. T., Dailey, H., Marcucio, R., Hunt, A. C. Biomedical research models in the science of fracture healing - Pitfalls & promises. Injury. 51 (10), 2118-2128 (2020).
  17. Schindeler, A., Mills, R. J., Bobyn, J. D., Little, D. G. Preclinical models for orthopedic research and bone tissue engineering. Journal of Orthopedic Research. 36 (3), 832-840 (2018).
  18. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563(2011).
  19. Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
  20. Sedghi, S., Kutscher, H. L., Davidson, B. A., Knight, P. R. Volatile anesthetics and immunity. Immunological Investigations. 46 (8), 793-804 (2017).
  21. Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
  22. Komárek, V. Chapter 2.2. Gross anatomy. The Laboratory Mouse (Second Edition). Hedrich, H. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 145-159 (2012).
  23. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936(2016).
  24. An, Y. H., Moreira, P. L., Kang, Q. K., Gruber, H. E. Principles of embedding and common protocols. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. An, Y. H., Martin, K. L. , Humana Press. Totowa, NJ. 185-197 (2003).
  25. Enninghorst, N., McDougall, D., Evans, J. A., Sisak, K., Balogh, Z. J. Population-based epidemiology of femur shaft fractures. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 74 (6), 1516-1520 (2013).
  26. Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
  27. Haffner-Luntzer, M., Fischer, V., Ignatius, A. Differences in fracture healing between female and male C57BL/6J mice. Frontiers in Physiology. 12, 712494(2021).
  28. Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
  29. Streubel, P. N., Desai, P., Suk, M. Comparison of RIA and conventional reamed nailing for treatment of femur shaft fractures. Injury. 41, Suppl 2 51-56 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены