Établissement d’un modèle de fracture du fémur diaphysaire chez la souris

Résumé

Ce protocole décrit une intervention chirurgicale pour l’établissement d’une fracture diaphysaire dans le fémur de souris, qui est stabilisée avec un fil intramédullaire, pour les études de cicatrisation des fractures.

Résumé

Les os ont une capacité de régénération importante. Cependant, la cicatrisation des fractures est un processus complexe et, en fonction de la gravité des lésions et de l’âge et de l’état de santé général du patient, des échecs peuvent survenir, entraînant un retard de l’union ou de la non-union. En raison du nombre croissant de fractures résultant de traumatismes et de vieillissements à haute énergie, le développement de stratégies thérapeutiques innovantes pour améliorer la réparation osseuse basées sur la combinaison de cellules souches squelettiques/mésenchymateuses/stromales et de biomatériaux biomimétiques est nécessaire de toute urgence. À cette fin, l’utilisation de modèles animaux fiables est fondamentale pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires clés qui déterminent les résultats de guérison. De tous les modèles, la souris est le modèle de recherche préféré car elle offre une grande variété de souches et de réactifs transgéniques pour l’analyse expérimentale. Cependant, l’établissement de fractures chez la souris peut être techniquement difficile en raison de leur petite taille. Par conséquent, cet article vise à démontrer les procédures pour l’établissement chirurgical d’une fracture du fémur diaphysaire chez la souris, qui est stabilisée avec un fil intramédullaire et ressemble au processus de réparation osseuse le plus courant, par la formation de callosités cartilagineuses.

Introduction

Le squelette est un organe vital et fonctionnellement polyvalent. Les os du squelette permettent la posture et le mouvement du corps, protègent les organes internes, produisent des hormones qui intègrent les réponses physiologiques et sont le site de l’hématopoïèse et du stockage des minéraux¹. S’ils sont fracturés, les os ont une capacité remarquable à se régénérer et à restaurer complètement leur forme et leur fonction d’avant la blessure. Le processus de guérison commence par la formation d’un hématome et d’une réponse inflammatoire, qui induit l’activation et la condensation des cellules souches squelettiques/progénitrices du périoste, de l’endoste et de la moelle osseuse et leur différenciation ultérieure pour former le cal cartilagineux mou. Le pontage des extrémités fracturées se produit alors par un processus qui ressemble à la formation osseuse endochondrale, dans lequel l’échafaudage cartilagineux se dilate puis se minéralise, formant le cal osseux dur. Enfin, le cal dur est progressivement remodelé par les ostéoclastes et les ostéoblastes pour restaurer la structure osseuse d’origine ^2,3.

Bien que le processus de guérison de la fracture soit assez robuste, il implique une somme complexe d’événements et est influencé de manière significative par plusieurs facteurs individuels, y compris l’état de santé général, l’âge et le sexe du patient, ainsi que des facteurs de blessure, tels que le mode de stabilisation mécanique de l’os fracturé, la survenue d’une infection et la gravité de la lésion des tissus mous environnants^{4, 5,6}. Par conséquent, les échecs sont fréquents, conduisant au développement de la non-union, ce qui a un impact considérable sur la réadaptation et la qualité de vie des patients ^7,8. En raison du nombre croissant de fractures dues à des traumatismes et au vieillissement à haute énergie, ainsi que des coûts élevés des traitements, les fractures non syndicales sont devenues un fardeau pour les systèmes de santé du monde entier ^9,10. Ce fardeau croissant met en évidence le besoin urgent de stratégies thérapeutiques innovantes pour améliorer la réparation osseuse^11,12 basées sur la combinaison de cellules souches squelettiques/mésenchymateuses/stromales et de biomatériaux biomimétiques^13,14.

Dans la poursuite de cet objectif, les modèles animaux ont été largement utilisés dans des études visant à comprendre la biologie fondamentale des mécanismes de cicatrisation des fractures et dans des études précliniques de preuve de concept visant à concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour favoriser la réparation osseuse 15,16,17. Les modèles de petits animaux, tels que la souris, sont excellents pour les études de cicatrisation des fractures en raison de la grande disponibilité de souches et de réactifs génétiquement modifiés pour les analyses expérimentales et de leurs faibles coûts de maintenance. De plus, les souris ont un temps de guérison rapide, ce qui permet l’analyse temporelle de toutes les étapes du processus de réparation¹⁵. Cependant, la petite taille de l’animal peut poser des défis pour la production chirurgicale de fractures avec des modes de fixation similaires à ceux appliqués chez l’homme. Ce protocole décrit un modèle simple et peu coûteux de cicatrisation des fractures chez la souris à l’aide d’une ostéotomie fémorale ouverte stabilisée avec un fil intramédullaire, qui ressemble au processus de réparation osseuse le plus courant, par la formation de callosités cartilagineuses, et peut être utilisé à la fois dans les investigations fondamentales et translationnelles dans lesquelles l’accès au site de fracture est nécessaire.

