Establecimiento de un modelo de fractura de fémur diafisario en ratones

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento quirúrgico para el establecimiento de una fractura diafisaria en el fémur de ratones, que se estabiliza con un alambre intramedular, para estudios de cicatrización de fracturas.

Resumen

Los huesos tienen una importante capacidad regenerativa. Sin embargo, la cicatrización de la fractura es un proceso complejo y, dependiendo de la gravedad de las lesiones y de la edad y el estado de salud general del paciente, pueden producirse fallas, lo que lleva a un retraso en la unión o a la falta de unión. Debido al creciente número de fracturas resultantes de traumatismos de alta energía y envejecimiento, se necesita urgentemente el desarrollo de estrategias terapéuticas innovadoras para mejorar la reparación ósea basadas en la combinación de células madre esqueléticas/mesenquimales/estromales y biomateriales biomiméticos. Con este fin, el uso de modelos animales fiables es fundamental para comprender mejor los mecanismos celulares y moleculares clave que determinan los resultados de curación. De todos los modelos, el ratón es el modelo de investigación preferido porque ofrece una amplia variedad de cepas transgénicas y reactivos para el análisis experimental. Sin embargo, el establecimiento de fracturas en ratones puede ser técnicamente difícil debido a su pequeño tamaño. Por lo tanto, este artículo tiene como objetivo demostrar los procedimientos para el establecimiento quirúrgico de una fractura de fémur diafisario en ratones, que se estabiliza con un alambre intramedular y se asemeja al proceso de reparación ósea más común, a través de la formación de callos cartilaginosos.

Introducción

El esqueleto es un órgano vital y funcionalmente versátil. Los huesos del esqueleto permiten la postura y el movimiento del cuerpo, protegen los órganos internos, producen hormonas que integran las respuestas fisiológicas y son el sitio de hematopoyesis y almacenamiento de minerales¹. Si se fracturan, los huesos tienen una notable capacidad para regenerarse y restaurar completamente su forma y función previas a la lesión. El proceso de cicatrización comienza con la formación de un hematoma y una respuesta inflamatoria, que induce la activación y condensación de las células madre/progenitoras esqueléticas del periostio, el endosteo y la médula ósea y su posterior diferenciación para formar el callo cartilaginoso blando. El puente de los extremos fracturados se produce a través de un proceso que se asemeja a la formación de hueso endocondral, en el que el andamio cartilaginoso se expande y luego se mineraliza, formando el callo óseo duro. Finalmente, el callo duro es remodelado gradualmente por osteoclastos y osteoblastos para restaurar la estructura ósea original ^2,3.

Aunque el proceso de curación de la fractura es bastante robusto, implica una suma intrincada de eventos y está significativamente influenciado por varios factores individuales, incluido el estado de salud general, la edad y el sexo del paciente, así como factores de lesión, como el modo de estabilización mecánica del hueso fracturado, la aparición de infección y la gravedad de la lesión de los tejidos blandos^{circundantes. 5,6}. Por lo tanto, los fracasos son comunes, lo que lleva al desarrollo de pseudoartrosis, lo que impacta en gran medida en la rehabilitación del paciente y en la calidad de vida ^7,8. Debido al creciente número de fracturas como resultado de traumatismos de alta energía y envejecimiento, así como a los altos costos de los tratamientos, las fracturas pseudoartrosas se han convertido en una carga para los sistemas de salud de todo el mundo ^9,10. Esta carga creciente pone de manifiesto la necesidad urgente de estrategias terapéuticas innovadoras para mejorar la reparación ósea^11,12 basadas en la combinación de células madre esqueléticas/mesenquimales y biomateriales biomiméticos ^13,14.

En la búsqueda de este objetivo, los modelos animales han sido ampliamente utilizados en estudios que tienen como objetivo comprender la biología fundamental de los mecanismos de cicatrización de fracturas y en estudios preclínicos de prueba de concepto con el objetivo de diseñar nuevas estrategias terapéuticas para promover la reparación ósea 15,16,17. Los modelos de animales pequeños, como el ratón, son excelentes para los estudios de cicatrización de fracturas debido a la amplia disponibilidad de cepas y reactivos modificados genéticamente para análisis experimentales y sus bajos costos de mantenimiento. Además, los ratones tienen un curso de tiempo de curación rápido, lo que permite el análisis temporal de todas las etapas del proceso de reparación¹⁵. Sin embargo, el pequeño tamaño del animal puede plantear desafíos para la producción quirúrgica de fracturas con modos de fijación similares a los aplicados en humanos. Este protocolo describe un modelo simple y de bajo costo de cicatrización de fracturas en ratones utilizando una osteotomía femoral abierta estabilizada con un alambre intramedular, que se asemeja al proceso de reparación ósea más común, a través de la formación de callos cartilaginosos, y puede ser utilizado tanto en investigaciones básicas como traslacionales en las que se requiere acceso al sitio de la fractura.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Federal de Río de Janeiro (Protocolo Número 101/21). En este estudio se utilizaron ratones machos Balb/c de 10-12 semanas de edad (25-30 g de peso corporal). El procedimiento quirúrgico dura aproximadamente 15-20 minutos por ratón. Antes de cada procedimiento, los instrumentos requeridos (enumerados en la Tabla de Materiales) deben organizarse sobre un campo quirúrgico estéril que cubra la mesa de operaciones (Figura 1A). Los instrumentos quirúrgicos metálicos deben esterilizarse en autoclave en sobres autosellantes a 123 °C durante 30 min. Los artículos desechables, como agujas y gasas, deben adquirirse estériles.