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité d’utilisation et de soins aux animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université fédérale de Rio de Janeiro (Protocole numéro 101/21). Des souris mâles Balb/c âgées de 10 à 12 semaines (poids corporel de 25 à 30 g) ont été utilisées dans cette étude. L’intervention chirurgicale dure environ 15 à 20 minutes par souris. Avant chaque intervention, les instruments requis (énumérés dans le tableau des matériaux) doivent être organisés sur un champ chirurgical stérile recouvrant la table d’opération (Figure 1A). Les instruments chirurgicaux métalliques doivent être autoclavés dans des enveloppes auto-obturantes à 123 °C pendant 30 min. Les articles jetables, tels que les aiguilles et les compresses de gaze, doivent être obtenus stériles.

1. Préparation des animaux

1. Anesthésier la souris et effectuer l’analgésie conformément au régime recommandé par le vétérinaire et approuvé par le programme de soins et d’utilisation des animaux de l’établissement.
   REMARQUE : Si possible, une anesthésie par inhalation doit être effectuée de préférence. Une description du protocole d’anesthésie par inhalation se trouve dans le rapport d’Ewald et ^al.18. Cependant, si la fracture est produite pour des études d’ostéoimmunologie, ce type d’anesthésie doit être évité, car les preuves montrent que plusieurs anesthésiques volatils, y compris l’isoflurane, affectent l’activité des cellules immunitaires innées et adaptatives^19,20.
2. Une fois la souris immobile, rasez la patte gauche, puis transférez-la sur la table d’opération sur un coussin chauffant chaud (voir Tableau des matériaux) à 37 °C recouvert d’un champ chirurgical stérile.
3. Effectuez un lavage antiseptique de la zone d’incision en frottant la peau avec une éponge à 10% de povidone iodée. La désinfection doit commencer le long de la ligne d’incision et s’étendre vers l’extérieur selon un motif circulaire. Séchez la zone frottée avec des compresses de gaze stériles, lavez-la avec de l’éthanol à 70 % et séchez-la à nouveau avec une compresse de gaze stérile. Répétez cette procédure trois fois.
4. Placez la souris en position de décubitus latéral droit et immobilisez les pattes avec du ruban adhésif chirurgical (Figure 1C).
5. Drapez la souris de manière à ce que seule la région de l’incision soit visible (Figure 1D).

2. Intervention chirurgicale

1. Pendant l’intervention chirurgicale, vérifiez constamment que la souris respire et fournissez des gouttes ophtalmiques dans ses yeux pour éviter la sécheresse et empêcher la souris de devenir aveugle.
   REMARQUE : L’ensemble de la procédure chirurgicale prend généralement ~ 15 à 20 minutes lorsqu’elle est effectuée par un chirurgien qualifié. Par conséquent, l’application des gouttes ophtalmiques une fois au début de la procédure devrait suffire. Si la procédure commence à s’allonger, des applications supplémentaires peuvent être effectuées chaque fois qu’il est identifié que les yeux commencent à sécher.
2. Avant de procéder à l’incision, évaluez la profondeur de l’anesthésie en pinçant la queue pour vérifier le réflexe de réponse à la douleur et en inspectant visuellement le rythme respiratoire (en comptant le nombre de mouvements thoraciques par minute)²¹. Sous anesthésie optimale, la souris ne doit pas répondre à un pincement de la queue et le rythme respiratoire doit être d’environ 55 à 65 respirations/min²¹.
3. Faire une incision parapatellaire latérale cutanée de 1 cm à l’aide d’une lame de scalpel (n° 11, voir tableau des matériaux), en commençant au niveau de la tubérosité tibiale et en s’étendant jusqu’au niveau de la rotule puis, sur une distance égale, vers le fémur distal (figure 1E).
4. À l’aide de ciseaux émoussés, disséquez le fascia sous-cutané autour de la ligne d’incision pour exposer le fascia lata, le vaste latéral et les muscles du biceps fémoral²².
5. À l’aide de la lame de scalpel numéro 11, faites une autre incision dans le fascia lata similaire à celle pratiquée dans la peau, en commençant au niveau de la tubérosité tibiale et en longeant l’aponévrose du biceps fémoral jusqu’au niveau du fémur distal, pour ouvrir la capsule articulaire et accéder à l’articulation du genou (Figure 1F, G).
6. Effectuer une luxation médiale de la rotule en plaçant la pointe d’une pince à épiler de précision dentelée droite (voir tableau des matériaux) en dessous et en la poussant sur le côté avec les ligaments rotuliens et quadriceps, exposant ainsi les condyles du fémur (Figure 1H).
7. En tenant le fémur à l’aide d’une pince à épiler à pointe dentelée, fléchissez le genou à 90° et perforez manuellement le canal intramédullaire du fémur à travers la fosse intercondylienne avec une aiguille hypodermique de 26 G (Figure 1I, J).
8. En maintenant le genou fléchi à 90°, insérez un segment de 1,0 cm d’un fil de tige en acier inoxydable de 0,016 po (0,40 mm) (figure 1K, insert) (voir le tableau des matériaux) à travers l’ouverture dans le canal médullaire du fémur vers le grand trochanter (figure 1K).
   REMARQUE : Le maintien du genou fléchi à 90° est crucial pour l’insertion correcte du fil dans le canal médullaire. Le non-respect de cette consigne entraînera l’extravasation du fil hors de l’os et des lésions des tissus mous environnantes.
9. Ajustez l’extrémité distale pré-pliée du fil à l’aide d’une pince à épiler droite à pointe dentelée pour le fixer fermement dans le condyle latéral (Figure 1L). En plus de fixer le fil en place, l’extrémité pliée facilitera le retrait post-mortem du fil.
10. Séparez les muscles latéraux du vaste et du biceps fémoral par une dissection de l’extrémité émoussée à l’aide d’une pince à épiler à pointe dentelée pour accéder à la diaphyse distale du fémur (Figure 1M).
11. Insérez un ciseau de dissection autour de la diaphyse du fémur à un angle d’environ 90° et effectuez doucement une ostéotomie corticale complète (Figure 1N).
    REMARQUE : Les fémurs des souris sont faciles à couper. S’abstenir d’appliquer une force excessive pendant l’ostéotomie pour éviter la flexion du fil intramédullaire et la fragmentation étendue de la fracture.
12. Repositionnez les muscles et la rotule en poussant la pointe d’une pince à épiler droite dentelée de précision sur la région du condyle.
13. Fermez le fascia musculaire avec une suture résorbable 6-0, puis la peau avec une suture en nylon 6-0 (voir le tableau des matériaux), les deux de manière simple et interrompue (Figure 1O).
14. Transférez la souris dans une cage propre individuelle pour la récupérer. Une fois réveillée, la souris doit pouvoir se déplacer librement avec une mise en charge sans restriction.
15. Dans les jours qui suivent la chirurgie, effectuer une analgésie conformément au régime recommandé par le vétérinaire et approuvé par le programme de soins et d’utilisation des animaux de l’établissement.

3. Imagerie par rayons X

1. Anesthésiez la souris comme décrit à l’étape 1.1.
   REMARQUE : Si la radiographie est réalisée juste après l’intervention chirurgicale et que la souris est toujours sous anesthésie optimale (étape 2.2), il n’est pas nécessaire d’effectuer cette étape.
2. Pour une vue latérale nette du fémur fracturé, placez la souris en position de décubitus dorsal et tirez légèrement le membre postérieur opéré sur le côté.
3. Immobiliser les pattes avec du ruban adhésif chirurgical.
4. Effectuer l’imagerie radiographique selon le protocole de l’équipement disponible.
   REMARQUE : Pour cette étude, un générateur de rayons X dentaires numériques a été utilisé avec les paramètres suivants : tension de 70 kVp, courant de 7 mA et temps d’exposition de 0,2 s.

4. Traitement histologique et coloration H&E

1. Euthanasier les souris en cas de surdose intrapéritonéale d’anesthésiques (veuillez vous référer au régime recommandé par le vétérinaire et approuvé par le programme de soins et d’utilisation des animaux de l’établissement). Après avoir vérifié la profondeur de l’anesthésie avec un pincement de la queue, effectuez une luxation cervicale. Ensuite, prélevez l’os fracturé, retirez l’excès de tissu musculaire environnant²³ et fixez l’os dans une solution de formol tamponnée à 10% (pH 7,4) pendant 3 jours.
2. Placer les échantillons d’os dans des cassettes d’histologie marquées (voir le tableau des matériaux) et les immerger dans de l’EDTA à 10 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4, pendant 14 jours pour la décalcification. Changez la solution de décalcification deux fois par semaine.
3. Déshydrater les échantillons dans une série de solutions de concentrations croissantes d’éthanol (70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 100 %) pendant 1 h chacune.
4. Nettoyez les échantillons dans deux bains séquentiels de xylène pendant 30 minutes chacun.
5. Pour l’infiltration de cire, immergez les échantillons dans deux bains de paraffine séquentiels à 60 °C pendant 30 min. Ensuite, intégrez les échantillons dans des blocs pour la section²⁴.
   REMARQUE : Pour mieux voir le durillon, enfoncez l’os avec son grand axe en position horizontale pour permettre des coupes longitudinales.
6. Coupez le tissu en sections de 4 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome (voir le tableau des matériaux).
7. Faire flotter les coupes dans un bain-marie à 56 °C et monter les coupes sur des lames histologiques (voir Table des matériaux).
8. Pour la coloration H&E, déparaffinez les lames dans trois bains séquentiels de xylène pendant 5 min et réhydratez le tissu dans une série de solutions de concentrations d’éthanol décroissantes (95 %, 80 % et 70 %) pendant 5 min.
9. Rincez les lames à l’eau du robinet pendant 30 s, colorez les lames avec de l’hématoxyline Harris (voir tableau des matériaux) pendant 6 min et rincez-les à l’eau du robinet pendant 30 s supplémentaires.
10. Plongez les lames dans de l’acide chlorhydrique à 1 % dans de l’éthanol pendant 30 s puis dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 s.
11. Teindre à l’éosine (voir tableau des matériaux) pendant 2 min et laver à l’eau du robinet pendant 30 s.
12. Déshydrater les lames avec de l’éthanol (70 %, 80 % et 95 % pendant 5 min) et clarifier avec deux bains de xylène pendant 5 min chacun.
13. Pour le montage, versez une à deux gouttes de support de montage (voir le tableau des matériaux) sur chaque lame et recouvrez la lame d’une lamelle propre.