1. Preparación animal

1. Anestesiar al ratón y realizar analgesia de acuerdo con el régimen recomendado por el veterinario aprobado por el programa institucional de cuidado y uso de animales.
   NOTA: Si está disponible, preferiblemente se debe realizar anestesia inhalatoria. Una descripción del protocolo para la anestesia inhalatoria se puede encontrar en el relato de Ewald et ^al.18. Sin embargo, si la fractura se produce para estudios de osteoinmunología, este tipo de anestesia debe ser evitada, ya que la evidencia muestra que varios anestésicos volátiles, incluido el isoflurano, afectan la actividad de las células inmunes tanto innatas como adaptativas^19,20.
2. Una vez que el ratón esté inmóvil, afeitar la pierna izquierda y luego transferirla a la mesa quirúrgica sobre una almohadilla térmica tibia (ver Tabla de materiales) a 37 °C cubierta con un paño quirúrgico estéril.
3. Realice un lavado antiséptico de la zona de la incisión frotando la piel con una esponja de povidona yodada al 10%. La desinfección debe comenzar a lo largo de la línea de incisión y extenderse hacia afuera en un patrón circular. Seque el área frotada con gasas estériles, lávela con etanol al 70% y vuelva a secar con una gasa estéril. Repita este procedimiento tres veces.
4. Coloque el ratón en la posición de decúbito lateral derecho e inmovilice las patas con cinta quirúrgica (Figura 1C).
5. Coloque el ratón de modo que solo se vea la región de la incisión (Figura 1D).