Résultats

Le moyen le plus simple et le plus immédiat d’évaluer le succès de l’intervention chirurgicale dans la production de la fracture est l’imagerie radiographique. Des radiographies peuvent être effectuées immédiatement après la chirurgie, avec la souris encore sous anesthésie, puis 7 jours, 14 jours et 21 jours après la fracture pour évaluer la formation et la progression des callosités. Les schémas de fracture acceptables sont ceux dans lesquels les cortex sont complètement rompus, les fils sont correcte...

Discussion

Alors que le nombre de fractures augmente dans le monde ^9,10,25, les traitements innovants pour les non-unions deviennent de plus en plus urgents. Comme la cicatrisation des fractures implique une somme complexe et étroitement orchestrée d’événements qui se produisent sur une longue échelle de temps³, l’utilisation de modèles animaux valides est essentielle pour améliorer notre compréhension d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol 70º	Merck	109-56-8	Or any general available supplier
Canada balsam (mounting medium)	Merck	C1795	Or any general available supplier
Cefazoline	ABL	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Coverslip	Merck	CSL284525	Or any general available supplier
Dental X-Ray Generator	Focus	-	Sold by Instrumentarium Dental Inc.
DEPC water	Merck	W4502	Or any general available supplier
Dissecting Scissor	ABC Instrumentos	0327	Similar brands of the item may be used according to local availability
EDTA	Vetec	60REAVET014340	Similar brands of the item may be used according to local availability
Eosin solution	Laborclin	EA-65	Similar brands of the item may be used according to local availability
Ethanol P.A	Vetec	60REAVET012053	Similar brands of the item may be used according to local availability
Gauze pads	Cremer	Not applicable	Or any general available supplier
Harris Hematoxylin Solution	Laborclin	620503	Similar brands of the item may be used according to local availability
Heating pad	Tonkey Electrical Technology	E114273	Similar brands of the item may be used according to local availability
Histological slides	Merck	CSL294875X25	Or any general available supplier
Histology cassettes	Merck	H0542-1CS	Or any general available supplier
Hydrochloric acid - 37%	Merck	258148	Similar brands of the item may be used according to local availability
Insulin syringe	BD	324918	Or any general available supplier
Iodopovidone sponge	Rioquímica	372106	Or any general available supplier
Ketamine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Lacribel collyrium	Cristalia	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Microtome	Leica	149AUTO00C1
Mouse Tooth Forceps Tweezer	ABC Instrumentos	0164	Similar brands of the item may be used according to local availability
Needle 26 G	BD	2239	Or any general available supplier
Needle Holder	Golgran	135-18	Similar brands of the item may be used according to local availability
Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1546-NT	Or any general available supplier
Paraffin	Exodo	8002 - 74 - 2	Similar brands of the item may be used according to local availability
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4	Similar brands of the item may be used according to local availability
PBS 1x	Lonza	BE17-516F	Similar brands of the item may be used according to local availability
Resorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1596-45B	Or any general available supplier
Rod Wire SS CrNi 0.016"	Orthometric	56.50.2016
Scalpel nº 11	Descarpak	15782	Or any general available supplier
Serrated Tip Tweezer	Quinelato	QC.404.12	Similar brands of the item may be used according to local availability
Shaver	Phillips	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Surgical tape	3M	2734	Or any general available supplier
Surgical tnt field	Polarfix	6153	Or any general available supplier
Tramadol hydrochloride	Teuto	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Water bath for histology	Leica	HI1210
Xylazine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Xylene	Dinamica	60READIN001105	Similar brands of the item may be used according to local availability