2. Procedimiento quirúrgico

1. Durante el procedimiento quirúrgico, verifique constantemente que el ratón esté respirando y proporciónele gotas para los ojos para evitar la sequedad y evitar que el ratón se quede ciego.
   NOTA: Todo el procedimiento quirúrgico suele durar ~15-20 minutos cuando lo realiza un cirujano capacitado. Por lo tanto, aplicar las gotas para los ojos una vez al comienzo del procedimiento debería ser suficiente. Si el procedimiento comienza a ser más largo, se pueden realizar aplicaciones adicionales siempre que se identifique que los ojos comienzan a secarse.
2. Antes de proceder a la incisión, evalúe la profundidad anestésica pellizcando la cola para comprobar el reflejo de respuesta al dolor e inspeccionando visualmente la frecuencia respiratoria (contando el número de movimientos torácicos por minuto)²¹. Bajo anestesia óptima, el ratón no debe responder a un pellizco de cola, y la frecuencia respiratoria debe ser de alrededor de 55-65 respiraciones/min²¹.
3. Realizar una incisión parapatelar lateral cutánea de 1 cm con una hoja de bisturí (Número 11, ver Tabla de Materiales), comenzando a nivel de la tuberosidad tibial y extendiéndose hasta el nivel de la rótula y luego, a igual distancia, hacia el fémur distal (Figura 1E).
4. Con unas tijeras de punta roma, diseccione la fascia subcutánea alrededor de la línea de incisión para exponer la fascia lata, el vasto lateral y los músculos del bíceps femoral²².
5. Con la hoja de bisturí número 11, realizar otra incisión en la fascia lata similar a la realizada en la piel, comenzando a nivel de la tuberosidad tibial y recorriendo la aponeurosis del bíceps femoral hasta el nivel del fémur distal, para abrir la cápsula articular y acceder a la articulación de la rodilla (Figura 1F, G).
6. Realice una luxación medial de la rótula colocando la punta de una pinza recta dentada de precisión (ver Tabla de Materiales) debajo de ella y empujándola hacia un lado junto con los ligamentos rotuliano y cuádriceps, exponiendo así los cóndilos del fémur (Figura 1H).
7. Sujetando el fémur con una pinza de punta dentada, flexionar la rodilla a 90° y perforar manualmente el canal intramedular del fémur a través de la fosa intercondílea con una aguja hipodérmica de 26 G (Figura 1I, J).
8. Manteniendo la rodilla flexionada a 90°, inserte un segmento de 1,0 cm de un alambre de varilla de acero inoxidable de 0,016 pulgadas (0,40 mm) (Figura 1K, inserto) (ver Tabla de Materiales) a través de la abertura en el canal medular del fémur hacia el trocánter mayor (Figura 1K).
   NOTA: Mantener la rodilla flexionada a 90° es crucial para la correcta inserción del alambre en el canal medular. Si no lo hace, el alambre se extravasará del hueso y de las lesiones de los tejidos blandos circundantes.
9. Ajuste la extremidad distal predoblada del alambre con una pinza de punta dentada recta para fijarlo firmemente en el cóndilo lateral (Figura 1L). Además de fijar el alambre en su lugar, la extremidad doblada facilitará la extracción postmortem del alambre.
10. Separe los músculos del vasto lateral y del bíceps femoral mediante una disección del extremo romo con una pinza de punta dentada para acceder a la diáfisis distal del fémur (Figura 1M).
11. Inserte una tijera de disección alrededor de la diáfisis del fémur en un ángulo de aproximadamente 90° y realice suavemente una osteotomía cortical completa (Figura 1N).
    NOTA: Los fémures de los ratones se cortan fácilmente. Abstenerse de aplicar una fuerza excesiva durante la osteotomía para evitar la flexión del alambre intramedular y la trituración extensa de la fractura.
12. Vuelva a colocar los músculos y la rótula empujando la punta de una pinza recta dentada de punta de precisión sobre la región del cóndilo.
13. Cerrar la fascia muscular con una sutura reabsorbible 6-0 y luego la piel con una sutura de nylon 6-0 (ver Tabla de Materiales), ambas de forma simple e interrumpida (Figura 1O).
14. Transfiera el ratón a una jaula limpia individual para su recuperación. Una vez despierto, el ratón debe ser capaz de moverse libremente con una carga de peso sin restricciones.
15. En los días siguientes a la cirugía, realice analgesia de acuerdo con el régimen recomendado por el veterinario aprobado por el programa institucional de cuidado y uso de animales.

3. Imágenes de rayos X

1. Anestesiar el ratón como se describe en el paso 1.1.
   NOTA: Si la radiografía se realiza inmediatamente después del procedimiento quirúrgico y el ratón todavía está bajo anestesia óptima (paso 2.2), no es necesario realizar este paso.
2. Para obtener una vista lateral limpia del fémur fracturado, coloque el ratón en la posición de decúbito dorsal y tire ligeramente de la extremidad posterior operada hacia un lado.
3. Inmovilizar las patas con cinta quirúrgica.
4. Realizar imágenes radiográficas de acuerdo con el protocolo del equipo disponible.
   NOTA: Para este estudio se utilizó un generador digital de rayos X dental con los siguientes parámetros: tensión de 70 kVp, corriente de 7 mA y tiempo de exposición de 0,2 s.

4. Procesamiento histológico y tinción de H&E

1. Aplicar la eutanasia a los ratones con una sobredosis intraperitoneal de anestésicos (consulte el régimen recomendado por el veterinario aprobado por el Programa Institucional de Cuidado y Uso de Animales). Después de verificar la profundidad de la anestesia con un pellizco en la cola, realice la luxación cervical. A continuación, recoja el hueso fracturado, elimine el exceso de tejido muscular circundante²³ y fije el hueso en una solución de formalina tamponada al 10% (pH 7,4) durante 3 días.
2. Coloque las muestras óseas en casetes histológicos marcados (consulte la Tabla de materiales) y sumérjalas en EDTA al 10% en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4, durante 14 días para su descalcificación. Cambie la solución de descalcificación dos veces por semana.
3. Deshidratar las muestras en una serie de soluciones de concentraciones crecientes de etanol (70%, 80%, 90%, 100%, 100%) durante 1 h cada una.
4. Limpie las muestras en dos baños secuenciales de xileno durante 30 minutos cada uno.
5. Para la infiltración de cera, sumergir las muestras en dos baños de parafina secuenciales a 60 °C durante 30 min. A continuación, incruste las muestras en bloques para seccionar²⁴.
   NOTA: Para ver mejor el callo, incruste el hueso con su eje largo en posición horizontal para permitir cortes longitudinales.
6. Cortar el tejido en secciones de 4 μm de grosor con un micrótomo (ver Tabla de Materiales).
7. Flotar las secciones en un baño de agua a 56 °C y montar las secciones en portaobjetos histológicos (ver Tabla de Materiales).
8. Para la tinción de H&E, desparafinar los portaobjetos en tres baños secuenciales de xileno durante 5 min, y rehidratar el tejido en una serie de soluciones de concentraciones decrecientes de etanol (95%, 80% y 70%) durante 5 min.
9. Enjuague los portaobjetos con agua del grifo durante 30 s, tiña los portaobjetos con hematoxilina Harris (ver Tabla de materiales) durante 6 minutos y enjuáguelos con agua del grifo durante otros 30 s.
10. Sumergir los portaobjetos en ácido clorhídrico al 1% en etanol durante 30 s y luego en etanol al 70% durante 30 s.
11. Manchar con eosina (ver Tabla de materiales) durante 2 min, y lavar con agua del grifo durante 30 s.
12. Deshidratar los portaobjetos con etanol (70%, 80% y 95% durante 5 min) y clarificar con dos baños de xileno durante 5 min cada uno.
13. Para el montaje, gotee una o dos gotas de medio de montaje (consulte la Tabla de materiales) en cada portaobjetos y cubra el portaobjetos con un cubreobjetos limpio.

Resultados

La forma más sencilla e inmediata de evaluar el éxito del procedimiento quirúrgico en la producción de la fractura es la radiografía. Las radiografías se pueden realizar inmediatamente después de la cirugía, con el ratón aún bajo anestesia, y posteriormente 7 días, 14 días y 21 días después de la fractura para evaluar la formación y progresión del callo. Los patrones de fractura aceptables son aquellos en los que las cortezas están completamente rotas, los alambres están colocados correctamente dentro d...

Discusión

A medida que aumenta el número de fracturas en todo el mundo ^9,10,25, los tratamientos innovadores para la pseudoartrosis son cada vez más urgentes. Dado que la cicatrización de fracturas implica una suma compleja y estrechamente orquestada de eventos que ocurren a lo largo de una larga escala de tiempo³, el uso de modelos animales válidos es fundamental para mejorar nuestra comprensión de los mecani...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol 70º	Merck	109-56-8	Or any general available supplier
Canada balsam (mounting medium)	Merck	C1795	Or any general available supplier
Cefazoline	ABL	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Coverslip	Merck	CSL284525	Or any general available supplier
Dental X-Ray Generator	Focus	-	Sold by Instrumentarium Dental Inc.
DEPC water	Merck	W4502	Or any general available supplier
Dissecting Scissor	ABC Instrumentos	0327	Similar brands of the item may be used according to local availability
EDTA	Vetec	60REAVET014340	Similar brands of the item may be used according to local availability
Eosin solution	Laborclin	EA-65	Similar brands of the item may be used according to local availability
Ethanol P.A	Vetec	60REAVET012053	Similar brands of the item may be used according to local availability
Gauze pads	Cremer	Not applicable	Or any general available supplier
Harris Hematoxylin Solution	Laborclin	620503	Similar brands of the item may be used according to local availability
Heating pad	Tonkey Electrical Technology	E114273	Similar brands of the item may be used according to local availability
Histological slides	Merck	CSL294875X25	Or any general available supplier
Histology cassettes	Merck	H0542-1CS	Or any general available supplier
Hydrochloric acid - 37%	Merck	258148	Similar brands of the item may be used according to local availability
Insulin syringe	BD	324918	Or any general available supplier
Iodopovidone sponge	Rioquímica	372106	Or any general available supplier
Ketamine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Lacribel collyrium	Cristalia	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Microtome	Leica	149AUTO00C1
Mouse Tooth Forceps Tweezer	ABC Instrumentos	0164	Similar brands of the item may be used according to local availability
Needle 26 G	BD	2239	Or any general available supplier
Needle Holder	Golgran	135-18	Similar brands of the item may be used according to local availability
Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1546-NT	Or any general available supplier
Paraffin	Exodo	8002 - 74 - 2	Similar brands of the item may be used according to local availability
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4	Similar brands of the item may be used according to local availability
PBS 1x	Lonza	BE17-516F	Similar brands of the item may be used according to local availability
Resorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1596-45B	Or any general available supplier
Rod Wire SS CrNi 0.016"	Orthometric	56.50.2016
Scalpel nº 11	Descarpak	15782	Or any general available supplier
Serrated Tip Tweezer	Quinelato	QC.404.12	Similar brands of the item may be used according to local availability
Shaver	Phillips	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Surgical tape	3M	2734	Or any general available supplier
Surgical tnt field	Polarfix	6153	Or any general available supplier
Tramadol hydrochloride	Teuto	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Water bath for histology	Leica	HI1210
Xylazine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Xylene	Dinamica	60READIN001105	Similar brands of the item may be used according to local availability